彭 齊，陶 涼，陳曉英，胡大清

華法林是目前臨床最常用的口服抗凝藥物，影響華法林用藥劑量的因素主要有遺傳因素以及身高、體重、年齡、性別、種族、藥物相互作用等。華法林國際藥理學聯(lián)盟(IWPC)的研究顯示，加入藥物基因組學的預測模型(包括基因型)比臨床預測模型(不包括基因型)準確性提高了80%［1］。所以個體的遺傳特征對于華法林的劑量影響很大。目前研究發(fā)現(xiàn)與華法林藥效學和藥動學相關(guān)的基因達30多種，其中起主要作用的有2種，即細胞色素P450酶2C9基因(CYP2C9)和維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體1(VKORC1)。美國食品藥品監(jiān)督局(FDA)在華法林用藥說明書中介紹了CYP2C9和VKORC1基因?qū)┝康挠绊懖⒔ㄗh在用藥之前做基因檢測［2］。本文旨在對不同華法林基因預測模型與華法林劑量的相關(guān)性進行研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2012年3—8月在武漢亞洲心臟病醫(yī)院心臟外科行心臟瓣膜置換術(shù)患者108例。入選標準為:漢族、＞18歲、穩(wěn)定華法林抗凝至少3個月、國際標準化比值(INR)控制在2.0～3.0。排除標準:肝、腎及甲狀腺功能異常;服用阿司匹林、氯吡格雷、肝素及維生素K等影響INR的藥物。所有入選對象均來自湖北省各地區(qū)就診的漢族居民，相互間無血緣關(guān)系及異族通婚史。

1.2 方法

1.2.1 標本采集:收集入選受試者靜脈血(枸櫞酸鈉抗凝)3 ml用于檢測 INR值、CYP2C9以及VKORC1基因型。同時觀察患者華法林穩(wěn)態(tài)劑量及3種基因預測模型的華法林劑量。

1.2.2 基因檢測方法:從血液中提取患者DNA，擴增目的片段，再進行測序反應(yīng)。DNA提取采用TIANGE血液基因組提取試劑盒，測序儀為美國ABI 3500 Genetic Analyzer。

1.3 預測模型 從以下3個模型來分析基因檢測的準確性，一方面采用美國FDA給出的基因型判斷用藥范圍(模型1)，并與出院劑量比較分析;另一方面采用2009年國外發(fā)表的預測模型(模型2)［1］，模型的建立包含了4043個樣本，含1200個亞洲人。同時還比較了Huang等［2］建立的中國人用藥模型(模型3)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，Pearsonχ2檢驗用于檢查基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

2 結(jié)果

2.1 基因型分布 108例患者血樣，來自武漢亞洲心臟病醫(yī)院，取樣時間為2012年3—8月，男50例，女58例。108例中CYP2C9*3雜合突變8例，未發(fā)現(xiàn)CYP2C9*2突變;VKORC1突變105例，其中純合突變95例，雜合突變10例。

2.2 不同基因型華法林穩(wěn)態(tài)劑量比較 108例中CYP2C9基因型檢測有100例為*1/*1型、8例為*1/*3型、未發(fā)現(xiàn)*2突變，華法林穩(wěn)態(tài)劑量分別為(2.68±1.05)、(1.55±0.78)mg/d，*1/*3型較*1/*1型華法林穩(wěn)態(tài)劑量小，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);VKORC1基因型檢測有95例為AA型、10例為雜合子GA型、3例為純合子GG型，華法林穩(wěn)態(tài)劑量分別為(2.46±0.85)、(3.15±1.22)mg/d，AA型較GA型華法林穩(wěn)態(tài)劑量小，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01);VKORC1基因型GG型僅3例，未做組間比較。

2.3 基因檢測顯著提高準確率 根據(jù)基因型判斷的用藥量與實際用藥劑量相關(guān)性更大，準確率更高。同時預測模型3是中國人用藥模型，其相關(guān)性略高于預測模型2，同時美國FDA根據(jù)基因型給出的用藥敏感性與實際用量是吻合的，說明基因型對于判斷用藥量非常有幫助。模型1預測劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量之間的相關(guān)性見圖1;模型2加基因型與不加基因型預測劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量之間的相關(guān)性見圖2、3;模型3預測劑量與穩(wěn)態(tài)劑量之間的相關(guān)性見圖4。

圖1 預測模型1預測劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)性FDA根據(jù)基因型給出的用藥范圍與出院劑量之間的比較，-1表示敏感性高;0表示敏感性一般;1表示敏感性低

圖2 預測模型2不加基因型預測劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)性(R2=6.4%，P=0.0127)

圖3 預測模型2包括基因型預測劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)性(R2=31.3%，P＜0.0001)

圖4 預測模型3預測劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量的相關(guān)性(R2=33.6%，P＜0.0001)

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)在與華法林藥效學和藥動學相關(guān)的基因中起主要作用的有CYP2C9和VKORC1基因。細胞色素氧化酶P450是人類肝臟中由CYP超基因家族編碼的一種重要的藥物代謝酶系統(tǒng)。CYP2C9是CYP2C亞家族中的一種同工酶，約占肝微粒體中CYP總量的20%。CYP2C9基因存在很多多肽位點，其中研究較多的也最常見的是CYP2C9*2和CYP2C9*3。在中國人群中CYP2C9*3變異位點相對更多，主要是第359位的氨基酸由異亮氨酸變成亮氨酸。CYP2C9*2和CYP2C9*3突變基因攜帶者華法林需求量較野生型患者低，且CYP2C9*3攜帶者出血風險較高。VKORC1基因位于16號染色體，含3個外顯子，編碼163個氨基酸的18KDa內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白［3］。此蛋白質(zhì)為組成維生素K環(huán)氧化物還原酶復合體亞單位之一，主導維生素K依賴性凝血因子的生成，是華法林的作用靶點。VKORC1基因啟動子區(qū)-1639G＞A多態(tài)性與華法林臨床用藥劑量相關(guān)，AA型華法林需求量較GA型低。在中國患者中三者的頻率分別是79.7% 、17.6% 和 2.7%［4］。

目前臨床上華法林的給藥方案通常是首先給予一定標準劑量，然后臨床醫(yī)生根據(jù)每個患者INR的情況，調(diào)整劑量直至INR達到靶目標。但是調(diào)整劑量周期較長，且患者發(fā)生血栓或出血的可能性較高［5-6］。因此，國內(nèi)外越來越多的學者開始建立華法林用藥劑量預測模型。這些模型并不能取代INR的監(jiān)控作用，但是能夠極大的提高華法林用藥劑量的準確性［7-9］。華法林IWPC聯(lián)合9個國家的21個研究小組，提供了用華法林治療的超過4000例患者(亞洲人種1200余例)的臨床和遺傳學數(shù)據(jù)，并據(jù)此建立了華法林劑量預測模型，該模型中納入了遺傳因素以及臨床因素。結(jié)果表明，對于需要低劑量(≤21 mg/周)或高劑量(≥49 mg/周)治療的患者，納入遺傳因素的華法林劑量模型預測結(jié)果顯著優(yōu)于臨床預測模型。IWPC發(fā)表的研究顯示，加入藥物基因組學的預測模型(包括基因型)比臨床預測模型(不包括基因型)準確性提高了80%［1］。Gage等［10］基于1015例樣本(混合種族)也建立了劑量預測模型，其中納入了最全面的非遺傳因素。這兩個模型是目前最權(quán)威的華法林劑量預測模型。

IWPC的研究表明，亞洲人IWPC預測模型效果雖然比臨床預測模型優(yōu)越，但較白種人差。在這些模型中，目標INR設(shè)定為2.0～3.0，而實際上中國人目標INR有所不同，且中國人與華法林劑量相關(guān)的基因突變頻率與高加索人差異較大［11］。因此，很多學者開始建立針對中國人的華法林劑量預測模型。從中可以看出，遺傳因素的納入使得模型對華法林劑量個體差異的解釋達到了74.3%。值得一提的是，與針對高加索人的華法林劑量預測模型不同的是，華人劑量預測模型納入的大都是CYP2C9*3，而不是CYP2C9*2，這是因為CYP2C9*2在中國人群中的分布頻率極低。

綜上所述，導致華法林用藥劑量個體差異分遺傳因素和非遺傳因素，其中遺傳因素占主要地位。近年來，隨著研究的深入，針對中國人華法林劑量構(gòu)建的預測模型已越來越多，且納入了遺傳因素，可解釋40% ～74%的個體劑量差異［12-14］。本研究表明，預測模型3預測劑量與華法林穩(wěn)態(tài)劑量相關(guān)性略高于預測模型2，可見根據(jù)中國人數(shù)據(jù)建立的模型更適合中國人。但是，目前基于中國人群構(gòu)建的劑量預測模型存在樣本量較小、納入的影響因素少以及缺少外部驗證等弊端。因此，我們需要更大樣本量的研究，對已構(gòu)建的模型進行驗證或是構(gòu)建新模型。我們也需要納入更多的遺傳和非遺傳因素，以期提高對華法林劑量個體差異的解釋百分比。此外，目前構(gòu)建的模型多為穩(wěn)態(tài)劑量預測模型，而對起始劑量預測模型和穩(wěn)態(tài)劑量的精確模型研究較少［15-17］。因此，在以穩(wěn)態(tài)劑量預測模型為基礎(chǔ)的前提下，進一步豐富起始劑量模型和穩(wěn)態(tài)劑量的精確模型的構(gòu)建，以期更好地應(yīng)用于臨床。

模型1:

模型2:

Square root of weekly warfarin dose=5.6044-0.2614×Age in decades+0.0087×Height in cm+0.0128×Weight in kg-0.8677×VKORC1^A/G-1.6974×VKORC1 A/A-0.4854×VKORC1 genotype unknown-0.5211×CYP2C9*1/*2-0.9357×CYP2C9*1/*3-1.0616×CYP2C9*2/*2-1.9206×CYP2C9*2/*3-2.3312×CYP2C9*3/*3-0.2188×CYP2C9 genotype unknown-0.1092×Asian race-0.2760×Black or African American-0.1032×Missing or Mixed race+1.1816×Enzyme inducer status-0.5503×Amiodarone status

Legend for use of algorithms:

· Age in decades=1 for 10-19，2 for 20-29，etc…

· VKORC1 G/A=1 if heterozygous for rs 9923231，otherwise zero

· VKORC1 A/A=1 if homozygous for A at rs 9923231，otherwise zero

· VKORC1 genotype unknow n=1 if rs 9923231 genotype missing or unknown，otherwise zero

· CYP2C9*1/*2=1 if CYP2C9 genotype is*1/*2，otherwise zero

· CYP2C9*1/*3=1 if CYP2C9 genotype is*1/*3，otherwise zero

· CYP2C9*2/*2=1 if homozygous for CYP2C9*2 allele，otherwise zero

· CYP2C9*2/*3=1 if CYP2C9 genotype is*2/*3，otherwise zero

· CYP2C9*3/*3=1 if homozygous for CYP2C9*3 allele，otherwise zero

· CYP2C9 genotype unknow n=1 if CYP2C9 genotype unknown，otherwise zero

· Asian Race=1 if self-reported race is Asian，otherwise zero

· Black/African America n=1 if self-reported race is Black or African American，otherwise zero

· Missing or Mixed race=1 if self-reported race is unspecified or mixed，otherwise zero

· Enzyme inducer status=1 if patient taking carbamazepine，phenytoin，rifampin，or rifampicin，otherwise zero

· Amiodarone status=1 if patient taking amiodarone，otherwise zero

模型3:

predicted warfarin dose(mg/day)=exp(0.727-0.007×age+0.384×BSA+0.403×VKORC1 6484 TC+0.554×VKORC1 6484 CC-0.482×CYP2C9*1/*3-1.583×CYP2C9*3/*3).Age is given in years，BSA calculated from height and weight is given in square meters，and VKORC1 6484 TC，VKORC1 6484 CC，CYP2C9*1/*3，and CYP2C9*3/*3 are coded as 1 if present and 0 if absent.

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