白 雪，盛英杰(綜述)，戢新平(審校)

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1急診科， 2第二呼吸內(nèi)科,沈陽 110004)

百草枯(Paraquat，PQ)又名對(duì)草快，其20%的溶液稱克無蹤，化學(xué)名為1，1′-二甲基-4，4′-聯(lián)吡啶陽離子鹽，分子式C12H14N2Cl2，是一種有機(jī)雜環(huán)類觸殺、滅生型高毒性除草劑。百草枯接觸土壤后迅速失活，對(duì)環(huán)境無污染，其應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)已有100多年的歷史。人類誤服百草枯后，無特效解毒劑，中毒死亡率極高，其主要臨床癥狀早期為多臟器功能衰竭，后期不可逆性肺纖維化。

百草枯具有與二胺、多胺及二胺二硫胱胺類似的結(jié)構(gòu)，因而可與胺類物質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞膜上能量依賴性多胺攝取受體，進(jìn)而被細(xì)胞攝取。這種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要存在于肺泡Ⅰ、Ⅱ型上皮細(xì)胞及Clara細(xì)胞中[1-2]，巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及核間質(zhì)細(xì)胞無此系統(tǒng)[3]。百草枯的選擇性聚集導(dǎo)致肺內(nèi)濃度是血液濃度的10～90倍[4]。

1 百草枯對(duì)肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響

研究發(fā)現(xiàn)，百草枯最先損傷肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞，后導(dǎo)致肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞水腫變性、肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，血管通透性增加[5]。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn),百草枯可誘導(dǎo)大鼠肺泡上皮細(xì)胞凋亡，而姜文等[7]發(fā)現(xiàn)百草枯可誘導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，提示細(xì)胞凋亡參與百草枯誘導(dǎo)的急性肺損傷。

百草枯誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞和肺血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可能與下列因素有關(guān)：①氧化損傷。百草枯二價(jià)陽離子(PQ2+)+還原性輔酶Ⅱ→PQ++輔酶Ⅱ，PQ+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，PQ++分子氧→PQ2++超氧陰離子(O2-)，O2-在超氧化物歧化酶的作用下，形成過氧化氫(H2O2)，H2O2在Fe2+催化的Fenton型Haber-Weiss反應(yīng)中形成毒性更強(qiáng)的自由基，如羥自由基(OH-)[8],上述反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基(如O2-、H2O2、OH-等)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。②鈣穩(wěn)態(tài)失衡。曹鈺等[9]向小鼠腹腔內(nèi)注射百草枯，觀察不同時(shí)間點(diǎn)肺組織細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化及肺損傷程度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與陰性組相比，肺組織細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的濃度顯著升高，以第2～4日明顯。百草枯中毒時(shí)，可出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)及線粒體內(nèi)鈣超載，隨后發(fā)生的一系列凋亡改變，參與了肺組織細(xì)胞凋亡機(jī)制的形成[10]。③線粒體損傷。線粒體是細(xì)胞的“發(fā)電廠”，它參與了三羧酸循環(huán)和呼吸鏈的傳遞。線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定是細(xì)胞維持正常生理功能的前提，線粒體內(nèi)、外膜之間的通透性轉(zhuǎn)換孔(permeability transition pore,PTP)具有調(diào)節(jié)線粒體膜通透性的作用。PTP屬于Ca2+依賴性電壓感受器，正常情況下，絕大多數(shù)PTP處于關(guān)閉狀態(tài)。Costantini等[11]發(fā)現(xiàn)，百草枯可使PTP電壓感受器上的二硫基化合物氧化，誘導(dǎo)PTP大量開放，同時(shí)百草枯誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體膜電位下降，PTP進(jìn)一步開放，線粒體通透性增大，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。

1.1死亡受體活化途徑 孔慶福等[12]、胡軍利等[13]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒大鼠肺泡巨噬細(xì)胞早期產(chǎn)生大量腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，TNF-α通過與細(xì)胞膜上的腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor,TNFR)結(jié)合，一方面活化胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白，激活下游反應(yīng)，觸發(fā)細(xì)胞凋亡；另一方面激活核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB),NF-κB是一類具有多向性轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的蛋白因子，正常情況下NF-κB位于細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，與核轉(zhuǎn)錄因子抑制蛋白(inhibitors of kappa B，IκB)結(jié)合，使NF-κB處于無活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞因子(如TNF-α)、氧自由基刺激后，NF-κB與IκB解離，NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)下游靶蛋白(包括TNF-α、白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8等)合成，TNF-α合成后反過來進(jìn)一步激活NF-κB，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致組織細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷[14-15]。

1.2線粒體途徑 Takeyama等[16]將表達(dá)野生型p53的人肺上皮樣細(xì)胞系L132與缺乏p53基因的人早幼粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞系U937分別暴露于低濃度的百草枯培養(yǎng)液中培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)L132細(xì)胞系中p53大量表達(dá)，處于S期的細(xì)胞百分比明顯減少，說明細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期受阻；單細(xì)胞凝膠電泳顯示單鏈DNA斷裂；U937細(xì)胞系中DNA雖然受損，但處于S期的細(xì)胞百分比幾乎無明顯變化，顯示出對(duì)百草枯的抵抗力。該實(shí)驗(yàn)說明百草枯可能通過p53蛋白的積累誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Dinis-Oliveira等[17]研究表明，百草枯通過激活多條通路誘導(dǎo)肺組織的細(xì)胞凋亡，其中p53、轉(zhuǎn)錄激活蛋白呈時(shí)間依賴性表達(dá)，參與細(xì)胞凋亡調(diào)控。Yang等[18]將多巴胺能SY5Y細(xì)胞經(jīng)百草枯處理48 h后，測(cè)定p53的表達(dá)及線粒體內(nèi)凋亡途徑標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)，百草枯通過p53參與線粒體內(nèi)途徑誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SY5Y細(xì)胞凋亡。

Bcl-2蛋白家族成員與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切，包括抗凋亡Bcl-2亞族和促凋亡Bax亞族、BH3亞族等。細(xì)胞是否發(fā)生凋亡及其嚴(yán)重程度取決于Bcl-2/Bax比值的變化，馬玉騰等[19]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯中毒大鼠肺組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá)均增高，但Bcl-2增高幅度低于Bax，導(dǎo)致Bcl-2/Bax比值下降，肺組織細(xì)胞凋亡增加。Fei等[20]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯刺激Bcl-2同源拮抗劑(Bcl-2 homologous antagonist/killer，Bak)、BH3結(jié)構(gòu)域凋亡誘導(dǎo)蛋白(BH3 interacting domain protein 3，Bid)、促凋亡調(diào)節(jié)蛋白BNIP3(Bcl2/adenovirus E1B 19kDa protein interacting protein 3)及Noxa蛋白呈高濃度表達(dá)，Bak、BNIP3及Noxa基因沉默可以保護(hù)細(xì)胞免受百草枯的毒性，該實(shí)驗(yàn)證實(shí)Bcl-2蛋白家族成員參與百草枯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

百草枯可造成線粒體膜電位下降，PTP大量開放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡啟動(dòng)因子(如細(xì)胞色素C、凋亡酶激活因子、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子)從線粒體內(nèi)釋放，激活半胱氨酸蛋白酶家族中的胱天蛋白酶(caspase)9和caspase-3，caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵酶，caspase-3的激活可以看作是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[21]。Caspase-3激活后誘導(dǎo)蛋白質(zhì)水解，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[17]。Rincheval等[22]還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用Bcl-2和caspase抑制劑并不能抑制百草枯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，推斷百草枯可能還通過其他途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。張志堅(jiān)等[23]通過對(duì)百草枯中毒大鼠腎組織中caspase-3表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，百草枯染毒組中caspase-3蛋白的表達(dá)隨時(shí)間推移逐漸增多，推測(cè)百草枯中毒后腎臟損傷與細(xì)胞凋亡有一定的關(guān)系。González-Polo等[24]將小腦顆粒細(xì)胞置于低濃度百草枯中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)線粒體上細(xì)胞色素C水平顯著減少，而水解蛋白酶和caspase-3活性增加，DNA裂解片段增加，細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。

與此同時(shí)，Mohammadi-Bardbori等[25]發(fā)現(xiàn)百草枯的氧化還原反應(yīng)還可以導(dǎo)致線粒體內(nèi)膜上的脂質(zhì)發(fā)生過氧化，間接引起細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

1.3內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑 死亡受體活化以及線粒體損傷途徑是細(xì)胞內(nèi)兩條經(jīng)典的凋亡途徑，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡途徑是近10年來新發(fā)現(xiàn)的凋亡通路。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡有其獨(dú)特的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的分子伴侶和感受蛋白具有特異性。

Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，百草枯處理24 h后的大鼠肺泡上皮細(xì)胞系L2中，細(xì)胞生存能力顯著下降，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號(hào)因子和蛋白(如糖調(diào)節(jié)蛋白78、生長(zhǎng)停滯及DNA損傷基因)表達(dá)水平顯著增高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑參與了百草枯誘導(dǎo)的肺組織細(xì)胞凋亡。該研究同樣證實(shí)百草枯提高了caspase-3及caspase-7的活性，促進(jìn)了Bax、Bak、p53蛋白表達(dá)，抑制了Bcl-2的基因表達(dá)。

綜上所述，百草枯可通過死亡受體活化途徑、線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)肺組織細(xì)胞凋亡。

2 百草枯對(duì)多型核中性粒細(xì)胞的影響

百草枯對(duì)多型核中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophils，PMN)是機(jī)體抵御外來病原體的第一道屏障，當(dāng)發(fā)生輕微炎性反應(yīng)時(shí)，外周血中的PMN黏附于血管壁并游出至炎癥部位，完成吞噬、殺菌作用后即發(fā)生凋亡，不引起組織細(xì)胞損傷。大量研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肺組織炎性因子大量釋放、Ca2+濃度升高時(shí)，PMN凋亡受到抑制，凋亡延遲，導(dǎo)致PMN處于持續(xù)激活狀態(tài)，從而釋放大量毒性物質(zhì)，造成組織細(xì)胞損傷[26-27]。

劉建輝等[28]在大鼠腹腔注射百草枯，建立急性肺損傷動(dòng)物模型，檢測(cè)肺泡灌洗液中PMN凋亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMN的凋亡率顯著下降，染毒第3日凋亡率最低；應(yīng)用NF-κB抑制劑(二硫代氨基甲酸吡咯烷)可促進(jìn)PMN凋亡，推測(cè)百草枯通過多條通路誘導(dǎo)NF-κB激活，從而抑制PMN的凋亡，延長(zhǎng)PMN的生存時(shí)間。除此之外，有學(xué)者還認(rèn)為PMN的凋亡延遲可能與caspase-3和caspase-9的活性降低及線粒體膜電位持續(xù)降低有關(guān)[29]。

3 百草枯對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的影響

百草枯對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性呈時(shí)間依賴性，百草枯中毒早期肺泡內(nèi)大量炎性細(xì)胞聚集，以肺泡巨噬細(xì)胞為主。肺泡巨噬細(xì)胞合成并釋放大量細(xì)胞因子、前炎性介質(zhì)、趨化因子以及蛋白水解酶毒性物質(zhì)，造成急性肺損傷、間質(zhì)水腫、肺泡內(nèi)出血，而后肺泡巨噬細(xì)胞自身凋亡增加，吞噬能力下降，導(dǎo)致凋亡的中性粒細(xì)胞不能及時(shí)被清除，產(chǎn)生遲發(fā)性壞死，加重炎性反應(yīng)的發(fā)生[30]。

4 小 結(jié)

大量研究顯示細(xì)胞凋亡參與了百草枯所致的急性肺損傷的發(fā)生過程，由于肺泡上皮細(xì)胞和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加，一方面導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞大量丟失，基膜受損，肺泡表面活性物質(zhì)減少，肺泡塌陷，肺泡上皮表面的離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)遭到破壞，肺泡間隙水電解質(zhì)紊亂，微血管通透性增高，引起肺水腫發(fā)生；另一方面，有學(xué)者認(rèn)為正是由于肺泡上皮細(xì)胞和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞缺失，導(dǎo)致肺間質(zhì)成纖維細(xì)胞代償性增生，發(fā)生過度纖維增殖修復(fù)反應(yīng)，從而造成不可逆的肺纖維化形成。同時(shí)，PMN聚集和凋亡延遲進(jìn)一步加重了肺組織及細(xì)胞的損傷。

因此，靶向抑制肺泡上皮細(xì)胞及肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)PMN凋亡可能減輕急性肺損傷，甚至阻止肺纖維化的發(fā)生。

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