馬立峰，孟 海(綜述)，郭 艾(審校)

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院骨科，北京 100050)

Na+,K+-ATP酶即鈉泵，是一種廣泛存在于高等生物真核細(xì)胞膜上的膜結(jié)合蛋白。它利用水解1個分子ATP釋放的能量將3個鈉離子泵出細(xì)胞外，同時將2個鉀離子泵入細(xì)胞內(nèi)。在正常生理過程中，它在維持真核細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡、細(xì)胞膜電位以及神經(jīng)沖動產(chǎn)生等方面發(fā)揮著重要作用[1]。近十余年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)這種膜結(jié)合蛋白不但具有離子泵的功能，而且還具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能[2]。

1 Na+,K+-ATP酶的結(jié)構(gòu)

Na+,K+-ATP酶主要是由α、β亞基組成的二聚體[3]。近年來發(fā)現(xiàn)了γ亞基的存在，每個亞基具有多個亞型并且發(fā)揮著不同的生理作用[4]。

1.1α亞基 α亞基是催化亞基，相對分子質(zhì)量為110 ×103[5]。目前發(fā)現(xiàn)它具有α1、α2、α3和α4四個亞型[6]。α亞基在組織中特異性表達(dá)，α1亞型占據(jù)主導(dǎo)地位，幾乎在高等動物所有細(xì)胞都有表達(dá)；α2亞型主要表達(dá)于骨骼、心臟細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞；α3亞型主要表達(dá)于神經(jīng)細(xì)胞和心臟組織細(xì)胞；α4亞型僅僅表達(dá)于睪丸組織細(xì)胞，與精子的活性相關(guān)[7-8]。

1.2β亞基 β亞基是一個調(diào)節(jié)亞基,相對分子質(zhì)量約為60×103，具有3個亞型：β1亞基普遍存在；β2亞基存在于腦組織、軟骨細(xì)胞、表皮細(xì)胞和心臟組織細(xì)胞；β3亞基存在于腦組織、軟骨細(xì)胞、表皮細(xì)胞以及肺臟的組織細(xì)胞。

β亞基的主要功能是協(xié)助新合成的α亞基正確折疊，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運到質(zhì)膜，然后在質(zhì)膜上穩(wěn)定α亞基的蛋白構(gòu)型以及調(diào)節(jié)α亞基的活性[9]。β亞基可以通過多個位點影響α亞基的活性，近年來研究發(fā)現(xiàn)β亞基對α亞基的調(diào)節(jié)作用具有兩面性，不僅能夠穩(wěn)定α亞基的蛋白構(gòu)型，而且還能夠發(fā)揮抑制α亞基以及Na+,K+-ATP酶活性的作用[10]。

1.3γ亞基 γ亞基也是調(diào)節(jié)亞基，其相對分子質(zhì)量約為60×103。該亞基屬于苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸蛋白家族，這一家族具有保守的氨基酸序列，即苯丙氨酸-X-酪氨酸-天冬氨酸[11]。與β亞基不同，γ亞基不能單獨作用于α亞基或β亞基，只能對已結(jié)合的αβ二聚體發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。它可以通過其氨基酸序列的C末端作用于Na+,K+-ATP酶，增加Na+,K+-ATP酶對ATP的親和力使ATP的水解加速。γ亞基還可以使Na+,K+-ATP酶對鉀離子的親和力增加，降低對鈉離子的親和力，增加離子轉(zhuǎn)運的效率。

2 Na+,K+-ATP酶的配體

Na+,K+-ATP酶最主要的配體是強心甾類固醇(cardiotonic steroids,CTS)。Na+,K+-ATP酶和其他P類-ATP酶主要的區(qū)別是Na+,K+-ATP酶可以與CTS結(jié)合。CTS主要包括兩大類：一類是植物來源的洋地黃類藥物，如地高辛和哇巴因；另一類是脊椎動物來源的糖苷類藥物，如蟾素和海蟾蜍素[7]。CTS與Na+,K+-ATP酶相結(jié)合后影響了鈉離子和鉀離子的轉(zhuǎn)運，造成細(xì)胞內(nèi)鈉濃度升高，細(xì)胞內(nèi)的鈉離子和細(xì)胞外的鈣離子進(jìn)行交換，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，肌質(zhì)網(wǎng)攝取鈣離子增多，進(jìn)而可以治療心房顫動、充血性心力衰竭等疾病。在人體內(nèi)，腎上腺和下丘腦能夠分泌內(nèi)源性的哇巴因和海蟾蜍素。作為內(nèi)源性激素，CTS的分泌和產(chǎn)生受到血管緊張素Ⅱ和腎上腺素等激素的調(diào)節(jié)[12]。當(dāng)機體在應(yīng)激、缺氧和妊娠等情況時，內(nèi)源性洋地黃物質(zhì)產(chǎn)生和分泌增加，部分抑制Na+,K+-ATP酶的活性。體外實驗表明，在一些病理和生理情況下，低濃度的CTS雖然不會抑制Na+,K+-ATP酶離子轉(zhuǎn)運功能，但是可以引起細(xì)胞增殖和肥大，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，說明CTS與Na+,K+-ATP酶結(jié)合后可以觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級聯(lián)反應(yīng)[7]。

細(xì)胞內(nèi)鉀離子和細(xì)胞外鈉離子濃度的改變也可以引起Na+,K+-ATP酶構(gòu)象的改變，進(jìn)而引起膜電位變化和其他相關(guān)離子通道活動的變化，同時間接地誘發(fā)CTS介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此鉀離子和鈉離子也可以被視為Na+,K+-ATP酶的另一類配體[13]。此外，活性氧類(reactive oxygen species,ROS)也可以引起Na+,K+-ATP酶結(jié)構(gòu)的變化，ROS可以觸發(fā)Na+,K+-ATP酶參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)，最終通過該轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促使線粒體產(chǎn)生更多的ROS。因此，ROS也可以視為Na+,K+-ATP酶的配體[14]。

3 Na+,K+-ATP酶信號微結(jié)構(gòu)域

Na+,K+-ATP酶信號微結(jié)構(gòu)域是位于細(xì)胞膜表面的特異性凹陷結(jié)構(gòu)——膜穴，大多Na+,K+-ATP酶集中于該結(jié)構(gòu)，可以使信號蛋白間作用區(qū)域化[15]。實驗研究證明，使用微RNA(microRNA,miRNA)技術(shù)干擾小窩蛋白的表達(dá)或者去除膜穴中的膽固醇可以破壞膜穴的結(jié)構(gòu)，使哇巴因觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被阻斷[16]。

小窩蛋白是膜穴的主要結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)成分，其N端氨基酸序列在細(xì)胞膜內(nèi)表面形成腳手架樣的功能區(qū)錨定多種信號分子[16]，這些信號因子包括異三聚體G蛋白、G蛋白偶聯(lián)受體、酪氨酸蛋白激酶受體、蛋白激酶C、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶Src家族成員、有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-actived protein kinase,MAPK)途徑組分、肌醇1,4,5-三磷酸受體、內(nèi)皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)等。這些信號分子通過小窩蛋白結(jié)合序列與小窩蛋白的腳手架結(jié)構(gòu)域相連接[17]。

4 Na+,K+-ATP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

4.1Na+,K+-ATP酶/Src復(fù)合體 Src家族激酶是膜相關(guān)的非受體酪氨酸蛋白激酶。迄今Src家族至少有10個成員并且被分為兩組：一組是廣泛表達(dá)的酪氨酸蛋白激酶，如Src、Fyn和Yes；另一組表達(dá)于造血細(xì)胞中，如Fgr、Lyn、Hck、Lck、Blk、Lyn和Yrk[7]。Src主要包含Src同源結(jié)構(gòu)域2(Src homology 2,SH2)、同源結(jié)構(gòu)域3(Src homology 3,SH3)和激酶結(jié)構(gòu)域三個重要蛋白作用位點。

在不同類型的細(xì)胞膜穴結(jié)構(gòu)中存在著豐富的Na+,K+-ATP酶和Src表達(dá)，體外實驗使用CTS分析Na+,K+-ATP酶和Src的結(jié)合位點，結(jié)果表明Na+,K+-ATP酶的α1亞基與Src相結(jié)合，它們之間至少是兩個位點的結(jié)合，即α1亞基的第二胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(second cytosolic domain，CD2)和第三胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(third cytosolic domain，CD3)(CD2和CD3分別位于的α1亞基A結(jié)構(gòu)域和N結(jié)構(gòu)域)分別與Src的SH2和SH3結(jié)合[18]。在Na+,K+-ATP酶和Src結(jié)合的復(fù)合物中Na+,K+-ATP酶與哇巴因結(jié)合后Src的激酶結(jié)構(gòu)域就會被釋放，Src得以活化，進(jìn)而激活下游信號級聯(lián)反應(yīng)。在這個過程中，可以把Na+,K+-ATP酶/Src復(fù)合物看作一種“二元”受體，受到CTS作用后間接地影響下游蛋白的磷酸化過程，觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)反應(yīng)。如果將PY-17細(xì)胞氨基酸序列上第420和425位點上的精氨酸突變?yōu)楦彼幔琋a+,K+-ATP酶離子泵功能雖然不受影響，但是CTS觸發(fā)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被阻斷[19]。Li等[20-21]根據(jù)人Na+,K+-ATP酶的α1亞基N結(jié)構(gòu)域氨基酸序列，合成了大約含有20個氨基酸的多肽，即pNaKtide，該短肽可以競爭地與Src結(jié)合，Na+,K+-ATP酶的α1亞基就不能與Src組成復(fù)合體，Src不能被磷酸化，阻斷了CTS觸發(fā)的信號級聯(lián)反應(yīng)。

Na+,K+-ATP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能和其構(gòu)象相關(guān)。Na+,K+-ATP酶在離子轉(zhuǎn)運過程中經(jīng)歷了E1和E2兩種構(gòu)象的轉(zhuǎn)化，E1狀態(tài)對鈉離子和ATP有較強的親和力，釋放鈉離子后Na+,K+-ATP酶處于E2狀態(tài)，易與細(xì)胞外的兩個鉀離子相結(jié)合。在E1狀態(tài)時α1亞基的CD2和CD3可以同時與Src的SH2、激酶結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，使Src處于失活狀態(tài)[21]，此時兩者結(jié)合后相互作用形成了CTS功能性結(jié)合復(fù)合物。在離子轉(zhuǎn)運過程的周期中Na+,K+-ATP酶由E1狀態(tài)轉(zhuǎn)化為E2狀態(tài)時，Na+,K+-ATP酶釋放耦聯(lián)的Src[22]。

4.2Src轉(zhuǎn)活EGFR觸發(fā)的MAPK信號級聯(lián)反應(yīng) EGFR是細(xì)胞因子、G蛋白偶聯(lián)受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵成員，在膜穴中發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，也具有小窩蛋白結(jié)合序列。Haas等[23]觀察到被哇巴因活化的Src可以與EGFR胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，EGFR第1172位的酪氨酸發(fā)生磷酸化，并激活p42/44 MAPK。Src可以轉(zhuǎn)活ERFG，募集SH2包含蛋白、生長因子受體結(jié)合蛋白2以及Ras等調(diào)節(jié)蛋白至質(zhì)膜，活化Ras/Raf/分裂原激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶的激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶級聯(lián)反應(yīng)。Haas等[23]分別使用非特異性酪氨酸激酶抑制劑Herbinycin A和Src激酶抑制劑PP2處理大鼠血管平滑肌A7r5細(xì)胞系和等位缺失Src家族基因的SYF細(xì)胞系，結(jié)果顯示：哇巴因不能誘導(dǎo)上述信號蛋白活化；相反，在轉(zhuǎn)染c-Src的SYF細(xì)胞系，哇巴因可以劑量依賴性地激活EGFR和p42/44 MAPK。實驗結(jié)果表明，Src對EGFR的轉(zhuǎn)活，參與了Na+,K+-ATP酶轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞外哇巴因的信號至細(xì)胞內(nèi)p42/44MAPK的級聯(lián)反應(yīng)。Tian等[18]使用哇巴因作用于豬腎小管上皮LLC-PK1細(xì)胞系上Na+,K+-ATP酶，激活了Src激酶與EGFR耦聯(lián)，繼而引起瞬時和隨后持續(xù)的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2激活，最終影響核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄。

4.3磷脂酶C-γ和蛋白激酶C 哇巴因可以通過磷酸化磷脂酶C-γ(phospholipase C-γ,PLC-γ)第783位的酪氨酸激活PLC-γ，激活的PLC-γ以一種Src依賴的方式增強對磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸進(jìn)行水解，產(chǎn)生1,4,5-三磷酸肌醇(inositol 1,4,5-triphosphate,IP3)和二酯酰甘油[24]。同時，哇巴因還可以促進(jìn)IP3受體酪氨酸的磷酸化，從而激活I(lǐng)P3受體，IP3受體對IP3的敏感性增強。此外，如上所述Na+,K+-ATP酶還發(fā)揮腳手架功能，通過不同的結(jié)構(gòu)域分別與PLC-γ和IP3受體連接使其成為信號復(fù)合體。該信號復(fù)合體有利于PLC-γ催化產(chǎn)生的IP3和IP3受體相互作用，產(chǎn)生相應(yīng)的生物效應(yīng)。

4.4ROS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子 Na+,K+-ATP酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中Src轉(zhuǎn)活EGFR，進(jìn)而活化Ras后還可以使線粒體產(chǎn)生ROS增多，ROS又可以引起Na+,K+-ATP酶的結(jié)構(gòu)改變，從而放大Na+,K+-ATP酶的信號[25-26]。

細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子在Na+,K+-ATP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要的作用。Na+,K+-ATP酶介導(dǎo)的MAPK信號途徑中可激活L型Ca2+通道蛋白磷酸化，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高，后者通過Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶作用于分裂原激活胞外信號調(diào)節(jié)激酶的激酶，促進(jìn)MAPK通路的活化，產(chǎn)生信號擴大作用。

5 Na+,K+-ATP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對細(xì)胞生長的影響

5.1Na+,K+-ATP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞增殖 有研究將使用哇巴因作用于原代培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞，結(jié)果表明CTS可以觸發(fā)Na+,K+-ATP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)造成心肌細(xì)胞增殖，最終導(dǎo)致心肌肥大[2]。Na+,K+-ATP酶介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)不但可以引起與細(xì)胞生長有關(guān)的早期反應(yīng)基因c-fos和c-jun的轉(zhuǎn)錄，還可以引起與心肌細(xì)胞肥大有關(guān)的晚期反應(yīng)基因(骨骼肌肌動蛋白1、心房肽、肌球蛋白輕鏈2和轉(zhuǎn)化生長因子β)的表達(dá)增加。Tian等[25]分別使用10 nmol/L和50 nmol/L濃度的哇巴因作用于豬腎小管上皮細(xì)胞LLC-PK1細(xì)胞系24 h，結(jié)果表明CTS可以刺激LLC-PK1細(xì)胞顯著增殖。

5.2Na+,K+-ATP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞凋亡 近年來，許多研究表明Na+,K+-ATP酶α亞基可能是一個新的抗腫瘤靶點。Kometiani等[26]使用10 nmol/L和50 nmol/L濃度的哇巴因處理缺少雌激素受體的乳腺癌MDA-MB-435s細(xì)胞系96 h，結(jié)果顯示CTS可以引起乳腺癌細(xì)胞凋亡，CTS與其受體Na+,K+-ATP酶相互作用繼而觸發(fā)了細(xì)胞調(diào)控蛋白p21Cip1的活化。Makihira等[27]使用CTS處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株，結(jié)果癌細(xì)胞增殖和遷移明顯受損，結(jié)果表明Na+,K+-ATP酶α1亞基下調(diào)可以誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。Tian等[25]使用CTS分別作用于乳腺癌細(xì)胞系BT20和前列腺癌細(xì)胞DU145導(dǎo)致兩種細(xì)胞的凋亡，并且檢測細(xì)胞調(diào)控蛋白p21Cip1被活化。Yin等[28]使用蟾素作用于骨肉瘤細(xì)胞U-2OS細(xì)胞系，引起細(xì)胞凋亡，檢測到CTS與其受體Na+,K+-ATP酶結(jié)合后觸發(fā)細(xì)胞調(diào)控蛋白p21Cip1、p53和Bax的上調(diào)。

5.3Na+,K+-ATP酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞融合 破骨細(xì)胞的前體來源于造血干細(xì)胞，一部分造血干細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控下分化為前破骨細(xì)胞，前破骨細(xì)胞在核因子κB受體活化子配體的誘導(dǎo)下融合為多核的破骨細(xì)胞，最后分化為成熟的破骨細(xì)胞。Makihira等[27]使用哇巴因作用于大鼠前破骨細(xì)胞，結(jié)果表明即使在核因子κB受體活化子配體的誘導(dǎo)下前破骨細(xì)胞也不能融合為破骨細(xì)胞，但是由Na+,K+-ATP酶觸發(fā)了哪條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍不清楚。

6 小 結(jié)

Na+,K+-ATP酶不但具有離子泵功能，而且具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。CTS通過調(diào)節(jié)Na+,K+-ATP酶的表達(dá)進(jìn)而影響不同細(xì)胞的生長、增殖和凋亡，已有研究證明哇巴因等藥物可以用以治療前列腺癌、乳腺癌、骨肉瘤以及心肌細(xì)胞肥大，為心血管疾病、惡性腫瘤等疾病的治療提供了新方法。近年來，一些初步的實驗結(jié)果通過藥物干預(yù)Na+,K+-ATP酶的表達(dá)或許可以治療骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎、Paget病等代謝性骨病和退行性骨關(guān)節(jié)疾病，為這些疾病的治療提供了新思路[29]。但是，目前對Na+,K+-ATP酶參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制的認(rèn)識仍然是粗淺的，更復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制還有待于進(jìn)一步研究。

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