王 博(綜述)，哈小琴(審校)

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院檢驗科，蘭州 730050)

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSC) 因其移植后免疫耐受性以及向炎癥、損傷組織、腫瘤部位歸巢的趨化特性，成為一種理想的組織工程種子細胞和基因工程載體，在缺陷性疾病、退行性疾病、遺傳性疾病以及多種組織創(chuàng)傷修復的治療中均具有廣闊的應(yīng)用前景。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)具有廣泛的組織修復功能，而低氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor,HIF-1)在缺氧缺血狀態(tài)下也具有保護作用。該文就HGF和HIF-1的生物活性及修飾MSC的研究現(xiàn)狀及前景進行綜述。

1 MSC的生物學特點

MSC源于中胚層，但存在于全身各結(jié)締組織與器官的間質(zhì)中，具有跨胚層分化潛能的成體干細胞，在骨髓中含量最豐富，MSC起支持和誘導造血干細胞分化的作用。雖然不同組織來源的MSC具有相似的生物學特點和表型，但是它們的分化潛能以及對來源組織的基因表達的影響方式有所不同。MSC具有以下幾個生物學特點。

1.1多向分化潛能 MSC不但可分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、肌肉細胞等同胚層細胞，而且還可跨胚層分化為外胚層的神經(jīng)元細胞、神經(jīng)膠質(zhì)細胞與內(nèi)胚層的肝細胞、內(nèi)皮細胞。MSC的多向分化潛能是其治療學效應(yīng)的基礎(chǔ)。總的來說，有兩種方法可用于調(diào)控MSC的分化[1]：一種為基因工程技術(shù)，通過過表達種系特異性轉(zhuǎn)錄因子來誘導種系特異性的MSC分化。另一種方法是通過“微環(huán)境”調(diào)控，因為MSC種系特異性的分化有賴于細胞接收到的微環(huán)境信號。在該途徑中，可往MSC培養(yǎng)液中加入各種不同的生長因子、激素、細胞外基質(zhì)成分等混合培養(yǎng)來誘導其分化。

1.2組成成分的生化不均一性 MSC各成分存在的生化不均一性反映了骨髓中基質(zhì)系統(tǒng)的復雜性和他們調(diào)節(jié)組織內(nèi)環(huán)境的多種不同功能，同時，這種異質(zhì)性也顯著影響了MSC在體內(nèi)的效力。體外擴增MSC成分的不同方法可顯著影響其最終的總成分構(gòu)成，所以不同實驗室得出的結(jié)果各不相同。其次，由于亞細胞成分各異，利用純化細胞治療特異性疾病存在一定的瓶頸，因此對純化方法的研究和更新，是目前干細胞治療應(yīng)用中亟待解決的問題[2]。

1.3表面抗原的非專一性/免疫表型 用流式細胞儀檢測[3]，MSC表面表達CD29、CD73、CD90、CD105、CD106、白細胞介素6、白細胞介素7和白細胞介素8等；MSC的免疫表型為主要組織相容性抗原(major histocompatibility complex,MHC)-Ⅰ(+)、MHC-Ⅱ(-)、CD40-、CD80-和CD86-。

1.4移植后免疫耐受性 MSC具有雙峰性的免疫特性，既可發(fā)揮免疫抑制作用，也可發(fā)揮免疫增強作用。通過MSC介導的免疫抑制作用可治療某些自身免疫性疾病，免疫刺激作用則可限制腫瘤的擴散。MSC的免疫表型為MHC-Ⅰ(+)，MHC-Ⅱ(-)，同時對于CD40、CD80、CD86等共刺激因子來說也是陰性的，因此MSC被認為幾乎無免疫原性[4]。MHC-Ⅰ也可激活T細胞，但是在缺乏共刺激因子的情況下，無法與第二信號通路連接，從而使T細胞無反應(yīng)性。已有研究表明，MSC具有調(diào)節(jié)T細胞、樹突狀細胞和自然殺傷細胞的功能，因此MSC有望成為治療移植物抗宿主疾病和調(diào)節(jié)炎癥的有效工具之一[5]。同種異體移植的MSC不會發(fā)生排斥，并且在沒有使用免疫抑制劑的情況下可以在多種不同的組織內(nèi)長期存活[6]。利用MSC具有向炎癥、損傷組織器官、腫瘤部位趨化等特性，目前MSC的臨床應(yīng)用主要有[5]：①再生治療；②治療移植物抗宿主反應(yīng)和克羅恩??；③作為癌癥基因治療的平臺/載體。此外，MSC作為抗癌藥物靶向傳輸?shù)妮d體，也越來越多地被應(yīng)用于癌癥的基因治療研究。

2 HGF與MSC

2.1HGF的結(jié)構(gòu)與功能 HGF是一個異二聚體，由相對分子質(zhì)量為69×103的大亞基(重鏈)和一個相對分子質(zhì)量為×103的小亞基(輕鏈)構(gòu)成。HGF重鏈與輕鏈的氨基酸序列現(xiàn)已明確。HGF重鏈的結(jié)構(gòu)包括4個Kringle結(jié)構(gòu)，Kringle結(jié)構(gòu)由3個二硫鍵連接而成的雙環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，其中特征性序列(Asn_Tyr_Cys_Arg_Asn_Pro_Asp)只存在于Kringle結(jié)構(gòu)中，HGF中的Kringle結(jié)構(gòu)與纖溶酶原和凝血酶中的Kringle結(jié)構(gòu)相似，但與HGF功能的關(guān)系目前還不明確；HGF的輕鏈結(jié)構(gòu)和絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)類似，但是迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)HGF具有蛋白酶的功能。HGF輕鏈蛋白序列與散射因子都具有同源性，這與HGF的細胞運動作用相關(guān)[7]。HGF是一類作用廣泛的細胞因子，除了對肝細胞的作用外，還對很多組織和細胞有調(diào)控作用，它可以啟動肝再生、促進細胞分裂，對某些癌及肉瘤細胞具有抑制作用和腫瘤壞死作用[8]。

2.2HGF修飾的MSC的功能 HGF修飾骨髓MSC，可以抑制骨髓MSC凋亡，能提高細胞存活率，但是骨髓MSC也是HGF基因理想的細胞表達載體[9]。HGF修飾的MSC不會影響干細胞的分化功能，研究發(fā)現(xiàn)，HGF轉(zhuǎn)染骨髓MSC不會影響MSC的生長及與向脂肪細胞和成骨細胞的分化能力，但對細胞增殖和成骨也沒有明顯促進作用[10]。此外，HGF修飾的MSC具有免疫抑制作用，將會提高移植的成功率。朱金海等[11]發(fā)現(xiàn)，使用HGF修飾的骨髓MSC，在肝移植中，肝的局部會出現(xiàn)高濃度的HGF免疫抑制微環(huán)境，它能更加顯著地抑制急性排斥反應(yīng)，延長移植受體的存活時間。研究表明，HGF-MSC還可以加強對經(jīng)修飾的NIH3T3細胞與NIH3T3細胞的T淋巴細胞的免疫抑制作用和CD11b陽性或陰性細胞的活性，與BMSCs的免疫抑制作用類似，可以對細胞移植與組織損傷產(chǎn)生有益的作用。

近年來，MSC-HGF對于機體功能重建越來越受到關(guān)注。在心臟功能方面，MSC-HGF能夠更好地改善心肌病心力衰竭大鼠的左心室重構(gòu)，可以增強單純MSC對心肌梗死大鼠的治療作用，同時還可以明顯改善大鼠的心肌纖維化狀況[12-13]。在燒傷創(chuàng)面方面發(fā)現(xiàn)，MSC-HGF移植通過分泌相關(guān)細胞因子，能促進燒傷創(chuàng)面的愈合，對其具有積極影響[14]。在骨損傷方面，MSC-HGF因其更強的抗低氧損傷能力，可以增強血管的再生和骨重建，是潛在的治療骨壞死的有效途徑[15-16]。

3 HIF-1與MSC

3.1HIF-1結(jié)構(gòu)和功能 HIF-1是在低氧誘導的肝細胞癌細胞株Hep3B細胞的核提取物中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，它能與人紅細胞生成素(erythropoietin,EPO)基因3′端增強子的寡核甘酸序列發(fā)生特異性結(jié)合，并促進EPO轉(zhuǎn)錄 ，首次將其命名為HIF-1[17]。HIF-1是異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由 HIF-1α和 HIF-1β兩個亞單位組成，兩個基本的螺旋-環(huán)-螺旋單元(bHLH)PAS(Per-AhR/ARNT-Sim)區(qū)域蛋白相對分子質(zhì)量分別為120×103和 91×103。HIF-1廣泛存在于細胞中參與低氧信號轉(zhuǎn)導的一個主要的轉(zhuǎn)錄因子[18-19]。

HIF-1在維系腫瘤血運及供能方面起到關(guān)鍵的作用，不但可以誘導糖酵解相關(guān)酶的表達來改變細胞代謝途徑，而且還可以誘導VEGF的表達來改善局部微循環(huán)[20]。當細胞處于低氧環(huán)境時，HIF-1α的泛素降解途徑將被破壞，從而與HIF-1β二聚化形成穩(wěn)定的HIF-1分子，轉(zhuǎn)入到細胞核內(nèi)，它通過與低氧反應(yīng)元件的結(jié)合調(diào)控多種分子的表達，從而促進腫瘤細胞血管新生、糖酵解和凋亡抵抗[21]。Nardinocchi等[22]在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，當HIF-1α活性受到同源結(jié)構(gòu)域蛋白激酶2抑制時，化療抵抗腫瘤細胞可被致敏并出現(xiàn)凋亡。

3.2HIF-1修飾的MSC 低氧預處理的MSC凋亡率將降低，它對組織損傷的修復能力將會增強[23]。Weil等[24]研究表明，低氧處理后的MSC治療損傷的胎兒腸上皮細胞時，將會增加損傷組織的增殖與生存能力。低氧培養(yǎng)也將會縮短細胞擴增時間，增加Sca-1+/CD44+表達，降低其分化能力[25]。目前，MSC用于治療缺血性疾病，治療效果不佳的瓶頸是移植后細胞的活性降低。其中，細胞的黏附性就是其生存的前提，其全部過程包括MSC黏附在內(nèi)皮細胞，破壞其內(nèi)皮細胞間的緊密連接使細胞裂開，細胞則通過裂口穿過其血管壁，到達缺血組織[26]。Song等[27]研究表明，在低氧條件下可提高MSC在心肌缺血性疾病中的黏附性。在血管形成的過程中，血管生成素、Ephrin、轉(zhuǎn)錄生長因子β、血小板源性生長因子與成纖維細胞生長因子將參與脈管系統(tǒng)的建立[28]。當然也有學者認為，在缺氧條件下MSC將通過HIF-1增加血管生成素1與血管內(nèi)皮生長因子的表達來促進血管生成[29]。血管內(nèi)皮生長因子是強有力的特異性內(nèi)皮細胞分裂素，它的作用包括血管的再生，增加毛細血管的增殖及通透能力，誘導內(nèi)皮細胞進入低氧組織以及無血管區(qū)域直接參與血管生成和增殖[30-31]。所以，HIF-1修飾的MSC將有效改善干細胞移植的缺點，促進增殖，降低凋亡、促進血管生成，同時提高細胞黏附能力。

4 結(jié) 語

鑒于HGF、HIF-1與MSC的密切關(guān)系，可以考慮將兩者聯(lián)合應(yīng)用。如在心肌缺血性疾病中，HGF可以增強單純MSC對心肌梗死大鼠的治療作用，同時還可以顯著改善大鼠的心肌纖維化狀況；而低氧環(huán)境下又可提高MSC在心肌缺血性疾病中的黏附性。因此，應(yīng)用HGF和HIF-1聯(lián)合修飾MSC聚集了HGF的廣泛修復功能、HIF-1的缺氧缺血保護功能以及MSC自身多向分化潛能及無免疫原性優(yōu)勢，在高原高寒環(huán)境中的再生治療、器官移植中具有廣泛的應(yīng)用前景。

[1] Abdallah BM,Kassem M.Human mesenehymal stem cells:from basic biology to clinical applieations[J].Gene Ther,2008,15(2):109-116.

[2] Xu T,Zhang M,Laurent T,etal.Concise review:chemicalapproaches for modulating lineage-specific stem cells and progenitors[J].Stem Cells Transl Med，2013,2(5):355-361.

[3] Kumar S,Chanda D,Ponnazhagan S.Therapeutic potential of genetieally modified mesenehynlal stem cells[J].Gene Ther,2008,15(10):711-715.

[4] Patel SA,Sherman L,Munoz J,etal.Immunological properties of mesenchymal stem cells and clinical implieations[J].Arch Immunol Ther Exp,2008,56(1):1-8.

[5] English K.Mechanisms of mesenchymal stromal cell immunomodulation[J].Immunol Cell Biol，2013,91(1):19-26.

[6] Cecchi F,Rabe DC,Bottaro DP.Targeting the HGF/Met signaling pathway in cancer therapy[J].Expert Opin Ther Targets,2012,16(6):553-572.

[7] Chirgadze DY,Hepple J,Byrd RA,etal.Insights into the structure of hepatocyte growth factor/scatter factor(HGF/SF) and implications for receptor activation[J].FEBS Lett,1998,430(1/2):126-129.

[8] Fouillard L,Chapel A,Bories D,etal.Infusion of allogeneic-related HLA mismatehed mesenchymal stem cells for the treatment of incomplete engraftment following autologous haematopoietic stem cell transplantation[J].Leukemia,2007,21(3):568-570.

[9] 哈小琴,尹強,董芳,等.BMSCs聯(lián)合攜帶肝細胞生長因子的重組腺病毒促進糖尿病大鼠刨面修復的研究[J].中國修復重建外科雜志,2010,24(12)：1520-1524.

[10] 邊莉,郭子寬，艾輝勝,等.HGF基因修飾增強間充質(zhì)干細胞的免疫抑制作用[J].軍事醫(yī)學科學院院刊,2006,30(4)：323-328.

[11] 朱金海,陳燕凌.人肝細胞生長因子修飾的BMSCs對大鼠同種異體肝移植免疫排斥的影響[J].中國修復重建外科雜志,2011,25(7)：871-876.

[12] 蘇津白,林茂海,林美萍.移植轉(zhuǎn)染ADM 或HGF基因的骨髓間充質(zhì)千細胞治療大鼠心肌梗死[J].基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床,2010,30(2)：125-132.

[13] 林美萍,胡雨,張文文,等.人肝細胞生長因子基因修飾的骨髓問充質(zhì)干細胞對大鼠心肌纖維化的影響[J].中華高血壓雜志,2011,19(1)：65-70.

[14] Ha XQ,La TD,Hui L,etal.Effects of mesenchymal stem cells transfected with human hepatocyte growth factor geneon healing of burn wounds[J].Chin J Traumatol,2010,13(6)：349-355.

[15] Wen Q,Ma L,Chen YP,etal.Treatment of avascular necrosis of the femoral head by hepatocyte growth factor transgenic bone marrow stromal stem cells[J].Gene Ther,2008,15(23)：1523-1535.

[16] 宮恩年,商豐元,郭子寬,等.肝細胞生長因子基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療兔股骨頭壞死[J].中國組織工程研究與臨床康復,2009,13(28)：5411-5415.

[17] Rankin EB,Wu C,Khatri R,etal.The HIF signaling pathway in osteoblasts directly modulates erythropoiesis through the production of EPO[J].Cell,2012,149(1):63-74.

[18] Semenza GL.Regulation of mammalian O2homeostasis by hypoxia-inducible factor 1[J].Annu Rev Cell Dev Biol,1999,15:551-578.

[19] Semenza GL.Targeting HIF-1 for cancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2003,3(10):721-732.

[20] Giaccia AJ,Simon MC,Johnson R.The biology of hypoxia:the role of oxygen sensing in development,nomal function,and disease[J].Genes Dev,2004,18(20):2183-2194.

[21] Rankin EB,Giaccia AJ.The role of hypoxia-inducible factor in tumorigenesis[J].Cell Death Differ,2008,15(4):678-685.

[22] Nardinocchi L,Puca R,Sacchi A,etal.Inhibition of HIF-1alpha activity by homeodomain-interacting protein kinase-2 correlates with sensitization of chemoresistant cells to undergo apoptosis[J].Mol Cancer,2009,8:1.

[23] Chacko SM,Ahmed S,Selvendiran K,etal.Hypoxic preconditioning induces the expression of prosurvival and proangiogenic markers in mesenchymal stem cells[J].Am J Physiol Cell Physiol,2010,299(6):C1562-1570.

[24] Weil BR,Markel TA,Herrmann JL,etal.Mesenchymal stem cells enhance the viability and proliferation of human fetal intestinal epithelial cells following hypoxic injury via paracrine mechanisms[J].Surgery,2009,146(2):190-197.

[25] Valorani MG,Germani A,Otto WR,etal.Hypoxia increases Sca-1/CD44co-expression in murine mesenchymal stem cells and enhances their adipogenic differentiation potential[J].Cell Tissue Res,2010,341(1):111-120.

[26] Matsushita T,Kibayashi T,Katayama T,etal.Mesenchymal stem cells transmigrate across brain microvascular endothelial cell monolayers through transiently formed inter-endothelial gaps[J].Neurosci Lett,2011,502(1):41-45.

[27] Song SW,Chang W,Song BW,etal.Integrin-linked kinase is required in hypoxic mesenchymal stem cells for strengthening cell adhesion to ischemic myocardium[J].Stem Cells,2009,27(6):1358-1365.

[28] Woad KJ,Hunter MG,Mann GE,etal.Fibroblast growth factor 2 is a key determinant of vascular sprouting during bovine luteal angiogenesis[J].Reproduction,2011,143(1):35-43.

[29] Tawa H,Rikitake Y,Takahashi M,etal.Role of afadin in vascular endothelial growth factor-and sphingosine 1-phosphate- induced angiogenesis[J].Circ Res,2010,106(11):1731-1742.

[30] Samuel SM,Akita Y,Paul D,etal.Coadministration of adenoviral vascular endothelial growth factor and angiopoietin-1 enhances vascularization and reduces ventricular remodeling in the infarcted myocardium of type 1 diabetic rats[J].Diabetes,2010,59(1):51-60.

[31] Kuraitis D,Zhang P,Zhang Y,etal.A stromal cell-derived factor-1 releasing matrix enhances the progenitor cell response and blood vessel growth in ischaemic skeletal muscle[J].Eur Cell Mater,2011,22:109-123.