許志陽(綜述)，周鳳麗(審校)

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣州 510630)

自從1992年Letwin等[1]發(fā)現(xiàn)never in mitosis A(NIMA)相關(guān)蛋白激酶1(NIMA-related kinase-1,Nek1)以來，對(duì)Nek家族的研究不斷深入，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其家族有11個(gè)成員,而Nek2是其中一員。近年來發(fā)現(xiàn)其與中心體的關(guān)系密切，而且與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展也有關(guān)聯(lián)，相關(guān)研究越來越多。

1 中心體的概述

1.1結(jié)構(gòu) 典型的中心體是細(xì)胞內(nèi)一個(gè)體積很小的無膜包被的細(xì)胞器，其在細(xì)胞核附近處直徑為100～200 nm，長200～500 nm，約占據(jù)1 μm3的體積。在高級(jí)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，中心體即微管組織中心的細(xì)胞器外觀形態(tài)，由兩大部分結(jié)構(gòu)組成，包括一對(duì)互相垂直的中心粒和包繞在中心粒周圍的外周基質(zhì)。在電鏡下中心粒呈筒狀，由9組三聚體微管呈輻射對(duì)稱排列圍成。中心粒周圍外周基質(zhì)存在著無線粒體的細(xì)胞器，是由一些中心體蛋白通過介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互交聯(lián)而形成的結(jié)構(gòu)域。目前研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分裂間期只有一個(gè)中心體位于細(xì)胞核附近，而在進(jìn)入有絲分裂期后將出現(xiàn)兩個(gè)中心體分別位于紡錘體兩極[2]。DNA復(fù)制和中心體復(fù)制同時(shí)在G1/S開始，均以半保留方式復(fù)制，而這種復(fù)制方式已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)在形態(tài)學(xué)上變化可大致分為4個(gè)過程：①中心體的解離；②中心體復(fù)制和延伸；③中心體的斷裂和新中心體的成熟；④成熟的新中心體分離[3]。

1.2功能 中心體在細(xì)胞有絲分裂間期及有絲分裂期，主要是作為微管組織中心從而發(fā)揮作用。具體主要表現(xiàn)在以下兩方面：①在有絲分裂間期調(diào)節(jié)細(xì)胞微管的數(shù)目、極性、穩(wěn)定性以及在細(xì)胞內(nèi)空間分布；②在分裂期中主要是形成兩極紡錘體并使其與染色體相連，在細(xì)胞有絲分裂過程中在微管的牽引下使兩對(duì)子染色體向細(xì)胞的兩極方向運(yùn)動(dòng)，從而準(zhǔn)確保證復(fù)制后的兩對(duì)單倍染色體可以平均分配到2個(gè)子細(xì)胞中去，以便確保子代基因組的穩(wěn)定；同時(shí)中心體在細(xì)胞器的定向運(yùn)輸過程中為其提供可用的空間通道，并在細(xì)胞周期正常進(jìn)行過程中參與調(diào)節(jié)染色體的正常運(yùn)動(dòng)。目前有研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的中心體受損時(shí)細(xì)胞在進(jìn)行有絲分裂過程時(shí)，由于缺乏中心體使紡錘體精確定位出現(xiàn)異常而影響兩對(duì)子染色體向細(xì)胞兩極運(yùn)動(dòng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞周期不能正常進(jìn)行[4]。

1.3調(diào)控因素 中心體的精細(xì)調(diào)控可發(fā)生在細(xì)胞周期的每一個(gè)階段，但是目前具體調(diào)控中心體功能的因素和導(dǎo)致中心體異常的機(jī)制尚不明確，而已知的調(diào)控因素?fù)?jù)目前研究主要與以下幾個(gè)方面有關(guān)：中心體相關(guān)的蛋白激酶；中心體的不對(duì)稱遺傳；有絲分裂過程中與蛋白酶降解途徑有關(guān)物質(zhì)。目前已被研究認(rèn)識(shí)的激酶有：Aurora蛋白激酶家族、細(xì)胞周期依賴激酶家族以及極樣激酶(polo like kinases，PLK)家族。而另外一種激酶NIMA家族，尤其是Nek2作為中心體的調(diào)控因素也越來越受到關(guān)注。

2 Nek2的定位、結(jié)構(gòu)及功能

2.1Nek2定位 1975年，Morris[5]在研究絲狀真菌-曲霉菌的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期突變體其實(shí)質(zhì)可以分為blocked in mitosis(bim)和never in mitosis(nim)兩類，其將bim解釋為有絲分裂的紡錘體和染色體發(fā)生聚集而阻礙了有絲分裂進(jìn)行正常過程的突變體；nim解釋為停留于有絲分裂間期而不進(jìn)入分裂期的突變體。后來經(jīng)過大量的研究探索發(fā)現(xiàn),nim突變體包含一個(gè)基因的4個(gè)等位基因，首次被命名為nimA。通過進(jìn)一步研究也證實(shí)了nimA的作用主要是影響有絲分裂，通過調(diào)節(jié)有絲分裂的紡錘體極，而人類細(xì)胞的中心體地位相當(dāng)于真菌有絲分裂中紡錘體極[6]。后來經(jīng)過研究nimA被成功克隆出來并被證明其本質(zhì)是一種編碼絲氨酸/蘇氨酸的激酶并被正式命為NIMA[7]。Letwin等[1]從小鼠中成功分離并克隆出第1個(gè)與NIMA相關(guān)的基因，后被命名為Nek1基因。有學(xué)者提出在高等哺乳動(dòng)物中也可能存在1個(gè)在結(jié)構(gòu)和功能上相對(duì)高度保守的Nek基因家族，可以認(rèn)為Nek家族其實(shí)是NIMA基因家族在高等哺乳動(dòng)物表達(dá)的延伸[1]。隨后在人類細(xì)胞中也分離出與Nek1相關(guān)的基因，從而證明在高等哺乳動(dòng)物中Nek基因家族的確存在[7-8]。到目前為止已分離出的Nek家族有11個(gè)成員，即Nek1～Nek11，而Nek2與NIMA的同源性最高。Nek2在已復(fù)制的2個(gè)中心體的近端高度表達(dá)，但有研究發(fā)現(xiàn)約90% Nek2在未同步化的細(xì)胞中表達(dá)于中心體外，他們對(duì)此提出了兩種解釋：①中心體外和體上表達(dá)的Nek2維持一種動(dòng)態(tài)平衡,而中心體承載量有限；②表達(dá)于中心體外的Nek2可能有其他方面的功能[9]。也有研究者觀察到3種Nek2的剪接異構(gòu)體的亞細(xì)胞定位不同，即Nek2A表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，Nek2B主要是在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而Nek2C主要表達(dá)于細(xì)胞核[10]。

2.2Nek2結(jié)構(gòu) 經(jīng)研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)高等哺乳動(dòng)物的Nek2的構(gòu)成主要是一種具有445個(gè)氨基酸殘基序列的蛋白。與真菌的Nek2結(jié)構(gòu)一樣，由一個(gè)激酶區(qū)域的N端和一個(gè)未催化的卷曲的螺旋區(qū)域的C端組成。N端區(qū)域是典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的氨基酸序列,而C端區(qū)域有2個(gè)能夠形成卷曲螺旋體的位置，分別為緊靠激酶區(qū)域的下游和最末的C端[11]。目前已知人類細(xì)胞中Nek2表達(dá)Nek2A、Nek2B、Nek2C，三種結(jié)構(gòu)相似的剪接異構(gòu)體，重要的區(qū)別在于Nek2C具有強(qiáng)核定位信號(hào)，而Nek2A則較弱，Nek2B無此結(jié)構(gòu)域。三者的C端區(qū)域區(qū)別在于Nek2B比Nek2A少31個(gè)卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，Nek2A比Nek2C多38個(gè)氨基酸序列[10]。

2.3Nek2的功能 Nek2在催化區(qū)域與NIMA有著高度相似性，不同的是Nek2并非細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂過程所必須的，在此過程中其主要作用是調(diào)節(jié)中心體分離[12]。Fry[9]發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的Nek2主要是調(diào)控中心體在G2～M期向兩極分離，而這對(duì)于形成雙極紡錘體和分離染色體具有重要的作用。其中Nek2和蛋白質(zhì)磷酸酶(protein phosphatase1,PP)1的復(fù)合體是中心體黏附及分離的主要調(diào)節(jié)器之一，其可以確保G2期紡錘體順利進(jìn)入M期。Nek2在細(xì)胞有絲分裂間期受PP1抑制，其活性較低，進(jìn)入G2晚期PP1逐漸失活或移位致使Nek2抑制解除，活性增加從而促進(jìn)中心體發(fā)生分離。調(diào)節(jié)過程中Nek2主要是通過磷酸化將2個(gè)未分離的中心體的2種蛋白連接，即將中心體相關(guān)蛋白1和小根蛋白連接致使其脫離中心體而發(fā)生分離。因此,Nek2的表達(dá)增加或活性升高，PP1、中心體相關(guān)蛋白1受抑制均促進(jìn)中心體發(fā)生分離[10]。除了起到調(diào)節(jié)中心體作用外，Nek2還可促使染色質(zhì)濃縮和中間體與著絲點(diǎn)上的組蛋白H3細(xì)胞發(fā)生分離，同時(shí)在染色體發(fā)生準(zhǔn)確分離中起重要作用。Nek2發(fā)揮作用的關(guān)鍵是癌癥高表達(dá)蛋白發(fā)生磷酸化，而非磷酸化的癌癥高表達(dá)蛋白將干擾染色質(zhì)濃縮，并可使微管與著絲粒的黏附發(fā)生廣泛出錯(cuò)，它可以發(fā)生單極或多極黏附，故只有磷酸化的癌癥高表達(dá)蛋白才能確保染色體準(zhǔn)確分離[13]。進(jìn)一步研究Nek2在早期胚胎中的作用，證實(shí)了Nek2在調(diào)控細(xì)胞周期過程和中心體分離中的重要地位。有研究者通過在顯微鏡下注射微RNA抑制Nek2在小鼠胚胎細(xì)胞中的調(diào)節(jié)作用，結(jié)果使75%的胚胎不能進(jìn)入胚泡期，大部分被逮捕在第四細(xì)胞期[14]。大多數(shù)胚胎的分裂球在形態(tài)學(xué)上呈現(xiàn)出不同程度的缺陷，形成了異常的片狀結(jié)構(gòu)和無規(guī)律的核形態(tài)，其中包括啞鈴核、微核。Nek2是通過與中心體蛋白、Nek2作用蛋白(Nek2-interacting protein1，NIP1)/centrobin作用而參與微管的組裝過程，其表達(dá)受抑時(shí)可引起微管組裝發(fā)生障礙，進(jìn)一步引起中心體發(fā)生成熟障礙。但是,Nek2能把胞質(zhì)內(nèi)的NIP1聚集物分解為許多小片段，抵抗NIP1的抑制從而使其與微管緊密結(jié)合以維持微管穩(wěn)定[15]。

3 Nek2與腫瘤

3.1Nek2異常表達(dá)與腫瘤 有研究發(fā)現(xiàn)[16]，異常表達(dá)的Nek2可結(jié)合并進(jìn)一步磷酸化Mad2及Cdc20，以致于干擾它們作為有絲分裂過程中檢查點(diǎn)的相關(guān)作用，從而引起宿主染色體的不穩(wěn)定性最終可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Quarmby等[17]認(rèn)為，有活性的Nek2A過度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致不成熟的中心體提前分離，而無活性的Nek2A過度表達(dá)將會(huì)形成異常中心體包括單極紡錘體和非整數(shù)倍體，他們認(rèn)為腫瘤發(fā)生與這些異常的中心體出現(xiàn)均相關(guān)。Osmani等[18]認(rèn)為,當(dāng)Nek2及其同系物過度表達(dá)可以使中心體聚集從而加快有絲分裂進(jìn)程，甚至可以直接引起染色體的分裂，并且證明當(dāng)Nek2出現(xiàn)過表達(dá)可以產(chǎn)生額外的中心體，從而形成多核細(xì)胞的增殖；還有學(xué)者提出Nek2的異常表達(dá)可以影響染色體著絲點(diǎn)蛋白[19]。目前有研究也發(fā)現(xiàn)[20]，在人類睪丸精原細(xì)胞瘤中Nek2基因水平的表達(dá)顯著上調(diào)。也有研究表明，Nek2在乳腺原位癌及乳腺浸潤性癌的表達(dá)均顯著高于正常的乳腺組織，而在乳腺浸潤性癌中的表達(dá)又顯著高于乳腺原位癌，這兩者之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[21]。同樣Kokuryo等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，人膽管癌細(xì)胞所表達(dá)的Nek2的mRNA和蛋白水平都較正常成纖維細(xì)胞有明顯增加。最近梁基韻等[23]運(yùn)用免疫組織化學(xué)法，利用組織芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在消化系統(tǒng)腫瘤組織中Nek2的表達(dá)同樣明顯增高。

3.2Nek2促進(jìn)腫瘤發(fā)生 非整倍體及染色體缺乏穩(wěn)定性是腫瘤細(xì)胞所具有的最常見的兩大特征，其通常由在有絲分裂過程中細(xì)胞分裂或染色體分離異常所引起的。而Nek2不僅參與中心體分離,而且還參與染色質(zhì)濃縮和染色體分離，因此Nek2既可間接調(diào)節(jié)中心體也可直接干擾染色體而影響整個(gè)有絲分裂過程的穩(wěn)定，從而促使細(xì)胞向惡性增生方向轉(zhuǎn)化[20]。Nek2表達(dá)水平及活性增高是其在腫瘤細(xì)胞中最普遍的表現(xiàn)形式。

3.3Nek2與腫瘤化療的敏感性 化療是治療腫瘤的一種普遍方式之一，化療對(duì)一些實(shí)體腫瘤有高度的特異性。有針對(duì)性地增加腫瘤細(xì)胞的敏感性是目前化療藥物的重要機(jī)制。調(diào)節(jié)Nek2的表達(dá)水平可能增加化療的耐藥性。Lee等[24]發(fā)現(xiàn),聯(lián)合Nek2小分子干擾RNA可以提高化療藥物在乳腺癌的敏感性。

3.4Nek2作為治療腫瘤的靶點(diǎn) 現(xiàn)在在一些人類癌癥中發(fā)現(xiàn)Nek2表達(dá)水平的增高，提高了Nek2作為潛在的癌癥治療靶點(diǎn)的地位。但是,在發(fā)現(xiàn)治療藥物之前確認(rèn)是否Nek2可以成為一個(gè)有效的治療靶點(diǎn)。有一種確認(rèn)方法是檢查阻遏蛋白在細(xì)胞模型中的表達(dá)。Kokuryo等[22]在向膽管上皮癌裸鼠模型的腫瘤周圍注射Nek2-小分子干擾RNA時(shí)首先發(fā)現(xiàn)可干擾Nek2表達(dá)，不僅顯著抑制膽管上皮癌細(xì)胞增殖而且延長有腹膜轉(zhuǎn)移的小鼠存活中位期。Tsunoda等[21]在乳腺癌裸鼠模型上發(fā)現(xiàn)用小分子干擾RNA干擾Nek2表達(dá)不僅可以顯著降低乳腺癌細(xì)胞增殖,而且還大大降低了乳腺癌向體外浸潤的風(fēng)險(xiǎn)。另外,在結(jié)直腸癌細(xì)胞模型以及組織活檢中發(fā)現(xiàn)用小分子干擾RNA干擾Nek2可抑制腫瘤的生長[25]。所以,抑制Nek2的過表達(dá)就有可能抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，可能作為治療腫瘤的一種新方法，而且目前在這方面的研究也是熱點(diǎn)。

4 展 望

從癌癥生物學(xué)的角度來看，目前在多種腫瘤的不同類型中均發(fā)現(xiàn)Nek2過度表達(dá)的現(xiàn)象，表明其可作為選擇性干擾癌細(xì)胞擴(kuò)散以及重要的預(yù)后標(biāo)志物。但是,對(duì)于Nek2結(jié)構(gòu)的進(jìn)一步明確，了解其激活機(jī)制從而設(shè)計(jì)特異性的抑制劑仍較困難。隨著研究的不斷深入也越來越發(fā)現(xiàn)，Nek2在腫瘤中表達(dá)水平的升高有可能是因?yàn)榛虻臄U(kuò)增失去控制導(dǎo)致的。這樣就為治療腫瘤提供了一種新的思路，即控制Nek2的過表達(dá)，這也給那些難治的癌癥患者帶來了希望。Nek2能否作為新的腫瘤標(biāo)志物，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后及耐藥的關(guān)系，抑制Nek2的過表達(dá)能否真正達(dá)到治療腫瘤的目的以及怎樣抑制其過表達(dá)，仍將有一段很長的路要走。

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