鄢夢竹(綜述)，李書國(審校)

(三峽大學第一臨床醫(yī)學院，宜昌市中心人民醫(yī)院老年病科，湖北 宜昌 443002)

近年來，微RNA(microRNA，miRNA)倍受關注。自1993年在線蟲細胞發(fā)現后，科學家們發(fā)現在動物、植物以及病毒體內存在大量的miRNA[1-2]。研究顯示，miRNA在心血管系統中高度表達，尤其在動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)中起重要的作用[1]。研究表明，參與AS脂質代謝的miRNA,包括miR-122、miR-370、miR-378/378*、miR-335、miR-27、miR-125a-5p和miR-33等[3]。該文就近年來報道的miR-33在AS發(fā)生和發(fā)展中對膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和脂肪酸代謝的影響及其調控機制進行綜述，期望推動miRNA在脂質代謝紊亂方面的機制研究，能夠對AS的治療有一定的幫助。

1 miRNA的形成及作用機制

miRNA是一組內源性的、高度保守的、大小約為22個堿基的非編碼RNA分子，參與體內多種生物過程。其通過與靶基因mRNA的3′-非編碼區(qū)(untranslated region，UTR)結合在轉錄后水平直接降解靶標mRNA或抑制蛋白質翻譯。

1.1miRNA的形成 miRNA基因最初由RNA聚合酶Ⅱ轉錄形成具有5′帽子結構和3′polyA的初級miRNA(pri-miRNA)，接著在細胞核中經聚合酶ⅢDrosha和DGCR8組成的蛋白復合體作用，加工處理成大小為70～100 nt、具有莖環(huán)結構的次級轉錄產物(pre-miRNA)。然后pre-miRNA經轉運蛋白Exportin-5運送到細胞質中，由核酸酶Dicer切割，形成長約22 nt的成熟miRNA。成熟miRNA與RNA誘導的沉默復合物結合，從而發(fā)揮轉錄后翻譯水平的調節(jié)作用[4-5]。

1.2miRNA的作用機制 miRNA與其靶基因mRNA的作用機制有兩種：當miRNA與靶基因mRNA的 3′UTR端不完全互補結合時，其在蛋白質水平抑制目的基因的表達，阻遏翻譯但不影響mRNA的穩(wěn)定性；而當miRNA與某段目的基因序列完全配對時，主要引起目的基因斷裂，最終在mRNA水平導致基因沉默[4]。

2 miR-33在AS中的研究

膽固醇和脂肪酸參與AS的發(fā)生、發(fā)展已經得到公認[6-8]。miR-33被證明在轉錄后水平抑制參與細胞膽固醇流出和HDL代謝基因，如腺苷三磷酸結合盒轉運體(ATP binding cassette transporter，ABC)A1、ABCG1、C型1類尼曼-匹克蛋白(niemann-pick C1 protein，NPC1)，以及脂肪酸氧化基因，如肉堿O-辛基轉移酶(carnitine O-octanoyltransferase，CROT)、肉毒堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ(carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A)、羥烷基輔酶A 脫氫酶B/3-酮乙基-輔酶A硫解酶/烯酰輔酶A水合酶β亞單位(hydroxyacyl-Coenzyme A dehydrogenase/3-ketoacyl-Coenzy-me A thiolase/enoyl-Coenzyme A hydratase β-subunit，HADHB)、磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)等的表達[7,9]。因此，可以通過抑制miR-33的表達來解除其對以上基因的抑制，達到防止AS發(fā)生及促進其轉歸的目的。

2.1miR-33調節(jié)體內膽固醇平衡 膽固醇是細胞膜的基本組成成分，在細胞的生物學功能方面起著重要作用。血漿膽固醇過剩導致其在動脈壁聚集，從而引起AS的發(fā)生、發(fā)展[7,10]。如果能有效地調節(jié)膽固醇合成、攝取以及排除，將對治療AS非常有利。目前已知調控體內膽固醇平衡的經典轉錄因子包括膽固醇調節(jié)元件結合蛋白(sterol-regulatory element binding protein,SREBP)和肝X受體。其中SREBP通過結合到增強子區(qū)域來活化參與膽固醇和脂肪酸生物合成及攝取基因的轉錄，最終產生三酰甘油和磷脂，SREBP主要有三種亞型：SREBP1a、SREBP1c和SREBP2[8]。除了SREBP，肝X受體也參與體內膽固醇和脂肪酸的調控。當膽固醇水平升高時，肝X受體發(fā)生活化，誘導參與膽固醇吸收、轉運和排泄蛋白的表達，參與該過程的因子包括ABCA1、ABCG1、ABCG5/G8和載脂蛋白E[7]。

最近研究表明，新發(fā)現的miR-33也參與體內膽固醇平衡的調節(jié)[4]。通過與其宿主基因SREBP一起調節(jié)膽固醇/脂質平衡[11-14]。在人體中存在兩種miR-33基因：miR-33b位于第17號染色體SREBP-1基因的17號內含子區(qū)域，其宿主基因可選擇性調控脂肪酸和三酰甘油的合成；miR-33a位于第22號染色體SREBP-2基因的16號內含子區(qū)域，其宿主基因控制著細胞內的膽固醇合成和攝??；然而，在小鼠體內只有miR-33a基因的表達位于SREBP-2基因的15號內含子區(qū)域[14-15]。鑒于miR-33b序列只在大型哺乳動物中表達，因此強調了miR-33a在種屬間進化的高度保守性[1,8,16]。雖然miR-33a/b成熟形式只相差2個核苷酸，但它們與靶基因mRNA 3′-UTR的結合位點,即“種子序列”相同,因此有可能抑制相同基因的表達[13,17-18]。在膽固醇平衡的調節(jié)中，miR-33通過靶向ABCA1、ABCG1和NPC1發(fā)揮作用[8,11,19]。脊椎動物中作用最突出的是ABCA1，它是HDL的生物合成和膽固醇逆向轉運的重要調控者[14,16]。

在肝臟，ABCA1可以使額外的膽固醇從細胞流出到載脂蛋白A-I形成初生型HDL；在外周組織特別是AS損傷處的巨噬細胞中，ABCA1又介導胞內膽固醇流出到初生型HDL，再傳遞到肝臟分解成膽汁酸來代謝,這個過程被稱為“膽固醇逆向轉運(reverse cholesterol transport,RCT)”，其在體內膽固醇的平衡中發(fā)揮著重要作用，也是重要的抗AS機制。在各種細胞類型中，尤其是肝細胞，miR-33過表達可下調ABCA1蛋白質的表達，減少膽固醇流向載脂蛋白A1和初生型HDL的產生，進而抑制RCT[5,12]；相反，抑制miR-33的表達可增加肝臟ABCA1蛋白質的表達，從而增強RCT。這一結果表明，抑制miR-33的表達可阻止AS的發(fā)生、發(fā)展[16,20]。有研究顯示，來源于miR-33不足的小鼠腹膜巨噬細胞ABCA1水平顯著增加，具有更多載脂蛋白A-I依賴的膽固醇流出，肝臟ABCA1蛋白水平也更高，表明miR-33在調節(jié)ABCA1表達和膽固醇流出中起著極其重要的作用，因此可以通過適當下調miR-33水平來達到治療相關疾病的目的[21]。也有研究報道，在小鼠體內通過反義寡核苷酸技術、病毒傳遞性發(fā)夾抑制劑沉默miR-33a，或有針對性地剔除miR-33a,可以增加肝臟ABCA1水平和循環(huán)HDL水平，其最高可達40%[12-13,22]。另一份報道顯示，使用慢病毒過表達反義miR-33，6 d后肝臟ABCA1蛋白水平增加50%，伴隨血漿HDL水平增加25%[21]。Marquart等[23]也表示，體內注入反義miR-33寡核苷酸可導致ABCA1表達和HDL水平大幅提升。miR-33靶向ABCA1與SREBP協同調控膽固醇平衡，使miR-33有望成為治療并改善AS的新療法。

除了ABCA1，研究人員還發(fā)現另外兩種參與膽固醇動員的miR-33靶基因：ABCG1和NPC1，ABCG1促進膽固醇外排到高密度脂蛋白，NPC1將膽固醇從溶酶體運輸到細胞內其他部位，以便進行下一步轉運[11-12]。小鼠ABCG1基因的3′UTR包含兩個miR-33結合位點，而人類基因3′UTR不存在這些位點，在小鼠巨噬細胞過表達miR-33時可抑制ABCG1蛋白的表達，而在人類卻不出現類似的情況，表明該基因由miR-33的種屬特異性調控[12,19]。Rayner等[13]報道，在抗miR-33 4周的低密度脂蛋白受體基因剔除(LDLR-/-)小鼠肝臟中ABCG1的蛋白水平增加。然而其他研究表明，小鼠體內的miR-33的消耗并沒有改變肝臟中ABCG1蛋白的水平，表明miR-33調節(jié)ABCG1可能取決于動物模型的遺傳背景[11]。人類NPC1的3′UTR包含兩個miR-33結合位點,導致NPC1蛋白表達被人類巨噬細胞和肝細胞中的miR-33抑制。NPC1還能夠與ABCA1協同作用促進細胞內膽固醇流向載脂蛋白A1，表明miR-33對人的胞內膽固醇外排功能進行了雙重抑制[12]。小鼠NPC1基因的3′UTR只有1個miR-33結合位點，但是不會被miR-33抑制。總而言之，miR-33通過特異性靶向ABCA1、ABCG1和NPC1 3′UTR來調控體內膽固醇平衡，而其他不含miR-33靶點的脂質相關基因的表達并沒有明顯改變。在其他包含假定miR-33結合位點的基因，如3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因和膽固醇調節(jié)元件結合蛋白裂解激活蛋白基因也只是輕度下調，而在mRNA和蛋白表達水平并沒有改變[19]。

miR-33在膽固醇調節(jié)中起到了不可或缺的作用，其通過胞內膽固醇出發(fā)的負反饋環(huán)來發(fā)揮功能，當膽固醇含量不足時，miR-33和膽固醇調節(jié)元件結合因子2同時轉錄共同調節(jié)膽固醇平衡，通過同時開始膽固醇攝取和合成路徑，抑制膽固醇流出；而當胞內膽固醇過量時，miR-33又可以通過ABCA1途徑促進膽固醇流出。所以，體內miR-33的異常表達可引起一系列代謝性疾病，尤其是AS。

2.2miR-33調節(jié)HDL-C的生物合成 血漿HDL-C水平與心血管疾病有很強的負性關系，因此，升高HDL-C水平的治療成為研究的焦點。通過Framingham心臟研究表明，每增加1%循環(huán)HDL-C，發(fā)展為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病危險可減少2%[24]。ABCA1除了參與細胞內膽固醇的轉運，還參與肝臟HDL-C的形成，提示miR-33對血漿HDL-C水平的調控具有重要意義。研究發(fā)現，miR-33通過抑制ABCA1的表達，可以降低血漿HDL水平，拮抗內源性miR-33表達后，小鼠血漿HDL水平明顯升高，同時減少了斑塊大小、脂質成分以及炎癥基因的表達，增加了斑塊的穩(wěn)定性[16,22]。Rayner等[24]在LDLR-/-的小鼠AS模型進行為期4周的抗miRNA寡核苷酸治療，結果顯示，HDL-C水平有效升高，斑塊巨噬細胞和脂質成分減少35%，膠原成分增加2倍，提高了病變的改造和斑塊的穩(wěn)定性，促進AS斑塊轉歸。Marquart等[25]報道，miR-33的腺病毒轉導引使HDL-C水平減少了29%，相反，在miR-33a-/-小鼠中，巨噬細胞和肝細胞ABCA1的表達水平均升高，并增加了基線HDL水平。Najafi-Shoushtari等[14]在高脂飲食的小鼠模型中，利用鎖定miR-33a的特定核苷酸處理動物后，發(fā)現血漿HDL-C水平上調約35%。另外，除了靶向肝臟，Rayner等[24]研究表明，2′氟代/甲氧乙基-修飾的硫代硫酸主鏈反義寡核苷酸注射可以滲透AS斑塊到達病變的巨噬細胞中，從而上調ABCA1的表達，增強膽固醇從泡沫細胞排除。因此，抗miR-33功能不僅升高HDL和促進RCT，也直接靶向調節(jié)斑塊中的巨噬細胞，通過上調細胞膽固醇流出路徑來進一步增強RCT，在巨噬細胞中抑制miR-33可能也會有利于阻止斑塊破裂。抗miR-33治療升高血漿HDL的結果也在非人類靈長動物中被證實[19]。

有研究顯示，在LDLR-/-的小鼠體內注射抗miR-33寡核苷酸(每周1次，共14周)，血漿樣本分析顯示，在處理最初2周內HDL-C升高，但沒有持續(xù)到實驗末尾[17]。在抗miR-33處理的小鼠中，與對照組相比循環(huán)三酰甘油的水平顯著增加，最后檢查發(fā)現斑塊的大小和成分并沒有重大改變，表明在LDLR-/-小鼠體內長期沉默miR-33不能維持血漿HDL-C水平的升高，即不能阻止AS的發(fā)生、進展[25]。

抗miR-33可通過反義抑制劑或剔除等方法來升高循環(huán)HDL-C水平，增強巨噬細胞膽固醇的流出和RCT，這些均表明靶向反義寡核苷酸的miR-33可能作為減少AS的新型治療策略。

2.3miR-33的調節(jié)脂肪酸代謝 miRNA除了可以調節(jié)膽固醇的平衡和HDL-C的生物合成外，還可直接調節(jié)與脂肪酸氧化相關蛋白的表達。miR-33減少參與脂肪酸氧化基因的表達，如CROT、CPT1A、HADHB和AMPKα等；同時還增加參與脂肪酸合成基因的表達，如膽固醇調節(jié)元件結合因子1、脂肪酸合成酶、ATP枸櫞酸鹽裂解酶和乙酰-輔酶A羧化酶等。CROT、CPT1A、HADHB和AMPKα都含有功能性的miR-33a/b結合位點。CROT是一種過氧化物酶體的酶，催化短鏈脂肪酸向肉堿轉移，使它們可通過β-氧化降解，促進脂肪酸從過氧化物酶體運輸到細胞質[11]。CPT1A是β-氧化的限速酶，是必需的乙酰輔酶A的耦合肉堿，使長鏈脂肪酸運輸到線粒體進行β氧化。HADHB可催化線粒體對長鏈脂肪酸β-氧化的最后三個步驟，而AMPKα刺激肝的脂肪酸氧化和生酮作用[11]。研究發(fā)現，當肝細胞過表達miR-33時，CPT1A和HADHB的表達水平降低，衰減脂肪酸β氧化，大大減少脂肪酸降解，導致中性脂質的聚集；相反，內源性抑制miR-33的表達可增加脂肪酸的降解[8,10]。Rayner等[13]研究表明，在用反義miR-33寡核苷酸處理的非人類靈長動物中，血漿極低密度脂蛋白的水平顯著降低。這些研究均表明，抗miR-33的治療可能是一種很有前景的策略，以提高血漿HDL和降低極低密度脂蛋白三酰甘油的水平，從而達到治療高脂血癥和AS的目的。

3 展 望

miR-33通過參與脂質代謝在AS的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用?；谶@一點，可以通過抑制miR-33的表達，促進膽固醇反轉運、增加循環(huán)HDL-C，使抗miR-33作為新型治療AS和心血管疾病的有效方式。因此，有效沉默miR-33和(或)他汀類藥物的聯合應用對提高HDL和降低低密度脂蛋白的水平可能是治療AS的新策略。雖然miR-33可作為潛在的藥物治療靶向，但仍面臨著許多挑戰(zhàn)，如單一的miR-33如何在體內外嚴格調控多目標基因的表達，共轉染不同的miRNA在單個靶基因的表達會產生哪些影響；還存在哪些更多的miR-33靶點，其調控機制如何；拮抗miR-33是否對其他組織器官產生一些不利影響；有效合成的治療性miR-33能否被安全傳送到特定的靶組織，是否會產生一定的不良反應，這些問題都有待于進一步的研究和不斷的探索。

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