郝烘玉，賀丹，劉輝，王婷婷

臨床研究

多發(fā)性硬化患者腦脊液磷酸丙糖異構(gòu)酶抗體表達(dá) 與EDSS評(píng)分的相關(guān)性研究

郝烘玉，賀丹，劉輝，王婷婷

目的探討多發(fā)性硬化(MS)患者腦脊液磷酸丙糖異構(gòu)酶(TPI)抗體表達(dá)水平與臨床神經(jīng)功能障礙程度的相關(guān)性及其診斷價(jià)值。方法采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA方法)分別對(duì)23例MS患者(MS組)、17例其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病(OIND組)患者、13例非炎性疾病(ONIND組)患者的腦脊液TPI抗體表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)及比較，并分析TPI抗體表達(dá)水平與臨床擴(kuò)展致殘量表評(píng)分(EDSS評(píng)分)的相關(guān)性。結(jié)果MS組、OIND組、ONIND組腦脊液TPI抗體OD值表達(dá)均數(shù)分別為(0.187±0.043)、(0.195±0.042)、(0.164±0.050)，3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腦脊液TPI抗體表達(dá)陽(yáng)性率：MS組為3例(13.04%)、OIND組及ONIND組為0(P>0.05)。相關(guān)性分析顯示,MS患者臨床神經(jīng)功能障礙EDSS評(píng)分與腦脊液TPI抗體OD值呈正相關(guān)(r=0.938，P=0.003)。結(jié)論腦脊液TPI抗體可以作為監(jiān)測(cè)MS臨床療效及評(píng)估預(yù)后的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，但目前暫不能認(rèn)為其可以作為MS的輔助診斷性指標(biāo)。

多發(fā)性硬化；磷酸丙糖異構(gòu)酶；臨床擴(kuò)展致殘量表評(píng)分；神經(jīng)元及軸索變性

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是由多種因素共同參與的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病。從早期未引起注意的輕微癥狀進(jìn)展為特征性臨床癥狀體征，潛伏期通常為1～10年，往往貽誤診治，因而是成年人中最常見(jiàn)的導(dǎo)致癱瘓的疾病之一。因此，早期診斷、治療對(duì)MS預(yù)后轉(zhuǎn)歸至關(guān)重要。國(guó)外最新研究顯示，MS患者腦脊液克隆B細(xì)胞核內(nèi)含有單鏈可變區(qū)抗體基因片段。所表達(dá)抗體可與病變腦組織內(nèi)分布于神經(jīng)元及軸索內(nèi)參與能量代謝的磷酸丙糖異構(gòu)酶(triose phosphate isomerase，TPI)緊密結(jié)合，誘導(dǎo)神經(jīng)元及軸索變性[1]。因此，推測(cè)TPI抗體有可能參與了MS神經(jīng)元及軸索病變的過(guò)程。本研究旨在分析腦脊液TPI抗體表達(dá)與MS的相關(guān)性，為MS在神經(jīng)元及軸索等灰質(zhì)系統(tǒng)病變方面的深入研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2011年7月—2012年12月于河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院住院確診符合2010年McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)的MS患者23例(MS組)，男8例，女15例，年齡22～59(35.4±9.2)歲；病程1～3個(gè)月，初次確診，以視力障礙或肢體活動(dòng)障礙為主。另選取同期其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病(OIND組)患者17例，男6例，女11例，年齡22～55(36.1±10.0)歲；最終確診為病毒性腦炎患者13例、急性脊髓炎患者4例，均未合并意識(shí)障礙。非炎性疾病(ONIND組)患者13例,其中男5例，女8例，年齡21～63(38.1±13.7)歲；最終確診為吉蘭—巴雷綜合征患者1例、腦膜癌患者1例、靜脈竇血栓患者2例、腦血管病患者9例。征得MS患者同意后,由本人依據(jù)量表項(xiàng)目對(duì)自己的生活質(zhì)量進(jìn)行擴(kuò)展致殘量表評(píng)分(EDSS評(píng)分)，視力障礙或肢體癱瘓的患者則由固定調(diào)查員協(xié)助進(jìn)行。3組患者性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究均獲得全部受試對(duì)象知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 觀測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1 腦脊液采集：留取患者入院后但未進(jìn)行激素和/或丙種球蛋白治療前的首次腰椎穿刺術(shù)腦脊液5 ml，裝入離心管中于-80℃保存待測(cè)，避免反復(fù)凍融。

1.2.2 抗體檢測(cè)：采用ELISA方法檢測(cè)腦脊液內(nèi)TPI抗體。步驟如下：以TPI(Sigma公司)2 μg/ml包被酶標(biāo)板(Nunc公司)，4℃過(guò)夜。每孔加入3%牛血清白蛋白(bovogen公司)300 μl室溫條件下封閉2 h。洗板機(jī)(DG3090 南京華東電子)清洗5次，每次靜置10～20 s，每孔加入CSF 35 μl 25℃孵育反應(yīng)3 h。洗板機(jī)清洗5次，加入1.5%BSA/PSB配制羊抗人IgG抗體(Sigma公司)(1∶1 000)100 μl，25℃孵育反應(yīng)1.5 h。洗板機(jī)清洗5次，每孔加入TBM底物，KPL單組份顯色劑，25℃避光孵育反應(yīng)30 min。每孔加入2 mol/L HCl終止液50 μl終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀(DG5033A南京華東電子)在波長(zhǎng)450 nm處讀取吸光度值(OD值)。對(duì)3組患者分析其與EDSS評(píng)分的相關(guān)性。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 以O(shè)NIND組所測(cè)TPI抗體OD值的均數(shù)+2倍標(biāo)準(zhǔn)差為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)，高于此標(biāo)準(zhǔn)者為T(mén)PI抗體表達(dá)陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1 TPI抗體OD值及陽(yáng)性率比較 MS組、OIND組、ONIND組腦脊液TPI抗體OD值表達(dá)均數(shù)分別為(0.187±0.043)、(0.195±0.042)、(0.164±0.050)，3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。腦脊液TPI抗體表達(dá)陽(yáng)性率：MS組為3例(13.04%)、OIND組及ONIND組均為0，3組間TPI抗體陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 TPI抗體與EDSS評(píng)分的相關(guān)性分析 相關(guān)性分析得出MS患者EDSS評(píng)分(3.35±2.46)與腦脊液TPI抗體OD值(0.187±0.043)呈正相關(guān) (r=0.938，P=0.003)。

3 討 論

3.1 腦脊液TPI抗體表達(dá)及臨床價(jià)值分析 目前國(guó)際上惟一公認(rèn)的用于評(píng)估MS患者神經(jīng)功能障礙的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為EDSS評(píng)分。EDSS評(píng)分可作為早期MS患者生活質(zhì)量的一個(gè)預(yù)測(cè)因子，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師早期關(guān)注患者生活質(zhì)量并進(jìn)行必要干預(yù)[2]，具有很強(qiáng)的臨床實(shí)用價(jià)值。本研究通過(guò)測(cè)定MS患者腦脊液TPI抗體表達(dá)水平，分析其與MS患者臨床EDSS評(píng)分的相關(guān)性得出：MS患者腦脊液TPI抗體表達(dá)水平與神經(jīng)功能障礙程度具有正相關(guān)性(r=0.938，P=0.003)。TPI抗體在MS組表達(dá)陽(yáng)性率為13.04%，OIND及ONIND組表達(dá)陽(yáng)性率為0，3組間TPI抗體表達(dá)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。研究結(jié)果表明：TPI抗體參與誘導(dǎo)了MS的級(jí)聯(lián)免疫反應(yīng)，與MS神經(jīng)元及軸索損傷密切相關(guān)。因此，腦脊液內(nèi)TPI抗體的測(cè)定，可以作為監(jiān)測(cè)MS臨床療效及評(píng)估預(yù)后的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。在臨床治療方面，有望為抗TPI抗體相關(guān)藥物的研發(fā)提供新的思路。有文獻(xiàn)報(bào)道35例確診MS及70例非MS患者的CSF及腦組織證實(shí)：MS患者腦脊液及病變區(qū)域腦組織內(nèi)含有TPI抗體表達(dá)的增高[3]。分析TPI抗體的致病機(jī)制為：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，由于TPI廣泛與神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞骨架中的微管結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合[3]。在神經(jīng)元中，神經(jīng)微管作為神經(jīng)軸突胞漿運(yùn)輸?shù)闹饕ǖ溃砻鎀PI的廣泛分布為胞漿運(yùn)輸提供了足夠的能量支持，對(duì)神經(jīng)元的發(fā)育及軸突的生長(zhǎng)具有重要作用。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病中，TPI抗體可直接與神經(jīng)元內(nèi)與微管結(jié)構(gòu)緊密結(jié)合的TPI發(fā)生免疫反應(yīng)，破壞TPI的酶活性，從而造成微管結(jié)構(gòu)破壞，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并通過(guò)激活補(bǔ)體和巨噬細(xì)胞引起神經(jīng)元和軸突變性[4],大量研究顯示，TPI抗體表達(dá)增高現(xiàn)象普遍存在于多種自身免疫性疾病中，如非球形紅細(xì)胞溶血性貧血、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[5]。

然而，腦脊液TPI抗體的表達(dá)在MS與非MS疾病之間未見(jiàn)明顯差異，提示目前尚不能認(rèn)為腦脊液TPI抗體可以作為MS患者輔助診斷的特異性及敏感性指標(biāo)。分析研究結(jié)果與初期預(yù)測(cè)結(jié)果不符的可能原因包括：(1)TPI廣泛分布于外周及中樞神經(jīng)系統(tǒng)，需進(jìn)一步測(cè)定外周血TPI抗體表達(dá)水平，計(jì)算腦脊液與外周血TPI抗體測(cè)定差值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)一步明確TPI抗體對(duì)MS的輔助診斷價(jià)值。(2)樣本量較少，對(duì)MS亞型分組不明確，對(duì)于不同MS亞型腦脊液TPI抗體表達(dá)水平的差異性尚需大量樣本資料進(jìn)一步分析研究。

3.2 MS免疫機(jī)制研究進(jìn)展 MS發(fā)病機(jī)制及臨床治療策略的研究主要是基于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所制備的變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓炎動(dòng)物模型。其研究結(jié)果認(rèn)為，MS是一種由輔助性T1細(xì)胞(Th1細(xì)胞)介導(dǎo)的攻擊中樞神經(jīng)白質(zhì)系統(tǒng)為主的自身免疫性脫髓鞘疾病。在此基礎(chǔ)上產(chǎn)生的臨床治療機(jī)制多集中在阻止Th1細(xì)胞進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)或?qū)h1細(xì)胞轉(zhuǎn)化為T(mén)h2細(xì)胞，減輕免疫炎性反應(yīng)[6]。直至21世紀(jì)初期，基于MS灰質(zhì)系統(tǒng)病變的研究成果，B細(xì)胞所參與的針對(duì)軸索和神經(jīng)元的自身免疫反應(yīng)在MS發(fā)病機(jī)制中的重要作用才開(kāi)始得到重視。美國(guó)分子生物學(xué)專家通過(guò)研究MS患者腦脊液及尸檢腦組織內(nèi)由B細(xì)胞表達(dá)的免疫球蛋白重鏈基因片段得出結(jié)果：MS患者體內(nèi)存在增殖分化的B細(xì)胞。高分化的克隆B細(xì)胞首先在進(jìn)展型MS患者腦脊液內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，且出現(xiàn)時(shí)間往往早于MS腦脊液寡克隆區(qū)帶的升高及異常影像學(xué)信號(hào)的形成。在MS疾病進(jìn)展階段，鞘內(nèi)寡克隆免疫球蛋白合成明顯增多，表明MS中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Th2依賴性B細(xì)胞及漿細(xì)胞的持續(xù)性增殖和分化[7]。推測(cè)TPI可能為驅(qū)動(dòng)該增殖分化的相關(guān)抗原?？寺⌒詽{細(xì)胞表達(dá)的抗體可與多數(shù)MS患者大腦神經(jīng)元及軸突結(jié)合，結(jié)合部位主要包括軸膜、神經(jīng)絲蛋白-L、腦衰蛋白反應(yīng)性介導(dǎo)蛋白(CRMP)-5及神經(jīng)節(jié)甘酯等[8]。病理學(xué)研究顯示，MS患者腦膜內(nèi)存在異位的淋巴濾泡結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)生發(fā)中心內(nèi)含有增生分化的B細(xì)胞、漿細(xì)胞，T細(xì)胞以及樹(shù)突狀細(xì)胞[4]。B細(xì)胞亞群表現(xiàn)出明顯的VLA-4受體(淋巴細(xì)胞歸巢受體)內(nèi)4亞基成分的高表達(dá)[3]，在B細(xì)胞遷移穿過(guò)血腦屏障過(guò)程中發(fā)揮重要作用。多數(shù)MS患者B細(xì)胞及漿母細(xì)胞在腦實(shí)質(zhì)、腦膜和腦脊液內(nèi)均存在明顯克隆擴(kuò)增現(xiàn)象[9]。病理狀態(tài)下，Th2細(xì)胞依賴性抗原驅(qū)動(dòng)鞘內(nèi)B細(xì)胞進(jìn)行增殖分化形成漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞分泌的可溶性克隆IgG抗體構(gòu)成診斷MS的重要寡克隆區(qū)帶[10]。MS患者腦脊液內(nèi)IgG抗體表達(dá)增加以及應(yīng)用抗CD-20抗體類藥物如利妥昔單抗治療的有效性均表明B細(xì)胞和漿細(xì)胞在MS的致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在此基礎(chǔ)上，如何更好地選擇性阻斷或抑制MS致病過(guò)程中Th2依賴性B細(xì)胞的持續(xù)增殖分化及抗TPI抗體相關(guān)藥物的研發(fā)，將有可能成為MS新的研究方向及臨床治療的新突破，為MS患者帶來(lái)曙光。

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050000 石家莊，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

賀丹，E-mail:danhe@126.com

10.3969 / j.issn.1671-6450.2014.08.026

2014-02-27)