崔海洋, 程仕偉, 黃田紅, 李秀娟, 楊立紅, 陳國忠

(魯東大學生命科學學院,山東煙臺 264025)

產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌分離鑒定及酶學性質(zhì)研究

崔海洋, 程仕偉*, 黃田紅, 李秀娟, 楊立紅, 陳國忠

(魯東大學生命科學學院,山東煙臺 264025)

對一株產(chǎn)纖維素酶菌株進行分離鑒定,并對其酶學特性進行了初步研究.剛果紅染色法篩選產(chǎn)纖維素酶菌株B16,采用形態(tài)觀察、生理生化指標和16S rDNA確定其菌屬來源,分析纖維素酶的最適反應pH值和溫度、酸堿和熱穩(wěn)定性、金屬離子對酶活性的影響,最后考察纖維素酶系的分布.結(jié)果表明:篩選菌株為解淀粉芽孢桿菌,其較適反應溫度為30℃,較適pH 8.0,在10～60℃呈高穩(wěn)定性,在pH 5～8時穩(wěn)定性較強,Mn2+和Ba2+是該酶的激活因子.除微晶纖維素酶活力(16.39 U/mL)稍弱外,濾紙酶(70.37 U/mL)、β-葡萄糖苷酶(131.55 U/mL)、羧甲基纖維素酶(307.23 U/mL)活力均相對較高.結(jié)果表明,該酶在飼料添加劑方面具有應用潛力.

纖維素酶;分離鑒定;解淀粉芽孢桿菌;酶學性質(zhì)

纖維素酶是由作用方式不同但能協(xié)同催化降解纖維素的3類酶組成的酶系,可降解纖維素生成低聚糖或葡萄糖[1].包括作用于纖維素分子內(nèi)部非結(jié)晶區(qū)的內(nèi)切葡萄糖苷酶(又稱羧甲基纖維素酶),作用于線狀分子末端的外切葡萄糖苷酶(又稱纖維二糖水解酶或微晶纖維素酶)和將纖維二糖水解成葡萄糖的β-葡萄糖苷酶[2-3].

纖維素酶廣泛應用于飼料、食品、紡織、造紙和洗滌等行業(yè)[4-5],作為一種綠色飼料添加劑,將飼料中的部分纖維素降解成可消化吸收的還原糖,提高飼料利用率[6].其營養(yǎng)機理[7-11]:補充內(nèi)源酶的不足,溶解植物細胞壁促進吸收;減低動物胃腸道黏稠度,消除抗營養(yǎng)因子;降低有害微生物的附著生長;維持小腸絨毛形態(tài)完整等.

多種微生物均可產(chǎn)纖維素酶,其中細菌來源的纖維素酶具有耐堿、耐熱性等優(yōu)良催化特性,培養(yǎng)周期短且條件可控[12],因而在飼料用酶的研究中受到廣泛重視.本文通過對高產(chǎn)纖維素酶的一株細菌進行分離鑒定及催化特性研究,為后期發(fā)酵生產(chǎn)及其在飼料添加劑方面的實際應用提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 材料

水楊素和3,5-二硝基水楊酸,上海生物工程公司;微晶纖維素,Sigma公司;細菌基因組抽提試劑盒,Axygen公司;EX Taq酶和dNTP,TaKaRa;Marker DL5000,廣州東盛科技公司.其余試劑均為分析純或生物純.

1.2 培養(yǎng)基

菌種保藏培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L, NaCl 10 g/L,瓊脂20 g/L,pH 7.0.121℃下滅菌15 min.

篩選培養(yǎng)基:CMC 10 g/L,酵母粉 5 g/L, Na2CO33 g/L,MgSO4·7H2O 0.1 g/L,FeSO4·7H2O 5mg/L,MnSO45mg/L,瓊脂20 g/L,pH 9.0.121℃下滅菌15min.

活化培養(yǎng)基:酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0.121℃下滅菌15min.

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L,大豆蛋白胨8 g/L,酵母粉6 g/L,MgSO4·7H2O 4 g/L,MnSO44 g/L, KH2PO410 g/L,NaH2PO48 g/L,pH 6.0.115℃下滅菌20 min.

1.3 實驗方法

1.3.1 目標菌株獲得

收集山東煙臺第一海水浴場附近的豐富有機質(zhì)土壤,梯度稀釋后涂布至篩選培養(yǎng)基,30℃培養(yǎng)至長出單菌落.剛果紅染色并NaCl洗滌后觀察,挑取透明圈與菌落直徑比大的菌落接種至添加20 g/L葡萄糖的無瓊脂篩選培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h后測酶活,選取酶活較高菌株B16.

1.3.2 培養(yǎng)條件

將種子培養(yǎng)液按體積分數(shù)為2%的比例接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,于28℃、220 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h.發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心5min后,取上清用于酶活測定,測定均重復3次并取平均值.

1.3.3 菌屬鑒定

單菌落形態(tài)觀察,經(jīng)染色(簡單、革蘭氏和芽孢)后鏡檢.生化鑒定參照文獻[13]中的描述方法.抽提菌株基因組DNA進行電泳分析,以PCR通用引物進行擴增,電泳檢測并切膠測序.通過BLAST法將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫序列進行同源比較,建立系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.3.4 纖維素酶活性測定

羧甲基纖維素酶(CMCase)[14]:適當稀釋的酶液1mL加1%CMC液(pH 8.0)1 mL,50℃反應15 min,加3mL DNS試劑,煮沸顯色5 min.加水定容至25mL,在540 nm測吸光值.空白處理:等量酶液煮沸10min滅活,后續(xù)過程同樣品測定.根據(jù)標準曲線計算酶活,以1mL酶液1 min水解纖維素生成1μg葡萄糖的量為1個活力單位(U).

濾紙酶(FPase)[15]:50mg濾紙浸入1mL緩沖液(pH 8.0),加1 m L稀釋的酶液,50℃反應60 min,離心去不溶物,其余同CMCase測定.

β-葡萄糖苷酶(β-Gase)活力[16]:以1mL 0.5%水楊素為底物,其余同CMCase測定.

微晶纖維素酶(C1)活力[17]:1 m L微晶纖維素溶液(1%)加1mL稀釋酶液,50℃下反應120 min 后,離心去不溶物,其余同CMCase測定.

1.3.5 酶學性質(zhì)初步研究

測定CMCase活力作酶學性質(zhì)的研究指標.

1.3.5.1 最適溫度及熱穩(wěn)定性

不同溫度下反應15 min后測定CMCase酶活性,確定最適反應溫度.酶液在不同溫度條件下(pH 8.0的緩沖液)保存60min后,測定CMCase酶活性,分析溫度穩(wěn)定性.

1.3.5.2 最適pH值及酸堿穩(wěn)定性

不同pH值下反應15min后測定CMCase酶活性,確定最適反應pH值.酶液在不同pH值條件下(40℃)保存60 min后,測定CMCase酶活性,確定酸堿穩(wěn)定性.

1.3.5.3 金屬離子對酶活性的影響

在酶活測定體系中分別添加0.000 1 mol/L和0.01mol/L兩個濃度梯度的金屬鹽,考察金屬離子對酶活性的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離鑒定

剛果紅染色法篩選的纖維素酶高活力菌株B16 在LB培養(yǎng)基平板上呈乳白色,中央凸起,圓形,表面濕潤,周圍光滑,不透明無光澤.生理生化結(jié)果(見表1)與文獻[18]中描述特征比對,初步判定為芽孢桿菌屬.革蘭氏染色呈陽性,桿狀不成鏈且產(chǎn)芽孢(約中央位置)(見圖1).

表1 菌株B16的生理生化指標Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain B16

圖1 B16菌株的個體形態(tài)Fig.1 Microscopic morphology of strain B16

以總DNA為模板,采用16S rDNA的通用引物進行PCR擴增,膠回收純化后測序,得到一條1 389 bp的條帶,具備16S rDNA的特征(見圖2).NCBI上通過序列比對得到同源性超過99%的部分序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果如圖3.菌株B16與Bacillus amyloliquefaciens(JQ062536.1)的16S rDNA部分序列同源性達到100%,可確定其為解淀粉芽孢桿菌,命名為Bacillus amyloliquefaciens B16.

圖2 PCR擴增電泳分析Fig.2 Analysis of PCR production

圖3 系統(tǒng)發(fā)育樹的同源性比較Fig.3 Homology comparison with phylogenetic tree

2.2 最適反應溫度

溫度對酶活測定結(jié)果的影響見圖4.

圖4 酶活測定的溫度影響Fig.4 Relative activity of CMCase at different temperature

B16菌代謝產(chǎn)生纖維素酶的較適反應溫度為30℃,當?shù)陀?0℃時酶催化底物水解速率較慢.該酶在30～70℃之間隨著溫度升高酶活性緩慢降低, 在70℃時仍有84%的酶活性,因此該纖維素酶的溫度適應性較強.當溫度超過70℃時,纖維素酶的活性與最適反應溫度下的酶活性相比,迅速降低,原因是溫度過高導致酶失活.

2.3 溫度穩(wěn)定性

溫度穩(wěn)定性結(jié)果見圖5.

圖5 溫度穩(wěn)定性Fig.5 Temperature stability of CMCase

該纖維素酶在10～60℃穩(wěn)定性較高,60℃下保溫60min后相對酶活性為97.47%,因此,B16菌代謝產(chǎn)生纖維素酶的溫度穩(wěn)定性較好.當保溫溫度超過60℃時,纖維素酶的穩(wěn)定性降低,70℃保溫后相對酶活性為75.2%,90℃保溫60min后酶活性只有最大酶活的22.34%.

2.4 最適反應pH值分析

初始反應pH值對酶活力影響見圖6.

圖6 酶活測定的pH值影響Fig.6 Relative activity of CMCase at different pH

B16菌代謝產(chǎn)生纖維素酶的最適反應pH值為8.0,偏堿性.該酶具有較強的pH值適用范圍,在pH 4～13纖維素酶活性變動幅度較小,pH 4時相對活性為86.85%,pH 13時為最大活性的86.26%.總體來看,在堿性條件下要優(yōu)于酸性條件下的反應體系.B16菌代謝產(chǎn)生纖維素酶的pH值適應性較廣,具有工業(yè)應用前景.

2.5 酸堿穩(wěn)定性

酸堿穩(wěn)定性結(jié)果見圖7.

圖7 酸堿穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of CMCase

該纖維素酶在pH 5～8的內(nèi)穩(wěn)定性較高,在pH 5條件下穩(wěn)定性最好,pH 8體系中保溫60 min后還有93.81%的酶活性.當pH值低于5時纖維素酶的穩(wěn)定性變差,pH 3下保溫60 min后僅有46.34%的酶活性.當pH值高于8時,保溫60min后其相對活性緩慢降低,pH 13下保溫60min后仍有66.43%的酶活性.總之,B16菌代謝產(chǎn)生纖維素酶在中性或偏堿性條件下穩(wěn)定性較好.

2.6 金屬離子對酶活的影響

金屬離子對酶活的影響見圖8.

圖8 金屬離子對酶活性的影響Fig.8 Effect ofmetal ions to the CMCase activity

在0.000 1 mol/L濃度時,Mg2+、K+、Na+、Cu2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+和Ba2+均對纖維素酶活性有激活作用,其激活強度為Na+(130.90%)＞Zn2+(128.35%)＞Ba2+(187.20%)＞Mn2+(119.63%)＞Cu2+(118.80%)＞K+(113.93%)＞Ca2+(109.24%)＞Mg2+(103.26%),而Fe2+(65.37%)、Li+(95.33%)和Co2+(57.07%)對纖維素酶存在一定的抑制作用.在0.01mol/L濃度時,Mn2+(126.65%)、Li+(163.97%) 和Ba2+(113.51%)對酶活性有一定激活作用,而Na+(38.26%)、Zn2+(77.71%)、Cu2+(41.97%)、K+(78.48%)、Ca2+(64.23%)、Mg2+(38.60%)、Fe2+(62.40%)和Co2+(40.24%)對該纖維素酶活性存在一定的抑制作用.

綜合所述:1)Mn2+和Ba2+在兩種濃度梯度下對酶均有激活作用;2)Li+在低濃度時抑制酶活性,而高濃度下反而起酶的激活劑作用;3)Na+、Zn2+、Cu2+、K+、Ca2+和Mg2+在0.000 1 mol/L時對該纖維素酶起激活作用,在0.01 mol/L下抑制酶活性; 4)Fe2+和Co2+在低濃度和高濃度下對酶活性均起抑制作用,隨著金屬離子濃度增加其抑制作用加強.因此,在酶的發(fā)酵生產(chǎn)中,金屬離子種類及其添加濃度的選擇至關重要.

2.7 纖維素酶系各酶活力分析

為確定B16菌株的纖維素酶系活力,在測定羧甲基纖維素酶(CMCase)基礎上,進行了濾紙酶(FPase)、β-葡萄糖苷酶(β-Gase)、微晶纖維素酶(C1)活力測定,結(jié)果見圖9.

圖9 纖維素酶系活力比較Fig.9 Compared assay of cellulase activity

由圖9可以看出,解淀粉芽孢桿菌來源CMCase、FPase、β-Gase、C1別為307.23,70.37,131.55, 16.39 U/m L.除微晶纖維素酶活力稍弱外,其余3種酶活力均相對較高.

3 結(jié) 論

選育了一株具有潛在應用于飼料添加劑的產(chǎn)纖維素酶菌株B16,經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌,其較適反應溫度為30℃,較適pH為8.0.該酶在10～60℃穩(wěn)定性較高,60℃下保溫60min后相對酶活性為97.47%.在pH 5～8穩(wěn)定性較高,pH 8體系中保溫60min后還有93.81%的酶活性.Mn2+和Ba2+是酶的激活因子,Fe2+和Co2+是酶的抑制因子.除微晶纖維素酶活力稍弱外,其余酶活力均相對較高,CMCase、FPase、β-Gase、C1活力分別為307.23,70.37, 131.55,16.39 U/mL.研究結(jié)果表明,B16菌株代謝產(chǎn)生的纖維素酶在飼料添加劑方面具有應用潛力.

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Screening and Identifying of Bacillus amyloliquefaciens for Cellulase Production and its Enzymatic Characters

CUIHaiyang, CHENG Shiwei*, HUANG Tianhong, LIXiujuan, YANG Lihong, CHEN Guozhong
(School of Life Science,Ludong University,Yantai264025,China)

A cellulase-producing strain was isolated and identified and their enzymatic characters were analyzed.The selected strain straining with congo red was studied with the morphological,physiological and biochemical characteristics aswell as16S rDNA sequence homology.Moreover,the effecting factors for the cellulase activity,such as optimal temperature,optimal pH,pH stability,and thermal stability and effects ofmetal ions were studied.Finally,the distribution of cellulase system was examined.The results indicated that the strain isBacillus amyloliquefaciensand the optimal temperature and pH was 30 ℃ and pH 8.0.Higher stability of the cellulasewas obtained at10-60℃ and pH stabilitywas better at pH 5-8.Mn2+and Ba2+were the activated factors for the enzyme.The activity of CMCase,FPcellulase andβ-glucosidase were 307.23U/mL,70.37U/mL,and 131.55 U/m L,respectively,which had higher cellulase activity expect as avicelase(16.39 U/mL).So the results suggested that the cellulase fromBacillusamyloliquefacienshad potential applications in the feed additive.

cellulase;screening and identifying;Bacillus amyloliquefaciens;enzymatic character

檀彩蓮)

TS235;Q814.4

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.03.008

2095-6002(2014)03-0043-05

崔海洋,程仕偉,黃田紅,等.產(chǎn)纖維素酶的解淀粉芽孢桿菌分離鑒定及酶學性質(zhì)研究.食品科學技術學報,2014,32 (3):43-47. CUIHaiyang,CHENG Shiwei,HUANG Tianhong,et al.Screening and identifying of Bacillus amyloliquefaciens for cellulase production and its enzymatic characters.Journal of Food Science and Technology,2014,32(3):43-47.

2013-08-07

山東省高等學校科技計劃項目(J12LD02).

崔海洋,男,碩士研究生,研究方向為酶工程;*程仕偉,男,博士,主要從事生物化工方面的研究.通訊作者.