王友升, 田元元, 蔡琦瑋

(北京工商大學食品學院/北京市食品添加劑工程技術研究中心/食品質量與安全北京實驗室,北京 100048)

前體脂肪細胞3T3-L1誘導分化條件的優(yōu)化

王友升, 田元元, 蔡琦瑋

(北京工商大學食品學院/北京市食品添加劑工程技術研究中心/食品質量與安全北京實驗室,北京 100048)

利用L18(37)正交試驗,考察了聯(lián)合誘導時3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松和胰島素用量以及聯(lián)合誘導時間,胰島素單獨誘導時間以及胰島素用量對3T3-L1前體脂肪細胞分化為成熟脂肪細胞的影響.極差分析的結果表明,各條件對3T3-L1前體脂肪細胞分化的影響程度由大到小排序為:IBMX、聯(lián)合誘導時間、胰島素單獨作用量、聯(lián)合誘導時胰島素作用量、地塞米松、胰島素單獨作用時間;方差分析的結果表明,IBMX的誘導效應極顯著,聯(lián)合誘導時間和胰島素單獨作用量呈顯著水平,而其他條件(聯(lián)合誘導時胰島素作用量、地塞米松和胰島素以及單獨作用時間)對結果的影響并不顯著.3T3-L1前體脂肪細胞分化的最適誘導條件為:500～750μmol/L IBMX、0.25～1μmol/L地塞米松與1μg/m L胰島素,在聯(lián)合誘導72 h后,再用5～10μg/mL胰島素誘導48 h.油紅染色鏡檢結果顯示,在該條件下前體脂肪細胞誘導分化率均高于聯(lián)合誘導時胰島素作用量、地塞米松和胰島素以及單獨作用時間.

3T3-L1;IBMX;胰島素;誘導分化

防治以胰島素抵抗(insulin resistant,IR)為標志的代謝癥候群癥是目前食品功能因子的熱點之一.IR指正常劑量的胰島素產生低于正常生物效應的一種狀態(tài),即靶組織對胰島素的敏感性和(或)反應性降低所表現(xiàn)的病理狀態(tài)[1].脂肪細胞分化失常將會產生胰島素抵抗,引起體內脂肪蓄積,進而導致肥胖、高血壓等代謝癥候群[2].3T3-L1細胞是分離自Swiss小鼠的脂肪纖維細胞,是IR細胞模型之一,可應用于代謝癥候群機理研究及生物活性物質的篩選[3].而3T3-L1前體脂肪細胞成功誘導分化為成熟脂肪細胞是構建胰島素抵抗模型的前提.

3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化為成熟脂肪細胞可分為兩個階段:第一階段為500μmol/L M3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、0.25～1μmol/L地塞米松與1～10μg/mL胰島素聯(lián)合誘導,第二階段則用與聯(lián)合誘導期相同濃度的胰島素單獨誘導,但不同研究者采用的誘導條件差別較大[4-7].目前對于聯(lián)合誘導階段不同誘導劑的作用效果及其互作效應,尤其胰島素在兩個階段中所發(fā)揮的作用,并沒有系統(tǒng)報道.

本研究通過考察3T3-L1前體脂肪細胞聯(lián)合誘導和單獨誘導階段各誘導劑組合效應及誘導時間的影響,可望闡明各影響因子的互作效應及其在誘導脂肪細胞形成過程中的作用,為建立胰島素抵抗模型及相關食品功能因子的篩選提供依據.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

3T3-L1前體脂肪細胞,北京協(xié)和細胞中心;地塞米松、胰島素、IBMX、油紅O、多聚甲醛,美國Sigma公司;高糖培養(yǎng)基(DMEM)、新生小牛血清、胰蛋白酶,美國Gibco公司;異丙醇、無水乙醇等其他試劑均為分析純.

1.2 儀器設備

Axiovert 200型倒置顯微鏡,德國Zeiss儀器有限公司;Galaxy S型CO2培養(yǎng)箱,英國RSBiotech公司;SPECTRA MAX 190型連續(xù)波長酶標儀,美國Molecular Devices公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 3T3-L1前體脂肪細胞的培養(yǎng)

將3T3-L1前體脂肪細胞置于體積分數(shù)為10%胎牛血清的DMEM中,在37℃,5%CO2,95%濕度條件下培養(yǎng).2～3 d換液1次,細胞匯合達80%左右時,用質量分數(shù)為0.25%胰蛋白酶消化,傳代培養(yǎng).

1.3.2 3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化條件的優(yōu)化

3T3-L1前體脂肪細胞按1×104個/孔接種于

96孔板,待細胞匯合后,接觸抑制 2～3 d,參考

Student等[8]分化前體脂肪細胞的方法,設計正交試驗,優(yōu)化3T3-L1細胞的誘導分化條件.選取IBMX、地塞米松、聯(lián)合誘導時胰島素作用量、聯(lián)合誘導時間、胰島素單獨誘導時間以及胰島素單獨作用量6個影響因素為自變量,每個自變量設計3個水平,做出3水平7因素的正交試驗設計,實驗因素和水平如表1.

表1 3T3-L1前體細胞誘導分化條件因素水平表L18(37)Tab.1 Levels and factors of induction and differentiation of3T3-L1 preadipocytes L18(37)

1.3.3 油紅O染色

待90%左右的3T3-L1前體脂肪細胞分化成為成熟的脂肪細胞時,參照Ramirez-Zacarias等[9]的方法進行油紅O染色.細胞誘導分化結束后去除培養(yǎng)基,用質量分數(shù)為4%的多聚甲醛固定1 h,加入油紅O溶液染色2 h,無菌水清洗后,倒置顯微鏡下觀察.此后,加入異丙醇洗脫,在520 nm波長檢測.

1.3.4 數(shù)據處理

采用正交試驗設計助手域(v3.1)軟件進行方差分析.

2 結果與分析

2.1 3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化條件正交試驗結果

3T3-L1前體肪細胞誘導分化條件正交試驗結果如表2,極值分析的結果表明,各因素對誘導分化結果影響的主次順序為:IBMX(A)、聯(lián)合誘導時間(D)、胰島素單獨作用量(E)、聯(lián)合誘導時胰島素作用量(C)、地塞米松(B)、胰島素單獨作用時間(F), 即IBMX用量對3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化為成熟脂肪細胞影響最大,而胰島素單獨作用時間的影響最弱.同時,比較均值可初步確定各因素的最優(yōu)水平為A2B3C1D3E1,即IBMX 500μmol/L,地塞米松1μmol/L,聯(lián)合誘導中胰島素用量為1μg/mL,誘導時間為72 h,胰島素單獨用量為10μg/mL,由于胰島素單獨作用時間各水平之間沒有顯著差異,因此選擇誘導48 h為宜.

3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化條件正交試驗的方差分析如表3.可以看出,IBMX用量對誘導分化的影響達極顯著水平,聯(lián)合誘導時間和胰島素單獨作用量的影響達到顯著水平,而地塞米松、聯(lián)合誘導中胰島素作用量及單獨作用時間的影響并不顯著.表明IBMX為影響誘導分化的最關鍵因素,聯(lián)合誘導時間和胰島素單獨作用量為主要影響因素.

2.2 油紅O染色的顯微鏡觀測結果

不同誘導條件下成熟脂肪細胞的油紅O染色結果如圖1.未經誘導分化的3T3-L1前體脂肪細胞呈梭形或不規(guī)則三角形,胞內無脂滴(圖1A).當細胞匯合后進入接觸抑制期,細胞處于生長停滯狀態(tài),經IBMX、地塞米松和胰島素聯(lián)合誘導、胰島素單獨誘導后,在視野下可觀測到細胞開始生成小的環(huán)狀脂滴.4～6 d后小脂滴匯聚成大脂滴,細胞變得透明,具備成熟脂肪細胞的典型形態(tài)特征.8～10 d后,部分誘導條件下的前體脂肪細胞分化率可達90%～95%,用油紅O可將胞內脂肪特異性染成紅色脂滴(圖1B至圖1S).而未經 IBMX誘導的3T3-L1前體脂肪細胞分化程度(圖1B至圖1D,圖1K至圖1M)明顯低于其他處理;相比而言,聯(lián)合誘導時間72 h,胰島素單獨作用量為10μg/mL時,生成的脂肪細胞數(shù)量較高(圖1N和圖1R),與吸光度測定的結果相一致.同時可以看出,圖1E、圖1J、圖1N和圖1R所示的誘導條件下的脂肪細胞分化量相對較高,其油紅O染色的OD值也相應高于其他處理(表2),進一步驗證上述結論.

表2 3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化條件正交試驗L18(37)結果Tab.2 Results of induction and differentiation of3T3-L1 preadipocytes L18(37)

表3 3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化條件正交試驗方差分析表Tab.3 Mean standard deviation analysis of induction and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes

3 討 論

本研究的結果表明,在3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化過程中,各因素對誘導分化結果影響的主次順序為:IBMX、聯(lián)合誘導時間、胰島素單獨作用量、聯(lián)合誘導時胰島素作用量、地塞米松、胰島素單獨作用時間.3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化條件主要受IBMX、聯(lián)合誘導時間和胰島素單獨作用量的顯著影響,其中IBMX的影響達極顯著水平.研究表明,IBMX是一種非選擇性的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶抑制劑,可提高胞內環(huán)磷酸腺苷(cyclic AMP, cAMP)濃度[10],而cAMP濃度升高后可激活蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)[11],PKA通過PGC-1α激活過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome proliferator activated receptorγ,PPARγ)[12].在3T3-L1前體脂肪細胞終末分化階段中,轉錄因子如PPARγ大量表達,進而糖代謝相關基因表達,導致脂滴形成并逐漸積累[13].但對于IBMX通過調節(jié)胞內cAMP水平而誘導3T3-L1前體脂肪細胞分化的具體作用路徑,需進一步探討.

圖1 3T3-L1前體脂肪細胞油紅O染色結果Fig.1 Results of oil red O staining of3T3-L1 preadipocytes

目前誘導3T3-L1前體脂肪細胞的條件中,聯(lián)合誘導時間大多為48 h,且胰島素用量與胰島素單獨誘導作用量相同,如Frost等[4]和劉芳芳等[6]在聯(lián)合誘導和胰島素單獨誘導期間均用1μg/mL胰島素作用細胞,陳思凡等[5]和郭曉農等[7]所用胰島素質量濃度則為10μg/mL.然而,本研究發(fā)現(xiàn),聯(lián)合誘導期間胰島素為低質量濃度(1μg/m L),胰島素單獨誘導作用量為高質量濃度(10μg/mL)時,生成脂肪量較多.這可能由于在聯(lián)合誘導期間,地塞米松和IBMX存在,低質量濃度(1μg/mL)胰島素即可達到誘導效果;而在胰島素單獨作用時則高質量濃度(10μg/mL)誘導分化效果優(yōu)于其他處理(即胰島素單獨作用質量濃度為5μg/mL和1μg/mL),但由于5～10μg/m L胰島素單獨誘導差異不顯著,因此,胰島素單獨作用量選取5～10μg/m L均可.此外,地塞米松作用量和胰島素單獨作用時間均沒有顯著差異,且對誘導結果沒有顯著影響,因此地塞米松作用量選取0.25～1μmol/L均可,誘導時間選取48 h為宜.

4 結 論

1)IBMX用量對3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化影響達極顯著水平;聯(lián)合誘導時間和胰島素單獨作用量的影響達顯著水平;地塞米松、聯(lián)合誘導時胰島素作用量及胰島素單獨作用時間影響不顯著.

2)3T3-L1前體脂肪細胞誘導分化成為成熟脂肪細胞的最適宜條件為:500～750μmol/L IBMX, 0.25～1μmol/L地塞米松,1μg/mL胰島素,在聯(lián)合誘導72 h后,再用5～10μg/mL胰島素誘導48 h.

[1] 舒思潔.肥胖導致域型糖尿病胰島素抵抗的作用機理及其防治對策[J].時珍國醫(yī)國藥,2006,17(2):264-265.

[2] López-Miranda J,Pérez-Martínez P,Marin C,et al. Dietary fat,genes and insulin sensitivity[J].Journal of Molecular Medicine,2007,85(3):213-226.

[3] 鄭國棟,徐峰,吳少福,等.綠茶成分對3T3-L1細胞的細胞增殖及脂肪代謝的影響[J].中國食品學報, 2012,12(10):10-15.

[4] Frost S C,Lane M D.Evidence for the involvement of vicinal sulfhydryl groups in insulin-activated hexose transport by 3T3-L1 adipocytes[J].Journal of Biological Chemistry,1985,260(5):2646-2652.

[5] 陳思凡,肖新才,孫延雙,等.白藜蘆醇對小鼠3T3-L1細胞增殖與分化的影響及其機制[J].中國藥理學通報,2010,26(1):108-111.

[6] 劉芳芳,楊明煒,王曉強,等.梓醇與小檗堿及其配伍對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞的影響[J].中草藥,2007,38(10):1523.

[7] 郭曉農,張汝學,賈正平,等.地黃寡糖對3T3-L1脂肪細胞增殖及胰島素抵抗的作用[J].中國中藥雜志, 2006,31(5):403-407.

[8] Student A K,Hsu R Y,Lane M D.Induction of fatty acid synthetase synthesis in differentiating 3T3-L1 preadipocytes[J].Journal of Biological Chemistry,1980,255 (10):4745-4750.

[9] Ramirez-Zacarias J L,Castro-Munozledo F,Kuri-Harcuch W.Quantitation of adipose conversion and triglycerides by staining intracytoplasmic lipids with oil red O [J].Histochemistry,1992,97(6):493-497.

[10] 皮榮標,林穗珍.3-異丁基-1-甲基黃嘌呤對低鉀誘導的大鼠小腦顆粒神經元凋亡的Ca2+/cAMP不依賴性保護作用[J].中國藥學雜志,2001,36(4):240-244.

[11] 楊夏,彭生,劉功儉.cAMP/PKA/CREB信號通路及相關調控蛋白PDE4和ERK對學習記憶的影響[J].醫(yī)學綜述,2011,17(5):2241.

[12] Park S J,Ahmad F,Philp A,et al.Resveratrol ameliorates aging-related metabolic phenotypes by inhibiting cAMPphosphodiesterases[J].Cell,2012,148(3): 421-433.

[13] 鞠大鵬,詹麗杏.脂肪細胞分化及其調控的研究進展[J].中國細胞生物學學報,2010(5):690-695.

Optim ization of Induction Condition of 3T3-L1 Preadipocytes Differentiation

WANG Yousheng, TIAN Yuanyuan, CAIQiwei
(School of Food and Chemical Engineering/Beijing Engineering and Technology Research Center ofFood Additives/
Beijing Laboratory for Food Quality and Safety,Beijing Technology and BusinessUniversity,Beijing 100048,China)

The present study investigated the influences of the concentration of 3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX),dexamethasone and insulin during the combined induction stage(first stage)and the corresponding induction time,the induction time and concentration of insulin during the differentiation stage(second stage)on 3T3-L1 preadipocytes differentiation using L18(37)orthogonal experiment. Range analyses showed that the impacts of those factors on results were(from high to low):IBMX, induction time of the first stage,insulin concentration during the second stage,insulin concentration during the first stage,dexamethasone concentration and induction time of the second stage.Analysis of variance showed that IBMX played a highly significant influence on the process of 3T3-L1 preadipocytes differentiation,and the influence of induction time of the firststage and insulin concentration during the second stage were significant.In contrast,no significant differencewas observed in the treatments of dexamethasone and insulin concentration.The optimal induction condition for differentiation of 3T3-L1 preadipocyteswas presented as following:500-750μmol/L IBMX,0.25-1μmol/L dexamethasone,and 1μg/mL insulin for 72 h,and then 5-10μg/mL insulin for 48 h.The result of red oil O staining showed that the differentiation rate of3T3-L1 preadipocytes of the presented optimal condition was higher than that of the rest.

3T3-L1;IBMX;insulin;induction

葉紅波)

TS201.2;TS218

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.03.007

2095-6002(2014)03-0038-05

王友升,田元元,蔡琦瑋.前體脂肪細胞3T3-L1誘導分化條件的優(yōu)化.食品科學技術學報,2014,32(3):38-42. WANG Yousheng,TIAN Yuanyuan,CAIQiwei.Optimization of induction condition of 3T3-L1 preadipocytes differentiation.Journal of Food Science and Technology,2014,32(3):38-42.

2013-07-01

國家自然科學基金資助項目(31291944).

王友升,男,副教授,博士,主要從事食品生物技術方面的研究.