陳士恒, 章 晴, 史曉梅, 楊永壇, 俞偉祖

(中糧營養(yǎng)健康研究院/北京市營養(yǎng)健康與食品安全重點實驗室,北京 100020)

DSPE-GC/MS快速檢測葡萄酒中52種農(nóng)藥殘留

陳士恒, 章 晴, 史曉梅, 楊永壇*, 俞偉祖

(中糧營養(yǎng)健康研究院/北京市營養(yǎng)健康與食品安全重點實驗室,北京 100020)

利用分散固相萃取GC-MS分析,建立了葡萄酒中52種不同極性農(nóng)藥殘留的快速檢測方法.葡萄酒樣品用酸化乙腈經(jīng)振蕩提取和超聲輔助提取后,上清液用混合吸附填料進行分散固相萃取凈化,高速離心后,再通過氮吹方式濃縮,復(fù)溶,過濾膜,用GC/MS檢測.與傳統(tǒng)前處理方法相比,分散固相萃取技術(shù)在檢測成本和處理速度上有很大優(yōu)勢.52種農(nóng)藥在3個濃度添加水平上的加標回收率范圍是60%～110%,RSD＜15%(n=5),定量限是0.000 7～0.032 3mg/kg.

多農(nóng)藥殘留;分散固相萃取;葡萄酒;快速測定

葡萄酒是指以葡萄或葡萄汁為原料,經(jīng)全部或部分發(fā)酵釀制而成、酒精度(體積分數(shù))大于等于7%的酒精飲品[1].葡萄酒中富含如礦物質(zhì)、糖、維生素、氨基酸等對人體有益的營養(yǎng)成分,已知的約有600種.因此,葡萄酒的營養(yǎng)價值也受到消費者廣泛的認可和青睞.

在種植釀酒葡萄過程中,農(nóng)民為了保證產(chǎn)量,如防止在雨天潮濕條件下果實腐爛、去除田間雜草、預(yù)防蟲害等,往往噴灑一定量的農(nóng)藥,如殺菌劑、除草劑和殺螨劑等.雖然經(jīng)過葡萄酒生產(chǎn)工藝,如去梗、壓榨果粒、榨汁和發(fā)酵等[2],農(nóng)藥殘留量會降低,但仍有一些農(nóng)藥可能因性質(zhì)穩(wěn)定而殘留在酒中,因此葡萄酒產(chǎn)品中存在農(nóng)藥殘留超標等風(fēng)險.如2012年張裕葡萄酒被檢出甲霜靈和多菌靈的殘留超過最大殘留限量標準,造成企業(yè)股價下跌,消費者對國產(chǎn)葡萄酒產(chǎn)生信任危機,國內(nèi)葡萄酒市場受到牽連.由此可見.建立可在基層企業(yè)應(yīng)用、快速準確的葡萄酒中多農(nóng)藥殘留檢測方法具有十分重要的意義.

目前多農(nóng)藥殘留檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[3-5]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]和氣相色譜法[8-9]等.前處理方法包括固相萃取[10]、凝膠滲透色譜[11]、分散固相萃取[12-14]和分散液液微萃取[15]等.其中固相萃取法需要預(yù)處理、上樣、洗脫等多個步驟,消耗溶劑較多,操作復(fù)雜,不適合在基層企業(yè)推廣;凝膠滲透色譜則需要較為昂貴的儀器;分散液液微萃取的適用范圍較窄,且受人為因素影響較大.分散固相萃取(dispersive solid phase extraction, DSPE)也稱QuEChERS方法,利用在提取液中充分渦旋的分散吸附填料,將基質(zhì)中的色素、糖類、有機酸等去除,從而實現(xiàn)復(fù)雜樣品中多農(nóng)藥殘留快速、高效、經(jīng)濟的測定.原始的QuEChERS方法的提取步驟只采用簡單的人工振蕩提取,某些農(nóng)藥化合物的提取效率較低.本研究結(jié)合超聲提取技術(shù),提高樣品中農(nóng)藥的提取效率,同時利用石墨化炭黑和N-丙基乙二胺鍵合硅膠混合吸附填料去除葡萄酒基質(zhì)中色素和糖分,結(jié)合GC/MS實現(xiàn)了葡萄酒中52種農(nóng)藥化合物的同時檢測,回收率和檢出限均滿足農(nóng)藥殘留分析要求,操作簡便,適于在基層企業(yè)進行推廣應(yīng)用.另外,本研究中所檢測的52種農(nóng)藥中,有43種是有針對性地從國家食品安全標準GB 2763—2012食品中農(nóng)藥最大殘留限量[16]中對葡萄有規(guī)定限量的農(nóng)藥,另有9種(丙溴磷、除草醚、氟環(huán)唑、仲丁威、乙霉威、毒死蜱、丙環(huán)唑、炔螨特、甲氰菊酯)是作者在葡萄種植園區(qū)進行常用農(nóng)藥調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn),可能存在濫用的農(nóng)藥,并且這些農(nóng)藥適合于用GC-MS檢測,對于葡萄酒農(nóng)藥殘留檢測具有較大的意義.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

52種農(nóng)藥標準品包括霜霉威、內(nèi)吸磷、殺蟲脒、甲拌磷、特丁硫磷、嘧霉胺、百菌清、磷胺、七氯、殺螟硫磷、馬拉硫磷、倍硫磷、對硫磷、腐霉利、苯線磷、p, p＇-滴滴伊、氟硅唑、p,p＇-滴滴滴、o,p＇-滴滴涕、p,p＇-滴滴涕、戊唑醇、氯菊酯、咪鮮胺、嘧菌酯、敵敵畏、滅線磷、治螟磷、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、地蟲硫磷、δ-六六六、氯唑磷、甲基對硫磷、甲霜靈、艾氏劑、己唑醇、狄氏劑、腈菌唑、異狄氏劑、烯唑醇、蠅毒磷、氰戊菊酯、丙溴磷、除草醚、氟環(huán)唑、仲丁威、乙霉威、毒死蜱、丙環(huán)唑、炔螨特、甲氰菊酯,均來自德國Dr.Ehrenstorfer GmbH.

內(nèi)標化合物為環(huán)氧七氯B.無水硫酸鎂,氯化鈉,無水乙酸鈉,乙酸,均為分析純,國藥集團化學(xué)試劑有限公司.石墨化炭黑(graphitized carbon black, GCB)、N-丙基乙二胺鍵合硅膠(primary secondary amine,PSA),天津博納艾杰爾科技有限公司.

葡萄酒樣品購自市場.

1.2 儀器與設(shè)備

7890A-5975C型 GC-MS儀(配超高惰性襯管),美國安捷倫公司;TG 16-域型臺式高速離心機,長沙平凡儀器儀表有限公司;BSA 224S-CW型電子天平,德國賽多利斯;SB-3200 DTDN型超聲波清洗機,寧波新芝生物科技股份有限公司;HGC-24A型氮吹儀,天津恒奧科技發(fā)展有限公司;QL-902型旋渦混合器,海門其林貝爾儀器制造有限公司.

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

精確取52種農(nóng)藥的標準品,用甲苯-丙酮(9∶1, V∶V)混合溶液配制成1.0 mg/m L的單一農(nóng)藥標準儲備液,于-18℃條件下儲存.

逐一吸取一定體積的單個農(nóng)藥標準儲備液分別注入同一容量瓶中,用丙酮稀釋至刻度,配制成單個農(nóng)藥質(zhì)量濃度均為10μg/mL的混合農(nóng)藥標準儲備液,于-20℃條件下儲存.

1.3.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱為 DB-5 ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm),美國安捷倫公司;程序升溫條件是100℃保持1min,以20℃/min升至150℃,5℃/min升至300℃;載氣為高純氦氣,純度≥99.999%,恒流模式,流速為1.0m L/min;進樣口溫度為280℃;進樣方式為不分流進樣;進樣量1.0μL;質(zhì)譜檢測器的接口溫度280℃,離子源溫度230℃,四級桿溫度150℃,掃描模式為選擇離子模式.

1.3.3 前處理方法

試樣制備:取葡萄酒樣品一瓶,4℃冷藏保存,使用前混勻.

提取:稱取10 g均勻葡萄酒于50mL離心管中,加入適量內(nèi)標物(環(huán)氧七氯B),加入20m L乙腈(含體積分數(shù)1%乙酸)作為提取液,4 g氯化鈉和1 g無水乙酸鈉,手動振搖2 min后超聲提取20 min,超聲時需用冰袋降溫,以防止水溫快速升高,加入6 g無水硫酸鎂后快速振搖2 min,于低速離心機中以3 000 r/min離心5min,取上清提取液.

凈化:取15 mL聚丙烯離心管,加入50 mg GCB、250mg PSA吸附劑和1 g無水硫酸鎂,加入上述上清提取液10 mL,手動振搖2 min后,以6 000 r/min離心3min,制得上清凈化液.

濃縮:取5 m L(精準刻度的)玻璃離心管,加入上清凈化液5 mL,在30 m條件下用氮氣濃縮至1 m L,樣品過0.22μm尼龍濾膜后,待GC/MS分析.

1.3.4 定量方法

采用內(nèi)標法單離子定量測定,內(nèi)標物為環(huán)氧七氯B.為減少基質(zhì)效應(yīng)的影響,定量用標準溶液采用基質(zhì)匹配混合標準工作溶液,其濃度應(yīng)與待測化合物的濃度相近.

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜參數(shù)

利用單一農(nóng)藥標準溶液在1.3節(jié)色譜條件下,進行質(zhì)譜的全掃描,獲得每個農(nóng)藥組分的質(zhì)譜圖.每個化合物分別選擇1個定量離子和3個定性離子,并記錄保留時間.選擇定量離子和定性離子遵循以下原則:定量離子盡量選擇m/z大于150 u且豐度最大的離子,定性離子則選擇m/z豐度強度次之的3個離子.按照這些化合物的出峰時間,進行分時段的選擇離子檢測(SIM),同時確保在每個分段時間內(nèi),所檢測的化合物離子之間不存在干擾.每種化合物的保留時間、定量離子、定性離子,和每組開始掃描時間見表1.

表1 52種農(nóng)藥掃描結(jié)果Tab.1 Scan results of52 pesticides

2.2 提取溶劑和提取方式選擇

考察了乙酸乙酯、丙酮和乙腈等3種提取溶劑的效果和回收率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)農(nóng)藥在乙酸乙酯提取溶劑中的響應(yīng)最高,但回收率都大于120%.丙酮作為提取溶劑時,基質(zhì)共提物較多,凈化之后顏色較深,容易污染進樣口.乙腈在回收率和基質(zhì)共提物方面表現(xiàn)均較好,因此本實驗均采用乙腈作為提取溶劑.

實驗中選擇了超聲輔助提取的方式加強溶劑的提取效率[14],超聲輔助提取所采用的設(shè)備為超聲波發(fā)生器,所需時間短,操作簡便,可實現(xiàn)大批量樣品的同時處理,因此實驗中采用超聲輔助提取的方式,進行20min的超聲提取即可達到較好的回收率.同時實驗中還在超聲波發(fā)生器中放置冰袋,在超聲提取過程強制降溫,防止敏感農(nóng)藥降解.

2.3 凈化劑填料的添加量

葡萄酒的乙腈提取液中含有大量的色素、糖類和酸類物質(zhì),這些物質(zhì)大多無法在進樣口氣化,如不加以去除,容易污染進樣系統(tǒng),如內(nèi)襯管中積碳等.對于葡萄酒這種色素和糖分含量都很高的樣品, GCB和PSA的混合吸附填料可以起到較好的凈化效果.實驗中考察了GCB和PSA的用量.

首先保持PSA用量為250 mg,將GCB用量從25mg增加到250 mg,見圖1.結(jié)果發(fā)現(xiàn),凈化后溶液的顏色隨著GCB的增加而變淺,說明GCB可有效去除色素.但GCB可吸附一些平面結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥,如嘧霉胺、百菌清、氟環(huán)唑、咪鮮胺、乙霉威、烯唑醇和蠅毒磷等.如圖1,當(dāng)GCB大于50 mg時,上述農(nóng)藥的加標回收率已小于60%,說明此時GCB已對這些農(nóng)藥產(chǎn)生較大吸附,影響了定量結(jié)果.在盡量減少色素含量的前提下,實驗最終采用GCB的添加量為50 mg.

PSA可利用—NH—H產(chǎn)生的氫鍵作用去除葡萄酒提取液中的糖、酸和某些極性基質(zhì),減少基質(zhì)對進樣系統(tǒng)的污染.實驗中保持GCB為50 mg,PSA用量從50mg增加至250mg的使用量,考察了52種農(nóng)藥的加標回收率.結(jié)果發(fā)現(xiàn),PSA的用量對52中農(nóng)藥的加標回收率基本無影響,最終選擇PSA用量為250mg.

最終混合吸附填料的使用量為GCB 50 mg和PSA 250 mg,同時含有1 000 mg的無水硫酸鎂.

2.4 線性范圍和檢出限

圖1 GCB使用量對幾種農(nóng)藥回收率影響Fig.1 Effect of GCB amount on recoveries of some pesticides

在1.3.2節(jié)的條件下,對52種農(nóng)藥進行分離,見圖2.用空白樣品提取液配制0.01,0.02,0.05, 0.10,0.20,0.50和1.0μg/mL的基質(zhì)匹配標準溶液.以52種農(nóng)藥的定量離子峰面積與內(nèi)標物環(huán)氧七氯B定量離子峰面積之比對相應(yīng)的質(zhì)量濃度,進行線性回歸,繪制內(nèi)標標準曲線.以3倍信噪比計算方法的檢出限(LOD),10倍信噪比計算方法的定量限(LOQ),見表2.

2.5 加標回收率和精密度實驗

稱取10 g均勻葡萄酒,添加混合標準溶液使樣品的添加濃度分別為0.02,0.04,0.20 mg/kg,按1.3節(jié)的實驗方法進行分析,各添加水平下的平均回收率和相對標準偏差見表3.

2.6 實際樣品測定

利用本實驗所開發(fā)的檢測方法,對市場上銷售的5種葡萄酒樣品進行上述52種農(nóng)藥的篩查檢測,結(jié)果見表4.其中定性標準為檢出色譜峰的保留時間與甲霜靈標準樣品相一致,并且在扣除背景后的樣品質(zhì)譜圖中,所選擇的離子(m/z=206、249、234、220)均出現(xiàn),而且所選擇的離子豐度比與標準樣品的離子豐度比相一致.

實驗結(jié)果表明,這5種葡萄酒中均有甲霜靈檢出,甲霜靈檢出頻率較高,應(yīng)當(dāng)引起相關(guān)企業(yè)和監(jiān)管部門的重視.目前國內(nèi)尚無針對葡萄酒的農(nóng)藥殘留最大殘留限量標準,標準的缺失讓葡萄酒行業(yè)的正常發(fā)展缺少公正、明確的法律依據(jù),也使相關(guān)的葡萄酒生產(chǎn)企業(yè)、消費者和監(jiān)管部門產(chǎn)生困惑和誤解.因此希望國家相關(guān)部門加快制定葡萄酒中農(nóng)藥殘留限量標準和檢測方法標準,使葡萄酒行業(yè)發(fā)展能夠更加規(guī)范,為國人提供更加安全健康的葡萄酒產(chǎn)品.

圖2 52種農(nóng)藥組分基質(zhì)匹配標準溶液總離子流圖Fig.2 TIC of 52 pesticidesmatrix-match standard solutions by GC-MS

表2 52種農(nóng)藥線性方程和相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear equations and correlation coefficients of 52 pesticidesmatrix-match standard solutions

續(xù)表2

表3 52種農(nóng)藥添加實驗平均回收率、相對標準偏差Tab.3 Average spiked recoveries and relative standard deviations of 52 pesticides

表4 市售葡萄酒樣品中農(nóng)藥殘留檢測結(jié)果Tab.4 Determ ination of pesticide residues in wine samples from market mg/kg

3 結(jié) 論

建立了DSPE-GC/MS法快速檢測葡萄酒中52種農(nóng)藥殘留的分析方法,該方法在0.02～0.20 mg/kg的添加水平下,52種農(nóng)藥的加標回收率在60% ～120%之間,相對標準偏差RSD(n=5)小于15%,定量限為0.000 7～0.032 3 mg/kg.方法操作簡便快速,準確性好,無需特殊的前處理裝置,成本低廉,適合于葡萄酒農(nóng)藥殘留的日常檢測.

[1] 全國食品工業(yè)標準化技術(shù)委員會釀酒分技術(shù)委員會. GB 15037—2006葡萄酒[S].北京:中國標準出版社,2006.

[2] 李華.葡萄酒工藝學(xué)[M].西安:陜西人民出版社, 2007.

[3] Lagunas-AlluéL,Sanz-Asensio J,Martínez-Soria M T. Comparison of four extraction methods for the determ ination of fungicide residues in grapes through gas chromatography-mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2012,1270(28):62-71.

[4] Rodríguez-Cabo T,Rodríguez I,RamilM,etal.Dispersive liquid-liquid microextraction using non-chlorinated, lighter than water solvents for gas chromatography-mass spectrometry determination of fungicides in wine[J]. Journal of Chromatography A,2011,1218(38):6603-6611.

[5] 杜娟,呂冰,朱盼,等.凝膠滲透色譜-固相萃取聯(lián)合凈化氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定動物性食品中30種有機氯農(nóng)藥的殘留量[J].色譜,2013,31(8):739-746.

[6] Moreno-Gonzalez D,Huertas-Perez JF,Garcia-Campana A M,et al.Ultrasound-assisted surfactant-enhanced emulsificationm icroextraction for the determ ination of carbamates in wines by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2013,1315:1-7.

[7] Chen Xiaohong,Zhao Yonggang,Shen Haoyu,et al. Application of dispersive solid-phase extraction and ultrafast liquid chromatography-tandem quadrupolemass spectrometry in food additive residue analysis of red wine [J].Journal of Chromatography A,2012,1263:34-42.

[8] 莊麗麗.固相萃取 氣相色譜法測定葡萄酒中16種有機磷農(nóng)藥殘留[J].福建分析測試,2012,21(5): 11-16.

[9] 朱學(xué)良,戚向陽,岳晶念,等.基質(zhì)固相分散氣相色譜電子捕獲檢測器測定葡萄酒中5種農(nóng)藥殘留[J].分析化學(xué),2007,35(2):259-262.

[10] Pecek G,Pavlovic D M,Babic S.Development and validation of a SPE-GC-MSmethod for the determination of pesticides in surface water[J].International Journal of Environmental Analytical Chemistry,2013,93(12): 1311-1328.

[11] Pang Guofang,Cao Yanzhong,Zhang Jinjie,et al.Validation study on 660 pesticide residues in animal tissues by gel permeation chromatography cleanup/gas chromatography-mass spectrometry and liquid chromatographytandem mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2006,1125(1):1-30.

[12] Kwon H,Lehotay S J,Geis-Asteggiante L.Variability ofmatrix effects in liquid and gas chromatography-mass spectrometry analysis of pesticide residues after QuECh-ERS sample preparation of different food crops[J]. Journal of Chromatography A,2012,1270(28):235-245.

[13] Koesukwiwat U,Lehotay S J,Mastovska K,et al.Extension of the QuEChERSMethod for Pesticide Residues in Cereals to FlaxseedsPeanuts,and Doughs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(10): 5950-5958.

[14] 章晴,陳士恒,楊永壇.分散固相萃取氣相色譜法測定茶葉中25種有機氯與擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留[J].分析儀器,2013,(4):16-22.

[15] 杜曉婷,周敏,張劍,等.蔬菜中甲胺磷等5種有機磷農(nóng)藥殘留量的分散液-液微萃取/氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測[J].分析測試學(xué)報,2010,29(7):751-754.

[16] 中華人民共和國衛(wèi)生部;中華人民共和國農(nóng)業(yè)部. GB 2763—2012食品安全國家標準——食品中農(nóng)藥最大殘留限量[S].北京:中國標準出版社,2012.

專家組稿專欄

編者按：食物中化學(xué)組分的改性處理,主要是改善原物質(zhì)的加工性能和營養(yǎng)價值,一般可以通過物理、化學(xué)或生物的方式進行.化學(xué)改性應(yīng)用于食品工業(yè)中經(jīng)常要考慮和評價其安全性問題.物理改性后不含化學(xué)試劑的殘留,大大改善產(chǎn)品的理化性質(zhì),提高產(chǎn)品應(yīng)用范圍和附加值,具有廣闊的發(fā)展前景和應(yīng)用空間.“物理方法提高高溫變性豆粕可溶性蛋白質(zhì)的方法”一文,研究了微波處理、水浴加熱、超聲處理及高壓均質(zhì)對高溫變性豆粕可溶性蛋白含量的影響.結(jié)果表明微波處理和水浴加熱效果明顯;微波處理后蛋白質(zhì)功能性優(yōu)于酶處理的樣品.研究結(jié)果為今后微波加熱處理高溫變性豆粕的工業(yè)化生產(chǎn),提供了理論參考和實踐依據(jù).“加工工藝對玉米方便速食粥食用品質(zhì)的影響”一文,采用擠壓加工工藝配合二次膨化加工技術(shù)制作玉米方便速食粥,并系統(tǒng)地研究了擠壓參數(shù)對于玉米粥產(chǎn)品感官品質(zhì)和熟化時間的影響.這些實驗數(shù)據(jù)和研究結(jié)論為今后采用物理改性技術(shù)加工谷物方便速食粥等方便主食品生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ),具有十分重要的參考價值.

(主持人:張敏教授)

Fast Determ ination of 52 Pesticide Residues in Grape W ine by DSPE-GC/MS

CHEN Shiheng, ZHANG Qing, SHIXiaomei, YANG Yongtan*, YUWeizu
(COFCO Nutrition and Health Research Institute/Beijing Key Laboratory ofNutrition, Health and Food Safety,Beijing 100020,China)

A fastmethod was developed for determination of 52 pesticides in grape wine by using DSPE and GC-MS.The sampleswere first extracted using acetonitrile with the addition of vibration and ultrasound.Then mix adsorbents were used in dispersive solid phase extraction to purify the extracts.After the high speed centrifugation,nitrogen flushing concentration,and filtration,the samples were detected by GC/MS using selective ion monitoring(SIM).Compared with traditionalmethods,QuEChERS had advantages in costand pretreatment speed.The spiked recoveries at three levels of52 pesticideswere in range of60%-110%while the relative standard deviations(n=5)were all less15%.Meanwhile,the limit of quantity(LOQ)were in the range of 0.000 7-0.032 3mg/kg.With features such as accuracy and easy operation,thismethod could be used to fast determination of52 pesticides in grapewinewithout any special apparatus and also satisfied the requirement of the pesticide routine analysis.

multiple pesticide residues;dispersive solid phase extraction;grape wine;fast determination

李 寧)

TS267.1

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.03.004

2095-6002(2014)03-0014-09

陳士恒,章 晴,史曉梅,等.DSPE-GC/MS快速檢測葡萄酒中52種農(nóng)藥殘留.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報,2014,32(1): 14-22. CHEN Shiheng,ZHANG Qing,SHIXiaomei,et al.Fast determination of 52 pesticide residues in grape wine by DSPEGC/MS.Journal of Food Science and Technology,2014,32(1):14-22.

2014-03-06

中糧集團應(yīng)用基礎(chǔ)研究項目(2013-C2-F013).

陳士恒,男,工程師,博士,主要從事農(nóng)藥殘留分析方面的研究;*楊永壇,男,高級工程師,博士,主要從事色譜質(zhì)譜技術(shù)在食品安全領(lǐng)域應(yīng)用方面的研究.通訊作者.