張麗娟，吳文強(qiáng)

（1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福建福州350002；2.福建廣生堂藥業(yè)股份有限公司，福建福州350003）

吖啶類(lèi)熒光探針用于微量蛋白質(zhì)測(cè)定的研究

張麗娟1，吳文強(qiáng)2

（1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，福建福州350002；2.福建廣生堂藥業(yè)股份有限公司，福建福州350003）

目的：利用合成的3種新型的蛋白質(zhì)分子熒光探針N-（2-二甲氨基）乙基-9-氯吖啶-4-甲酰胺（NCAF）、9-[（N-2-二甲氨乙基）吖啶-4-甲酰胺]-α-丙氨酸（NAFA）和4,9-二[N-（2-二甲氨基）乙基] -9-吖啶胺-4-甲酰胺（DNAF）結(jié)合熒光發(fā)射光譜，建立了3種新的微量蛋白質(zhì)測(cè)定方法。方法：通過(guò)建立適宜的NCAF-SDS（十二烷基硫酸鈉）、NAFA-SDS和DNAF-SDS熒光猝滅體系，牛血清白蛋白（BSA）的加入對(duì)體系的熒光具有恢復(fù)作用，并隨著B(niǎo)SA加入濃度的增大，熒光恢復(fù)程度逐漸增強(qiáng)，并在一定的濃度范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系，由此建立了用新型吖啶類(lèi)熒光探針測(cè)定BSA的熒光分析新方法。結(jié)果：從NCAF、NAFA到DNAF測(cè)定線(xiàn)性范圍分別為5.0×10-9～6.8×10-7，9.0×10-9～8.2×10-8和5.0×10-9～8.3×10-7mol·L-1；測(cè)定靈敏度（3σ/K）分別為1.1×10-10，3.8×10-10和1.0×10-10mol·L-1。結(jié)論：該測(cè)定方法具有良好的熒光響應(yīng)和穩(wěn)定性，為微量蛋白質(zhì)定量分析提供了新的技術(shù)體系。

吖啶類(lèi)熒光探針；蛋白質(zhì)定量分析；熒光分析法

熒光染料探針?lè)y(cè)定蛋白質(zhì)方法簡(jiǎn)便、靈敏度高，在蛋白質(zhì)雜交研究、疾病診斷和食品安全檢測(cè)等方面有廣闊應(yīng)用前景，已成為蛋白質(zhì)檢測(cè)的重要手段。研究表明，熒光染料在表面活性劑的存在下可自聚為二聚體，二聚體結(jié)構(gòu)隨蛋白質(zhì)的加入而逐漸解聚，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度發(fā)生變化，這種能自聚反應(yīng)的染料可作為蛋白質(zhì)測(cè)定的熒光探針[1]。以下是3種新合成的吖啶類(lèi)熒光染料探針，以4-羧基吖啶酮為母體，在4位上引入N-（2-二甲氨基）乙基，合成了N-（2-二甲氨基）乙基-9-氯吖啶-4-甲酰胺（NCAF），具有3個(gè)平面六元環(huán)共軛結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可進(jìn)入血清白蛋白分子內(nèi)疏水空腔，通過(guò)疏水作用力與血清白蛋白分子緊密結(jié)合，也可通過(guò)氫鍵及靜電吸引力與血清白蛋白表面結(jié)合。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)在9位上引入支鏈α-丙氨酸，合成了9-[（N-2-二甲氨乙基）吖啶-4-甲酰胺]-α-丙氨酸（NAFA），大大改善了吖啶類(lèi)化合物與生物大分子的親和性，使其極易與蛋白質(zhì)分子形成氫鍵，使得熒光量子效率有較大提高[2]。通過(guò)在9位上引入N-（2-二甲氨基）乙基，合成了4,9-二[N-（2-二甲氨基）乙基]-9-吖啶胺-4-甲酰胺（DNAF），提高了熒光量子產(chǎn)率，強(qiáng)化分子正電性，且不受體系酸度影響[3]。

新型的吖啶類(lèi)熒光探針在適量的陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）存在下形成二聚體，自聚平衡隨著蛋白質(zhì)的加入而被破壞，在一定的濃度范圍熒光明顯增強(qiáng)。本文利用在一定濃度表面活性劑存在下生成的二聚體作為熒光探針，建立了一種微量蛋白質(zhì)定量分析新方法，找出以該體系測(cè)定蛋白質(zhì)的最佳條件，并在該條件下測(cè)定蛋白質(zhì)。

1 儀器與試劑

Varian Cary Eclipse熒光光譜儀（美國(guó)VARIAN）；PHS-3C型酸度計(jì)（上海大普儀器有限公司）。

NCAF由實(shí)驗(yàn)室自制，配成3.0×10-4mol·L-1的儲(chǔ)備液（水∶CH2Cl2∶CH3OH=98∶1∶1），4℃條件下避光保存；NAFA由實(shí)驗(yàn)室自制，配成1.0× 10-5mol·L-1儲(chǔ)備液，4℃條件下避光保存；DNAF由實(shí)驗(yàn)室自制，配成3.0×10-4mol·L-1儲(chǔ)備液，4℃條件下避光保存；牛血清白蛋白（BSA）（Sanland-chem Internation Inc.）配成含0.1mol·L-1NaCl的1.0× 10-5mol·L-1儲(chǔ)備液，保存于4℃避光條件下；十二烷基硫酸鈉（SDS）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）配成1.0×10-2mol·L-1儲(chǔ)備液；Tris-HCl緩沖溶液（pH7. 0）；所用試劑均為生化純與分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。

2 BSA測(cè)定分析

2.1 最優(yōu)條件選定

實(shí)驗(yàn)考察優(yōu)化了熒光探針濃度、表面活性劑濃度、緩沖液pH值、溫度的影響。在Tris-HCl緩沖溶液pH值為7.0，溫度15℃，NCAF的濃度為1.0× 10-5mol·L-1，SDS的濃度為1.2×10-3mol·L-1情況下，體系具有最大二聚體比例，加入BSA后，NCAF -SDS體系具有最大熒光強(qiáng)度回升。在McIlvaine緩沖溶液pH值為5.0，溫度15℃，NAFA的濃度為1.0× 10-6mol·L-1，SDS的濃度為4.0×10-4mol·L-1情況下，體系具有最大二聚體比例，加入BSA后，NAFA -SDS體系具有最大熒光強(qiáng)度回升。在Tris-HCl緩沖溶液pH值為7.0，溫度15℃，DNAF的濃度為1.0× 10-5mol·L-1，SDS的濃度為1.2×10-3mol·L-1，情況下，體系具有最大二聚體比例，加入BSA后，DNAF -SDS體系具有最大熒光強(qiáng)度回升[4]。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

在一系列5mL刻度試管中加入pH值為7.0 Tris-HCl緩沖溶液2.0 mL，一定體積NCAF（3.0× 10-4mol·L-1）溶液及SDS溶液（1.0×10-2mol·L-1），使NCAF濃度為1.0×10-5mol·L-1，SDS濃度為1.2× 10-3mol·L-1，在15℃下穩(wěn)定30min后加入不同體積BSA（1.0×10-5mol·L-1）溶液，用水稀釋至刻度，搖勻，在15℃下穩(wěn)定30min后測(cè)定工作曲線(xiàn)，激發(fā)波長(zhǎng)254nm，發(fā)射波長(zhǎng)400～600nm，狹縫寬度均為5nm。NAFA和DNAF分別用上述同樣方法測(cè)定工作曲線(xiàn)。

2.3 線(xiàn)性范圍和檢出限的測(cè)定

2.3.1 NCAF線(xiàn)性范圍和檢出限的測(cè)定蛋白質(zhì)為兩性分子，在pH值大于9.8的溶液中，主要存在形式為NH2-Pr-COO-，在pH值小于4.36的溶液中，主要存在形式為在pH值為5.0的NCAF-SDS體系中時(shí)，大部分蛋白質(zhì)呈質(zhì)子化，可與NCAF-SDS離子締合物的SDS發(fā)生結(jié)合作用。BSA的加入破壞了NCAF-SDS離子締合物形成的微環(huán)境，使游離單體濃度增強(qiáng)，體系熒光強(qiáng)度回升。隨BSA加入，體系熒光峰明顯回升。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，利用NCAF-SDS體系用于BSA的測(cè)定，NCAF在455nm處熒光強(qiáng)度的增加△F與BSA濃度在一定范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系（見(jiàn)圖1）。工作曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程為y=4.2584χ+8.654，線(xiàn)性范圍5.0× 10-9～6.8×10-7mol·L-1，相關(guān)系數(shù)R=0.9936，檢出限為1.1×10-10mol·L-1，對(duì)25.0μg·mL-1BSA進(jìn)行8次測(cè)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.11%。

（a）NCAF-SDS體系測(cè)定微量BSA的熒光光譜

圖1 NCAF-SDS體系測(cè)定微量BSA的熒光光譜圖及工作曲線(xiàn)Fig.1（A）The fluorescence emission spectra of interaction between SDS and NCAF and BSA in aqueous solution.（B）Calibration curve for low concentration of BSA.

2.3.2 NAFA線(xiàn)性范圍和檢出限的測(cè)定在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，以在SDS作用下形成的NACA二聚體體系用于BSA的測(cè)定，NACA在447nm處熒光強(qiáng)度的增加△F與BSA濃度在一定范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系（見(jiàn)圖2）。工作曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程為y=19. 334χ+7.9087，線(xiàn)性范圍9.0×10-9～8.2×10-8mol· L-1，相關(guān)系數(shù)R=0.9993，檢出限為3.8×10-10mol·L-1，對(duì)3.0μg·mL-1BSA進(jìn)行8次測(cè)定，平均值3.03μg· mL-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.78%。

圖2 NAFA-SDS體系測(cè)定微量BSA的熒光光譜圖及工作曲線(xiàn)Fig.2（A）The fluorescence emission spectra of interaction between SDS and NAFA and BSA in aqueous solution.（B）Calibration curve for low concentration of BSA.

2.3.3 DNAF線(xiàn)性范圍和檢出限的測(cè)定在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，將DNAF-SDS離子締合物體系用于微量BSA的測(cè)定，該體系在451nm處的熒光強(qiáng)度隨BSA濃度的加大而增強(qiáng)，其熒光增加值△F與BSA濃度在一定范圍內(nèi)呈線(xiàn)性關(guān)系（見(jiàn)圖3）。工作曲線(xiàn)的線(xiàn)性回歸方程為y=1.5982χ-0.5244，線(xiàn)性范圍5.0×10-9～8.3×10-7mol·L-1，相關(guān)系數(shù)R=0.9984，檢出限為1.0×10-10mol·L-1，對(duì)25.0μg·mL-1BSA進(jìn)行8次測(cè)定，平均值26.3μg·mL-1，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.87%[4]。

圖3 DNAF-SDS體系測(cè)定微量BSA的熒光光譜圖及工作曲線(xiàn)Fig.3（A）The fluorescence emission spectra of interaction between SDS and DNAF and BSA in aqueous solution.（B）Calibration curve for low concentration of BSA

2.3.4 NCAF、NAFA、DNAF三者測(cè)定蛋白質(zhì)效果的比較表1為3種染料探針測(cè)定BSA的效果比較。

表1 NCAF，NAFA，DNAF測(cè)定BSA的效果比較Tab.1Effect of determination for BSA by using NCAF and NAFA and DNAF

由表1可知，DNAF與BSA的相互作用最弱，但測(cè)定線(xiàn)性范圍和靈敏度均最佳。這說(shuō)明3種染料探針應(yīng)用于蛋白質(zhì)測(cè)定的效果與探針和BSA間的相互作用機(jī)制沒(méi)有必然關(guān)系，該系列吖啶-4-酰胺衍生物用于蛋白質(zhì)測(cè)定的原理并非基于染料與蛋白質(zhì)的直接作用，而是通過(guò)蛋白質(zhì)對(duì)于染料-SDS體系微環(huán)境的改變作用，使得染料與SDS離子締合物發(fā)生解聚，以及使染料單體、二聚體的形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)化，促使體系熒光強(qiáng)度回升，達(dá)到測(cè)定微量蛋白質(zhì)的目的。

3 結(jié)論

利用3種吖啶-4-酰胺化合物為探針，結(jié)合熒光發(fā)射光譜，建立了3種新的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，具有較低的檢測(cè)限，良好的熒光響應(yīng)和穩(wěn)定性，為蛋白質(zhì)定量分析提供了新的技術(shù)體系。測(cè)定的效果與染料結(jié)構(gòu)關(guān)系密切。從提高該系列熒光探針熒光量子產(chǎn)率的角度考慮，4,9位上的取代基，特別是9位，應(yīng)當(dāng)盡量選擇-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR， -CN等給電子取代基，這有利于提高吖啶-4-酰胺衍生物探針的熒光，而應(yīng)避免連接羰基、羧基、硝基和重氮類(lèi)基團(tuán)。從提高該系列探針用于測(cè)定蛋白質(zhì)的效果角度考慮，應(yīng)盡量減弱其于蛋白質(zhì)的相互作用，以避免染料與蛋白質(zhì)相互結(jié)合對(duì)體系熒光的猝滅作用。NCAF的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上，由于9位缺乏有活性的側(cè)鏈基團(tuán)，其熒光量子產(chǎn)率和水溶性均不佳，且與BSA作用強(qiáng)烈，但其在微量蛋白質(zhì)實(shí)際測(cè)定方面仍具有不錯(cuò)的效果，可以作為一種有前途的蛋白質(zhì)熒光探針。而NAFA在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)上，9位引入酸堿基團(tuán)?-丙氨酸，使得染料與蛋白質(zhì)的結(jié)合特性可以受到體系酸度的調(diào)節(jié)，對(duì)于部分特殊酸堿性質(zhì)的蛋白質(zhì)測(cè)定具有一定的應(yīng)用意義。DNAF的設(shè)計(jì)上，9位引入又一個(gè)N-（2-二甲氨基）乙基基團(tuán)，提高了染料的水溶性和熒光效率，并利用分子間的電荷排斥力以及較大的空間位阻，減弱了其與BSA的相互作用，提高了性能，在微量蛋白質(zhì)測(cè)定中獲得了良好的效果。

［1］陳鴻琪,夏閩.熒光染料吖啶紅測(cè)定蛋白質(zhì)的生物探針［J］.理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊(cè)）,2001,37（2）:53-55.

［2］宋化燦,季風(fēng)英,宋繼國(guó),等.吖啶類(lèi)衍生物的熒光性質(zhì)［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào),2005,24:39-41.

［3］張麗娟.吖啶-4-甲酰胺衍生物的合成與表征［J］.廣州化工, 2011,39（15）:117-118.

［4］張麗娟.用4,9-二［N-（2-二甲氨基）乙基］-9-吖啶胺-4-甲酰胺測(cè)定微量蛋白質(zhì)［J］.安徽工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2011，28（4）:380-383.

［5］馮喜蘭,趙永和,田孟魁,等.利用有機(jī)小分子測(cè)定蛋白質(zhì)反應(yīng)的研究［J］.河南科技學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）,2005,33（2）:75-77.

Research into the application of acridine fluorescence probes to trace protein measurement

ZHANG Li-juan1，WU Wen-qiang2
（1.Department of Pharmacy，F(xiàn)ujian Vocational and Technical Institute of Biological Engineering，F(xiàn)uzhou 350002，China；2.Fujian Cosunter Pharmaceutical Co.,Ltd.，F(xiàn)uzhou 350003，China）

Objective:To establish three new ways to measure trace protein by utilizing 3 new synthetized types of protein molecule fluorescence probes,namely,NCAF,NAFA and DNAF and by combining with fluorescence emission spectrum.Method:First establish a proper fluorescence quenching system of NCAF-sodium dodecyl sulfate（SDS）,NAFA-SDS and DNAF-SDS,then add bovine serum albumin（BSA）to help restore the fluorescence of the system,and the higher the concentration of BSA added,the more the fluorescence is restored with linear relationship exhibited within certain concentration range,and thus we have established a new fluorescence analysis method of measuring BSA with new types of acridine fluorescence probes.Result:The effects of NCAF、NAFA and DNAF are good with the measured linear range of 5.0×10-9～6.8×10-7，9.0×10-9～8.2×10-8and 5.0×10-9·8.3×10-7mol·L-1respectively and the measurement sensitivity（3σ/K）of 1.1×10-10，3.8×10-10and 1.0×10-10mol·L-1respectively.Conclusion:The said measuring method boasts good fluorescence response and stability,and thus offers a new technical system for the quantitative analysis of trace protein.

acridine fluorescence probes；quantitative protein analysis；fluorescence analysis method

O657

A

1002-1124（2014）11-0023-04

2014-08-26

張麗娟（1977-），女，福建福州市人，講師，從事化學(xué)教學(xué)和研究工作。