陳 瑜, 王芊芊, 張 勻

(浙江大學(xué)1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 2. 附屬第二醫(yī)院, 杭州 310058)

改良R18S3冷凍液對(duì)cre轉(zhuǎn)基因小鼠精子冷凍效果探討

陳 瑜1, 王芊芊1, 張 勻2

(浙江大學(xué)1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心, 2. 附屬第二醫(yī)院, 杭州 310058)

目的 比較改良精子冷凍液與傳統(tǒng)冷凍液對(duì)cre轉(zhuǎn)基因小鼠的精子凍存和體外受精率的影響，建立采用精子冷凍技術(shù)穩(wěn)定保存兩種cre轉(zhuǎn)基因小鼠的方法。方法 以R18S3作為精子冷凍液和以R18S3作為基礎(chǔ)液添加477μmol/L的硫代甘油(MTG)配成R18S3+MTG冷凍液，凍存Neurog3-cre和Itgax-cre雄鼠精子,采用相同方法復(fù)蘇精子。同時(shí),以兩種cre小鼠的背景鼠C57BL/6J作為對(duì)照組，另選用ICR和FVB小鼠用兩種冷凍液凍存并復(fù)蘇精子，進(jìn)行體外受精，統(tǒng)計(jì)受精率來評(píng)價(jià)精子冷凍效果。結(jié)果 以R18S3冷凍并復(fù)蘇的兩種cre小鼠及野生型C57BL/6J的精子體外受精率分別為10.5%，11.6%和12.0%，無顯著差異。以R18S3+MTG冷凍并復(fù)蘇的精子體外受精率分別為66.4%，62.5%和67.6%，相對(duì)傳統(tǒng)冷凍液有顯著提高。ICR和FVB小鼠用改良精子冷凍液前后的體外受精率分別是34.1%，46.7%和65.7%和70.2%，后者都有所提高。結(jié)論 改良后的R18S3+MTG冷凍液能明顯提高以C57BL/6J為背景的cre轉(zhuǎn)基因小鼠冷凍后精子的體外受精率，對(duì)ICR和FVB品系的小鼠的體外受精率也有提高。

精子冷凍; 傳統(tǒng)冷凍液; 改良冷凍液; 體外受精率; cre轉(zhuǎn)基因小鼠

在條件性基因敲除小鼠研究中，cre轉(zhuǎn)基因小鼠以其能在時(shí)空上調(diào)控特定基因的關(guān)閉而顯示出極大的優(yōu)勢(shì)，因而又被稱為cre工具鼠[1～3]。然而獲得并維持一個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠品系實(shí)為不易且成本高昂。故此，胚胎和精子凍存，體外受精等保種技術(shù)是保存cre轉(zhuǎn)基因小鼠的有效方法。

本文通過兩種精子冷凍液對(duì)B6.FVB(Cg)-Tg (Neurog3-cre)C1Able/J(簡(jiǎn)稱Neurog3-cre小鼠)和C57BL/6J-Tg (Itgax-cre, -EGFP)4097Ach/J(簡(jiǎn)稱Itgax-cre小鼠)兩種轉(zhuǎn)基因小鼠品系以及ICR和FVB品系小鼠的冷凍精子體外受精率的比較, 來探索用精子快速冷凍法保存這兩種cre轉(zhuǎn)基因小鼠的可行性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)組: 用于采精的cre轉(zhuǎn)基因陽性雄鼠購于美國The Jackson Lab，后在浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(浙)2007-0098]繁殖擴(kuò)群獲得的8～12周齡的雄鼠，實(shí)驗(yàn)2周前與雌鼠交配后單籠飼養(yǎng)。供卵雌鼠選用SPF級(jí)4周齡的C57BL/6J小鼠，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(滬)2007-0005]。對(duì)照組: SPF級(jí)C57BL/6J、ICR和FVB雌雄鼠分別為4周齡和8周齡，購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。

1.2 動(dòng)物飼養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)條件

動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)屏障環(huán)境中，室內(nèi)溫度為21℃～25℃，相對(duì)濕度為40%～60%。飼料輻照消毒, 小鼠自由采食和飲水。明暗周期為12 h∶12 h (8∶00a.m～8∶00p.m, 為光照時(shí)間)。

1.3 試劑與儀器

試劑: 注射用孕馬血清素(PMSG)(生產(chǎn)批號(hào): 111118)和注射用人絨毛膜促性腺激素(hCG)(生產(chǎn)批號(hào): 110426), 杭州動(dòng)物藥品廠, 規(guī)格為: 1 000 IU/支,凍干粉劑, 分別于4℃、-20℃保存, 使用前用0.9%生理鹽水配制成稀釋液, 礦物油(Sigma, M 8410-1L), Raffinose(棉籽糖)(Sigma, R7630)，脫脂奶(Difco), HTF培養(yǎng)液由本實(shí)驗(yàn)自行配制(參考: 小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)指南)，配制后用0.22 μm的濾器過濾。儀器:超凈工作臺(tái), CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo)， Olympus顯微鏡，純水儀，高壓滅菌鍋，培養(yǎng)皿(NUNC)，酒精燈，自制洗卵針，顯微鑷，移液槍，精子凍存麥管，液氮罐等。

1.4 方法

1.4.1 兩種精子冷凍液的配制 R18S3的配制: Raffinose, 脫脂奶按18%(W/V)和3%(W/V)的比例與雙蒸水在60℃溫水中充分溶解后, 12 000 r/min離心10 min, 取上清液用0.22 μm的過濾器過濾后備用。R18S3+MTG的配制: 在4.75 m l的M 2中加入40 μl的MTG, 用0.22 μm的過濾器過濾后配成100 mmol/L的M TG存放于4℃冰箱中。精子凍存實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，將R18S3和100 mmol/L的MTG按200∶1的比例混合配成R18S3+MTG冷凍液。

1.4.2 精子采集及凍存 實(shí)驗(yàn)組: 頸椎脫臼法處死2月齡以上與雌鼠交配后單籠飼養(yǎng)一周的雄鼠，腹部用75%酒精消毒，打開腹腔，取出附睪尾，除去脂肪并用濾紙擦去血漬，分別將左右附睪尾放入R18S3和R18S3+MTG中，以顯微鑷刺破附睪尾，使精子流出，指根輕彈10次，使之與冷凍液充分混合, 將麥管裝在1 m l注射器上，依次吸入100 μl HTF、10 mm空氣柱、10μl精子懸液，將麥管近精子懸液端封口，在液氮表面靜置3～5 min后，存入液氮中保存。

1.4.3 雌鼠超排和取卵 兩組實(shí)驗(yàn)均采用4周齡的雌鼠, 于第一日下午5∶00腹腔注射10 IU的PMSG, 48 h后再腹腔注射10 IU的HCG, 注射后16 h取卵。頸椎脫臼法處死雌鼠, 消毒體表, 剪下雙側(cè)輸卵管放入平衡2 h的HTF液滴旁的礦物油中, 在顯微鏡下刺破輸卵管膨大部，用顯微鑷子將卵子團(tuán)引入HTF液滴中, 每100 μl HTF液滴中放入30～40枚卵。1.4.4 精子復(fù)蘇和體外授精 在取卵的當(dāng)日將凍存的精子于液氮罐中取出, 迅速置于37℃水浴中15 min。取出麥管擦干表面水滴，剪斷麥管精子端的封口，將精子懸液推入預(yù)先在CO2恒溫培養(yǎng)箱中平衡2 h的100 μl HTF中，獲能1.5 h。根據(jù)精子活力和濃度用微量移液器吸取適量精子(約10μl, 每μl約80～100個(gè)精子)懸液加入卵細(xì)胞附近。再將培養(yǎng)皿放入37℃、5%的CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。次日早晨統(tǒng)計(jì)2-細(xì)胞胚胎數(shù)、未受精卵和異形卵數(shù),計(jì)算體外受精率。

1.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用單因素方差分析對(duì)兩組精子冷凍液之間的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果

2.1 以C57BL/6J為背景的三組小鼠體外受精率的比較

用傳統(tǒng)的R18S3作冷凍液，Neurog3-cre、Itgax -cre 和C57BL/6J小鼠精子復(fù)蘇后的受精率(2-細(xì)胞胚胎數(shù)/卵子總數(shù))，兩種cre小鼠和其背景鼠的復(fù)蘇精子受精率都比較低，三者之間無顯著差異(P＞0.05)(表1)。用作者改良的R18S3+MTG作冷凍保護(hù)劑，兩種cre小鼠與其對(duì)照組C57BL/6J小鼠之間也無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)(表1)。單個(gè)品系的小鼠分別用R18S3和R18S3+MTG作為精子冷凍液的受精率都有較大差異。相比用R18S3冷凍液,三種小鼠平均受精率為11.4%, 用R18S3+MTG作為精子冷凍液的平均受精率為65.5%，有明顯提高(P＜0.05)。

2.2 C57BL/6J、ICR和FVB三種小鼠用改良精子冷凍液前后的體外受精率比較

C57BL/6J、ICR和FVB三種小鼠用傳統(tǒng)冷凍液冷凍精子復(fù)蘇后的受精率均低于50%, 改良的冷凍液冷凍復(fù)蘇后的體外受精率均相比傳統(tǒng)冷凍液有明顯提高(P＜0.05), 其中以C57BL/6J差異最大(表1)。

3 討論

自Nakagata等報(bào)道用棉籽糖-脫脂奶粉(R18S3)作為小鼠精子冷凍保護(hù)劑以來[4]，逐步建立了相對(duì)穩(wěn)定的小鼠精子冷凍保存方法，并一直沿用至今。世界上許多實(shí)驗(yàn)室重復(fù)了以R18S3作為精子冷凍保護(hù)劑的方法，證明對(duì)于遠(yuǎn)交系和雜合背景的小鼠，這種保護(hù)劑可獲得比較理想的體外受精率[5,6]。但對(duì)于近交品系如C57BL/6J，BALB/c和129S3等小鼠, R18S3冷凍后的精子體外受精率普遍較低[7～12]。本實(shí)驗(yàn)中兩種cre小鼠和其背景小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了單純采用R18S3很難達(dá)到通過精子凍存保存轉(zhuǎn)基因小鼠品系的目的。而大量的基因修飾小鼠的背景都是近交系，所以一定要改良R18S3來建立保存近交系小鼠的方法。

表1 兩種精子冷凍液冷凍五種小鼠精子后體外受精率比較

Ecroyd等[13]提到精子內(nèi)源性產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)在精子獲能反應(yīng)中起很大作用，但精子凍存復(fù)蘇后，產(chǎn)生過量的ROS是引起精子細(xì)胞損傷和降低精子受精能力的因素[14], Ostermeier等[15]選擇添加MTG作為改良傳統(tǒng)R18S3, 原因可能是MTG作為一種還原劑被廣泛應(yīng)用于無血清的ES細(xì)胞培養(yǎng)基[16], 在復(fù)蘇精子進(jìn)行體外受精的體系中MTG能降低ROS的濃度，從而減少精子損傷。實(shí)驗(yàn)顯示添加了477 μmol的MTG后,凍存精子的體外受精率有了大幅提高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了，改良后的精子冷凍液可以達(dá)到比較穩(wěn)定的復(fù)蘇后的體外受精率，且這兩種cre小鼠與其背景小鼠的體外受精率沒有明顯差異。

作為條件性基因敲除小鼠的工具鼠，cre小鼠在基因工程小鼠研究中的地位舉足輕重。但最終獲得條件型基因敲除小鼠后，特定的cre小鼠又暫時(shí)不會(huì)被使用?；铙w保存必然會(huì)消耗大量的資源，相比之下，精子凍存有節(jié)約資源、避免疫病傳播，防止長(zhǎng)期飼養(yǎng)引起基因漂移等優(yōu)勢(shì)[11,17]。改良后的R18S3+MTG精子冷凍液配制簡(jiǎn)便，易操作，能實(shí)現(xiàn)這兩種cre小鼠的品系保存，在cre小鼠的品系保存方面有較大應(yīng)用前景。

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Q95-33

B

1674-5817(2014)01-0053-03

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.011

2013-10-10

陳 瑜(1990-), 主要從事轉(zhuǎn)基因小鼠的研制和實(shí)驗(yàn)

小鼠凈化及其生殖細(xì)胞冷凍保存工作, E-mail: Charleschen 2005@gmail.com