王 吉, 付 瑞, 衛(wèi) 禮, 李曉波, 馮育芳, 王淑菁, 鞏 薇, 岳秉飛, 賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院, 國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、遺傳檢測中心, 北京 100050)

小鼠腺病毒PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用

王 吉, 付 瑞, 衛(wèi) 禮, 李曉波, 馮育芳, 王淑菁, 鞏 薇, 岳秉飛, 賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院, 國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物、遺傳檢測中心, 北京 100050)

目的 建立小鼠腺病毒(MAdV) PCR檢測方法，應(yīng)用于長爪沙鼠、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MAdV的檢測。方法 根據(jù)已發(fā)表的小鼠腺病毒(MAdV)E1B基因序列，設(shè)計(jì)合成引物。建立RT-PCR方法，并對(duì)方法的特異性、敏感性、穩(wěn)定性等進(jìn)行驗(yàn)證。用建立的方法對(duì)65只長爪沙鼠、12只小鼠進(jìn)行檢測。結(jié)果 建立的MAdV PCR檢測方法與小鼠微小病毒、多瘤病毒無交叉反應(yīng);以MAdV DNA為模板，所能檢測DNA最小模板濃度為1.67pg/μl，可檢測病毒最小滴度為10-7/ml; MAdV DNA在-30℃冰箱放置12個(gè)月，仍能擴(kuò)增出大小約606 bp的可見目條帶。經(jīng)PCR檢測，65只沙鼠和12只小鼠均為陰性。結(jié)論 建立的小鼠腺病毒(MAdV) PCR檢測方法特異、敏感、穩(wěn)定,可用于小鼠、長爪沙鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MAdV的檢測。

小鼠腺病毒; 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng); 長爪沙鼠; 小鼠

長爪沙鼠又稱蒙古沙鼠(Merions Unguieulataus; Mongolian gerbil), 分類學(xué)上屬于嚙齒目、倉鼠科、沙鼠亞科、沙鼠屬，產(chǎn)于我國內(nèi)蒙、河北、山西、甘肅等地，是一種正在開發(fā)、有著廣闊前景的多功能的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。國內(nèi)外大量研究資料表明，長爪沙鼠由于其在多個(gè)方面獨(dú)特的生物學(xué)特性，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、行為學(xué)等研究[1～4]。另外，該動(dòng)物的乳鼠對(duì)出血熱易感，一直用作流行性出血熱疫苗的研究及生產(chǎn)[2,4]。

長爪少鼠雖已廣泛應(yīng)用，但國內(nèi)外卻缺乏沙鼠質(zhì)量控制要求及檢測標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)沙鼠微生物攜帶情況，尤其是病毒攜帶情況報(bào)道甚少。小鼠腺病毒(Mouse Adenovirus, MAdV)屬腺病毒科，哺乳動(dòng)物腺病毒屬，核酸型為雙股DNA，病毒粒子直徑65～80 nm，呈二十面體等軸對(duì)稱，是一種人獸共患病毒，分布十分廣泛。在小鼠群中多呈隱性感染，帶毒和排毒時(shí)間較長，是影響小鼠健康的重要因素之一[5]。腺病毒主要通過呼吸道飛沫和直接接觸傳播，也可通過糞、口傳播。且能引起人類呼吸系統(tǒng)、眼部、胃腸道、肝臟、腦、泌尿系統(tǒng)疾病[5～8]。但目前國內(nèi)外并未見長爪沙鼠是否能感染MAdV的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)旨在建立簡單、快速、特異、敏感的MAdV PCR檢測方法，通過分子生物學(xué)手段，開展對(duì)小鼠、長爪沙鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攜帶MAdV核酸的檢測，以保證小鼠、長爪沙鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量。同時(shí)通過對(duì)開放飼養(yǎng)的65只沙鼠腺病毒攜帶情況進(jìn)行檢測，為長爪沙鼠病毒感染譜篩查及實(shí)驗(yàn)沙鼠質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒及樣品

小鼠腺病毒(MAdV)購自美國ATCC(VR-550);小鼠細(xì)小病毒(MVM)、小鼠多瘤病毒(PolyV), 中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測室保存; 65 只開放飼養(yǎng)的長爪沙鼠, 3～15月齡, 雌性30只,雄性35只，來源于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[SCXK(京)2005-0006]; 12只小鼠，來自國內(nèi)某單位送檢的成年清潔級(jí)KM小鼠; 7只用于MAdV感染的6周齡雌性，SPF小鼠，體質(zhì)量20～22 g,來源于中國食品藥品檢定研究院動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)室[SCXK (京)2009-0017]，以上動(dòng)物均按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

表1 用于擴(kuò)增E1B基因的引物序列及位置Table 1 Used for amp lification E1B gene p rimer sequence and position

1.2 主要試劑

DNA快速提取試劑盒購自Xygen公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas; dNTP、Taq DNA聚合酶和100 bp DNA marker均購自TaKaRa公司; PCR儀、核酸瓊脂糖凝膠電泳儀、紫外圖像分析系統(tǒng)等。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

分析已報(bào)道的MAdV基因組E1B基因序列, 將不同株基因進(jìn)行比對(duì), 根據(jù)GenBank中登陸的MadV A株基因(序列號(hào): 000942)選擇保守區(qū)域作為靶基因, 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2組兩組引物見表1, 引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 病毒DNA提取

對(duì)正常BALB/c 3T3細(xì)胞、MAdV感染BALB/c 3T3細(xì)胞、小鼠細(xì)小病毒(MVM)、小鼠多瘤病毒(PolyV)，按照DNA快速提取試劑盒(Xygen)操作方法進(jìn)行DNA提取。凍存于-70℃冰箱備用。

1.5 PCR檢測方法建立

以獲得的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)2組引物PCR反應(yīng)體系的dNTPs濃度、10×Buffer濃度、Taq HS酶濃度、引物、模板量、及反應(yīng)體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，通過對(duì)正常BALB/c 3T3細(xì)胞、MAd感染BALB/c 3T3細(xì)胞進(jìn)行PCR擴(kuò)增來確定PCR反應(yīng)的最佳模式。

1.6 PCR產(chǎn)物檢測

取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml EB)進(jìn)行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE(0.04mol/L Tris乙酸, 0.001 mol/L EDTA, pH8.0), 110 V電泳30 min,在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置，以100bp DNA ladder Marker為參照物，判定結(jié)果。PCR陽性擴(kuò)增片段進(jìn)行測序，通過與Genbank 中MAdV序列進(jìn)行比對(duì)以確定PCR檢測的準(zhǔn)確性。

1.7 特異性試驗(yàn)

分別以小鼠腺病毒(M AdV)、小鼠微小病毒(MVM)、多瘤病毒(PolyV)及正常BALB/c 3T3細(xì)胞的DNA為模板，用引物1建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

1.8 敏感性試驗(yàn)

1.8.1 MAdV病毒液濃度梯度檢測 取感染滴度為10-4.25/m l MAdV病毒液，用PBS做系列倍比稀釋，分設(shè)10-1～10-11共9個(gè)稀釋度。取每個(gè)稀釋度病毒液各0.5 m l制備模板，用引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定所能檢測病毒最小滴度。

1.8.2 MAdV DNA濃度梯度檢測 將起始濃度為16.7 μg/μl的DNA樣本做倍比稀釋, 分設(shè)10-1～10-8共7個(gè)濃度梯度，用引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷所能擴(kuò)增的最小DNA模板濃度。

1.9 穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取MAdV DNA及同一批PCR檢測試劑于-30℃冰箱放置6個(gè)月、12個(gè)月時(shí)，進(jìn)行PCR檢測。兩次試驗(yàn)各做3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.10 初步應(yīng)用

對(duì)7只(編號(hào)分別為A 1～A 7)經(jīng)腹腔人工感染M AdV的A 1～A 7小鼠腦、脾、心、腎、肺、肝組織、盲腸及內(nèi)容物, A 1～A 3、A 7下頜腺組織，A 3～A 7胸腺組織，A 1、A 3～A 7胰腺組織，A 7小腸組織及正常3T3細(xì)胞與MAdV同時(shí)提取DNA, 用引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

將65只沙鼠全血接種3T3細(xì)胞,盲傳3代后，提取DNA， 用引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。將62 只沙鼠(編號(hào): 1～62)腦組織、12只小鼠(編號(hào): 63-74)腦、心、脾和胰腺及正常3T3細(xì)胞與MAdV同時(shí)提取DNA, 用引物1進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。擴(kuò)增到的陽性樣品進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，與GenBank中MAdV核酸序列進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測方法建立

通過對(duì)兩組引物PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化，確定了PCR最佳反應(yīng)體系為: 10×ExTaqBuffer (Mg2+Free) 2 μl, dNTPs M ixture(10 mmol/L) 2 μl, Taq HS酶(5 U/μl)0.5 μl, 上下游引物(10 pmol/μl)各1 μl，cDNA 2 μl, 補(bǔ)水至20 μl; PCR最佳反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，56℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 共35個(gè)循環(huán); 72℃再延伸5 min。

2.2 RT-PCR產(chǎn)物檢測

利用引物1(P-1)能擴(kuò)增到約606 bp可見目的條帶(圖1)。 而引物2(P-2)對(duì)MAd和3T3細(xì)胞均未見目的條帶。

2.3 檢測結(jié)果準(zhǔn)確性

選擇引物1 的PCR擴(kuò)增陽性片段進(jìn)行測序, 測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析, 與GenBank中MAdV核酸序列同源性為99%(圖3), 說明該方法檢測準(zhǔn)確性較好。

2.4 特異性驗(yàn)證

圖1 引物1 PCR優(yōu)化結(jié)果M: 100 bpDNA marker;1: MAd virus; 2∶3T3 cell controlFigure 1 The results of primer 1 PCR reaction conditions optim ization

引物1在以MAdV為模板進(jìn)行擴(kuò)增有明顯目的條帶出現(xiàn)，小鼠微小病毒(M VM V)、多瘤病毒(PolyV)及正常3T3細(xì)胞均無目的條帶出現(xiàn)(圖2)。

2.5 敏感性試驗(yàn)

2.5.1 MAdV細(xì)胞毒濃度梯度檢測 引物1在病毒液稀釋至10-4/m l時(shí)，仍可見目的條帶出現(xiàn)(圖4)。2.5.2 MAdV DNA濃度梯度檢測 引物1在MAdV DNA模板稀釋至10-7時(shí)仍可見目的條帶出現(xiàn)(圖5)，即所能檢測到的最小DNA模板濃度至少能達(dá)到1.67 pg/μl。

2.6 穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

電泳結(jié)果顯示, MAdV cDNA 在-30℃冰箱放置6個(gè)月、12個(gè)月時(shí)，用引物1進(jìn)行檢測，仍能擴(kuò)增出大小約606 bp可見目的條帶(圖6)。

2.7 初步應(yīng)用

2.7.1 MAdV感染小鼠組織檢測 利用引物1檢測7只人工感染MAdV的小鼠腦、脾、心、腎、肺、肝、盲腸，A 1～A 3、A 7下頜腺組織，A 3～A 7胸腺組織，A 1、A 3～A 7胰腺組織，A 7小腸組織，電泳結(jié)果顯示除A4～A6號(hào)盲腸沒有擴(kuò)增到目的條帶外，其他組織均擴(kuò)增到大小約606 bp左右目的條帶。A 1～A 7號(hào)小鼠腦、脾及心臟組織電泳檢測結(jié)果見圖7(其他組織樣品電泳檢測結(jié)果圖略)。

2.7.2 沙鼠血接種細(xì)胞檢測 利用引物1建立的PCR檢測方法，對(duì)65只沙鼠血接種3T3細(xì)胞、盲傳3代后(細(xì)胞無CPE出現(xiàn)，結(jié)果均為陰性)的樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果均為陰性。1-22號(hào)樣品電泳檢測結(jié)果見圖8(其他樣品電泳檢測結(jié)果圖略)。

圖2 引物1特異性條件驗(yàn)證M:100 bp DNA marker; 1: MAd virus; 2: MVM virus; 3: Poly virus; 4: 3T3 cell controlFigure 2 Specific validation results of p rimer 1

圖3 引物1 PCR擴(kuò)增MAdV陽性片斷與GenBank中M AdV比對(duì)結(jié)果Figure 3 The comparison results of primer 1 PCR M AdV Positive amp lification fragment W ith M AdV in GenBank

圖4 引物M Ad-1PCR檢測敏感性測定——M Ad細(xì)胞毒濃度梯度M: 100 bp DNA marker; 1: 10-1 dilution; 2: 10-2 dilution; 3: 10-3 dilution; 4: 10-4 dilution; 5: 10-5 dilution; 6: 10-6 dilution; 7:10-7 dilution; 8: 10-8 dilution; 9: 10-9 dilution; 10: 10-10 dilution; 11: 3T3 cell controlFigure 4 The sceptibility testing results of PCR using primers M Ad-1-Cytotoxic concentration gradient of M Ad

2.7.3 沙鼠、小鼠組織檢測 利用引物1檢測62只沙鼠及12只小鼠，結(jié)果均為陰性，1～22號(hào)沙鼠腦組織檢測電泳結(jié)果見圖9(其他組織樣品檢測結(jié)果電泳圖略)。

2.7.4 檢測結(jié)果的驗(yàn)證 將MAdV感染的A1號(hào)小鼠腦、脾、心、腎、肺、肝、盲腸、下頜腺、胰腺及A 3號(hào)胸腺及A 7號(hào)小腸擴(kuò)增產(chǎn)物測序，與GenBank中MAdV標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性均為99%。

3 討論

圖5 引物M Ad-1 PCR檢測敏感性測定——M Ad DNA模板濃度梯度M: 100 bp DNA marker; 1: 10-1dilution; 2: 10-2dilution; 3: 10-3dilution; 4: 10-4dilution; 5: 10-5dilution; 6: 10-6dilution; 7: 10-7dilution; 8: 3T3 cell controlFigure 5 The sceptibility testing results of PCR using primers MAd-1-DNA template concentration gradient of MAd

圖6 引物1 PCR檢測穩(wěn)定性測定M: 100 bp DNA marker; 1-3: The DNA save -30℃refrigerator 6 months; 4-6: The DNA save -30℃ refrigerator 12 monthsFigure 6 The repeatability and stability testing resu lts of PCR using primers 1

圖7 引物1 PCR檢測人工感染M AdV小鼠腦、肝、脾組織M: 100 bp DNA marker; 1: MAd；2：3T3 cell control; 3～9: 1～7 brain; 10～16: 1～7 liver; 17～23: 1～7 spleenFigure 7 The resu lts of Primers 1 PCR to detect the brain,liver and sp leen tissues from experimental M AdV in fected m ice

圖8 PCR檢測1～22沙鼠血接種3T3細(xì)胞M: 100 bp DNA marker; 1～22: 3T3 cells inoculated w ith 1～22 gerbils blood; 23: 3T3 cell; 24: MAdVFigure 8 The resu lts of Primers 1 PCR to detect 3T3 cells inoculated w ith 1～22 gerbils b lood

圖9 PCR法檢測1～22號(hào)沙鼠腦組織樣品M: 100 bp DNA marker; 1: MAdV; 2: 3T3 cell control; 3-24: 1-22 gerbil brain tissueFigure 9 The resu lts of primers 1 PCR detect 1～22 gerbil brain tissue

MAdV作為人獸共患傳染病病原體，在SPF小鼠國家標(biāo)準(zhǔn)中要求對(duì)其檢測[9,10]; 在《中華人民共和國藥典》三部中，對(duì)鼠源性生物制品要求檢測的8種人獸共患病病毒中包括MAdV[11]。不論是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)，還是中國藥典三部，其規(guī)定的檢測方法主要是血清學(xué)方法。目前國內(nèi)并未見關(guān)于小鼠腺病毒(MAdV)分子生物學(xué)檢測方法的建立及應(yīng)用的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)MAdV抗原性最強(qiáng)的E1B基因，選擇保守片段，設(shè)計(jì)引物(引物1)。建立MAdV PCR檢測方法，其目的主要是用于長爪沙鼠、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的檢測，亦可考慮用于鼠源性生物制品及原材料潛在MAdV的檢測。

7只小鼠經(jīng)人工感染MAdV 72 h后，A1～A4號(hào)小鼠死亡，剖檢見腦部有淤血、脾臟腫大、胃及盲腸脹氣，并有出血點(diǎn)；A 5～A 7號(hào)小鼠出現(xiàn)被毛逆立、行走時(shí)后肢遲緩、精神沉郁、站立不穩(wěn)，剖檢見腦部淤血、脾臟腫大、盲腸脹氣，其他組織無明顯病變。用建立的PCR方法，檢測7只小鼠腦、脾、心、腎、肺、肝、盲腸、下頜腺、胰腺、胸腺及小腸等組織，除A 4～A6號(hào)小鼠盲腸未檢到M AdV外，其他組織檢測結(jié)果均為陽性。說明MAdV確實(shí)能感染小鼠，且小鼠腦、脾、心、腎、肺、肝、盲腸、下頜腺、胰腺、胸腺及小腸均可攜帶MAdV。同時(shí)也說明建立的PCR方法確實(shí)能從感染MAdV的動(dòng)物組織中，檢測出MAdV核酸。

根據(jù)人工感染小鼠MAdV后，小鼠臨床均表現(xiàn)腦炎癥狀，剖檢腦部均有淤血， PCR檢測腦組織MAdV陽性率為100%，初步確定腦為MAdV主要靶器官，因而選擇沙鼠腦組織作為主要靶器官進(jìn)行MAdV檢測。

試驗(yàn)對(duì)開放飼養(yǎng)的65只沙鼠進(jìn)行了MAdV感染篩查，并檢測了62只沙鼠腦組織，結(jié)果均為陰性，與65只沙鼠全血轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞均為陰性結(jié)果一致; 同時(shí)與用PCR方法檢測65只沙鼠全血接種3T3細(xì)胞的第3代，結(jié)果均為陰性一致。初步說明，沙鼠自然感染MAdV的可能性確實(shí)很小。但此次對(duì)65只長爪沙鼠MAdV的檢測結(jié)果只是一個(gè)初步篩查結(jié)果，如果要確切了解我國長爪沙鼠對(duì)MAdV的感染情況，還需要擴(kuò)大檢測樣本量，并有必要用其他分子生物學(xué)檢測方法或結(jié)合血清學(xué)檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證。因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)室不具備飼養(yǎng)長爪沙鼠的條件，所以沒有做MAdV人工感染沙鼠實(shí)驗(yàn)。

本實(shí)驗(yàn)所建立的PCR檢測方法，特異、敏感、可靠，穩(wěn)定性好，檢測準(zhǔn)確性高，可用于小鼠、長爪沙鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物MAdV的檢測。同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)室將來開展人用鼠源性材料及人用鼠源性生物制品MAdV核酸的檢測奠定基礎(chǔ)。

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Development and Preliminary Application of RT-PCR Method for Detection of Mouse Adenovirus

WANG Ji, FU Rui, WEI Li, LI Xiao-bo, FENG Yu-fang,WANG Shu-jing, GONG Wei,YUE Bing-fei, HE Zheng-ming,
(National Institutes for Food and Drug Control, National Center for Quality of Laboratory Animal, Beijing 100050, China)

ObjectiveTo develop a RT-PCR method for detection of Mouse Adenovirus (MAdV) in M ongolian gerbils and Laboratory mice.MethodsThe primers were designed and synthesized according to the published MAdv specific sequences of E1B gene . PCR method is established, and the specificity, sensitivity, stability test were carried out. The method is used to detect 65 Mongolian gerbils, and 12 mice.ResultsThe developed PCR method was no cross reaction w ith M inute virus, Polyoma virus, its minimum detection limit ,using the recombinant plasmid containing MAdV gene as a template, was 1.67 pg/μl, and the lowest detection virus titer is 10-7/m l. The MAdV cDNA maintained at -30℃ for 12 months, still can enlarge the size of about 606 bp visible mesh belt. The 65 M ongolian gerbils and 12 mice were all negative about MAdv detected by PCR.ConclusionThe developed PCR method is good in specificity, sensitivity, stability,and may be used for detecting the MAdv in laboratory animal, such as Mongolian gerbils and mice.

Mouse Adenovirus; PCR; Mongolian gerbil; Mouse

R-33Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0035-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.007

2013-05-30

國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI15B01)

王 吉(1974-), 女, 副研究員, 研究方向: 微生物學(xué)和免疫學(xué)

賀爭鳴(1957-), 男, 博士, 研究員, 研究方向: 微生物學(xué)和免疫學(xué)。E-mail: zhengm inghe57@163.com