駱永偉，楊春雷，王忠輝，王 永，王 蓉，姜 娟，閆 晗，孫祖越

(1. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所, 中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理學(xué)檢測中心, 上海 200032; 2. 昆明龍津藥業(yè)股份有限公司, 昆明 650101)

注射用燈盞花素大鼠和豚鼠免疫毒性差異性比較

駱永偉1,2，楊春雷2，王忠輝1，王 永1，王 蓉1，姜 娟1，閆 晗1，孫祖越1

(1. 上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所, 中國生育調(diào)節(jié)藥物毒理學(xué)檢測中心, 上海 200032; 2. 昆明龍津藥業(yè)股份有限公司, 昆明 650101)

目的 研究注射用燈盞花素在兩種不同的動(dòng)物種屬及其反應(yīng)體系上的免疫毒性差異。方法 按照《中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光變態(tài)反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》的試驗(yàn)方法對(duì)注射用燈盞花素進(jìn)行SD大鼠皮膚被動(dòng)過敏試驗(yàn)和Hartley豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)，比較注射用燈盞花素在大鼠和豚鼠體內(nèi)的免疫毒性差異。結(jié)果 注射用燈盞花素劑量為5mg/kg、50mg/kg及500mg/kg時(shí)均未引起SD大鼠皮膚被動(dòng)過敏反應(yīng)陽性;注射用燈盞花素劑量為5mg/kg(豚鼠等效劑量)時(shí)引起50%動(dòng)物弱陽性和50%動(dòng)物陽性，50mg/kg時(shí)豚鼠全身主動(dòng)過敏反應(yīng)陽性率為100%。結(jié)論 注射用燈盞花素在兩種動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)的過敏反應(yīng)存在著明顯的差異，豚鼠全身主動(dòng)過敏反應(yīng)相對(duì)于SD大鼠皮膚被動(dòng)過敏反應(yīng)更敏感，與臨床過敏反應(yīng)發(fā)生率更具有一致性。

中藥注射劑; 免疫毒性; 被動(dòng)過敏試驗(yàn); 主動(dòng)過敏試驗(yàn)

燈盞花素(breviscapine)是從菊科植物短葶飛蓬(Erigeon speciosus)中分離得到的黃酮類有效成分，主要為燈盞乙素，具有增加心腦血管血流量、改善腦微循環(huán)、抗血小板聚集、抗氧自由基、增強(qiáng)肝臟解毒功能，保護(hù)糖尿病性肝臟、腎臟等作用，在臨床上主要用于腦血栓、冠心病等疾病的治療[1,2]。注射用燈盞花素是采用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和方法，從燈盞花提取、純化、精制而成的中藥注射劑。中藥注射劑作為中藥現(xiàn)代化的一個(gè)標(biāo)志，具有生物利用度高、起效快等特點(diǎn)，在危重疾病急救及感染性疾病等治療上具有一定的優(yōu)勢。然而，近年來隨著注射用燈盞花素等中藥注射劑在臨床上的廣泛應(yīng)用，不良反應(yīng)報(bào)道也逐漸增多，中藥注射劑安全性問題日益受到重視。燈盞花素的不良反應(yīng)臨床上主要以過敏反應(yīng)為主，嚴(yán)重的可出現(xiàn)過敏性休克[3～5]。為探討注射用燈盞花素引起過敏反應(yīng)的差異, 本研究參照《中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光變態(tài)反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》，采用SD大鼠進(jìn)行皮膚被動(dòng)過敏試驗(yàn)(PCA)和豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)(ASA)，為臨床提供毒理學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠, 接收時(shí)體質(zhì)量180～220 g，50只，雌雄各半，由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK(滬)2008-0016]。普通級(jí)Hartley豚鼠, 接收時(shí)體質(zhì)量260～360 g，24只，雌雄各半。由上海市松江區(qū)車墩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物良種場提供[SCXK(滬)2007-0008]。大鼠及豚鼠分別在SPF級(jí)和普通級(jí)設(shè)施[SYXK(滬)2008-0027]飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)，動(dòng)物自由飲食。

1.2 試劑

注射用燈盞花素為淡黃色至黃色的疏松塊狀物，由昆明龍津藥業(yè)股份有限公司提供(批號(hào)20100127)。牛血清白蛋白(Sigma公司, 批號(hào)091009)和伊文斯蘭染料(Sigma公司, 批號(hào)1001388548)。

1.3 方法

1.3.1 劑量設(shè)計(jì) 注射用燈盞花素臨床常用方式:靜脈注射20～50 mg/次, 用250 m l生理鹽水或500 m l體積分?jǐn)?shù)5%或10%葡萄糖溶解后使用。按50 mg/人/次折算成大鼠的等效劑量約為5 mg/kg, 故大鼠被動(dòng)過敏低劑量設(shè)置為5 mg/kg, 中、高劑量則分別設(shè)置為50 mg/kg和500 mg/kg; 同樣方法換算豚鼠等效劑量為5 mg/kg，故設(shè)計(jì)豚鼠主動(dòng)過敏低劑量為5 mg/kg, 高劑量為50 mg/kg。牛血清白蛋白為陽性對(duì)照組，大鼠和豚鼠給藥劑量均為100 mg/kg，2 m l/kg給藥。0.9%氯化鈉溶液為陰性對(duì)照組。以上溶液均為現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.2 被動(dòng)皮膚過敏性試驗(yàn) 抗體制備階段，20只SD大鼠, 根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為5組, 雌雄各半; 大鼠靜脈給予注射用燈盞花素溶液，注射劑量分別為5 mg/kg(低劑量組)、50 mg/kg(中劑量組)和500 mg/kg (高劑量組)，隔日一次, 共3次。陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組分別給予生理鹽水和牛血清白蛋白。末次致敏注射后第10天采血, 以2 000 r/min離心10 min,分離血清，混勻后，－20℃保存，兩周內(nèi)備用;被動(dòng)致敏和激發(fā)階段, 另取30只SD大鼠，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，雌雄各半，分組同抗體制備階段。大鼠兩側(cè)背部剃毛，面積約3 cm×4 cm。上述各組抗血清用生理鹽水稀釋成1∶2、1∶8和1∶32; 在預(yù)先剃毛的左側(cè)和右側(cè)背部皮膚皮內(nèi)分別注射各相應(yīng)組別1∶2、1:8和1∶32稀釋的抗血清0.1m l。24 h后，各組尾靜脈注射與致敏劑量相同的激發(fā)抗原與1%伊文思蘭染料，進(jìn)行激發(fā)。30 min后麻醉處死各組動(dòng)物, 剪取背部皮膚, 測量皮膚內(nèi)層的藍(lán)色斑點(diǎn)大小, 直徑大于5 mm者為陽性。不規(guī)則斑點(diǎn)的直徑為長徑與短徑之和的一半。

1.3.3 全身主動(dòng)過敏試驗(yàn) 致敏階段, 24只豚鼠靜脈給予注射用燈盞花素溶液, 注射劑量為5 mg/kg (低劑量組)和50 mg/kg(高劑量組), 隔日一次, 共3次。陰性對(duì)照組和陽性對(duì)照組給藥方法和給藥體積同注射用燈盞花素高、低劑量組; 激發(fā)階段, 末次注射后第12日一次激發(fā), 注射用燈盞花素低劑量組和高劑量組激發(fā)劑量分別為20 mg/kg和200 mg/kg, 為致敏劑量的4倍。致敏期間, 每日觀察每只動(dòng)物的癥狀。初次、最后一次和激發(fā)當(dāng)日測定每只動(dòng)物的體質(zhì)量。激發(fā)階段, 靜脈注射后30 min內(nèi)詳細(xì)觀察每只動(dòng)物的反應(yīng), 癥狀的出現(xiàn)及消失時(shí)間, 連續(xù)觀察3 h。并根據(jù)全身致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)[6]?！?”:過敏反應(yīng)陰性(正常); “+”: 過敏反應(yīng)弱陽性(躁動(dòng)、豎毛、顫抖、搔鼻); “++”: 過敏反應(yīng)陽性(噴嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排糞、流淚);“+++”：過敏反應(yīng)強(qiáng)陽性(呼吸困難、哮鳴音、紫癜、步態(tài)不穩(wěn)、跳躍、喘息、痙攣、旋轉(zhuǎn)、潮式呼吸); “++++”: 過敏反應(yīng)極強(qiáng)陽性(死亡)。

2 結(jié)果

2.1 被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)

在抗體制備階段和激發(fā)階段，SD大鼠靜脈給予注射用燈盞花素期間未觀察到動(dòng)物出現(xiàn)明顯異常;激發(fā)30 m in后陽性對(duì)照組6只SD大鼠在1∶2抗血清注射點(diǎn)出現(xiàn)明顯的直徑大于5 mm的藍(lán)斑，陽性率為100%(6/6)，5只SD大鼠在1∶8抗血清注射點(diǎn)出現(xiàn)明顯的直徑大于5 mm的藍(lán)斑，陽性率為83.3%(5/6); 陰性對(duì)照組、注射用燈盞花素低劑量組、中劑量組和高劑量組動(dòng)物皮膚內(nèi)層均未見明顯大于5 mm的藍(lán)斑出現(xiàn)，陽性率為0(0/6)(表1)。

2.2 全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)

在致敏階段和激發(fā)階段，豚鼠靜脈給予注射用燈盞花素期間未觀察到動(dòng)物出現(xiàn)明顯異常; 激發(fā)后，陽性對(duì)照組6只動(dòng)物在10 m in內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的過敏反應(yīng)，癥狀包括搔鼻、咳嗽、噴嚏、排尿、步態(tài)不穩(wěn)、痙攣、旋轉(zhuǎn)和死亡，為強(qiáng)陽性或極強(qiáng)陽性。其中3只動(dòng)物死亡，剩余3只動(dòng)物的過敏反應(yīng)癥狀在45～75 min內(nèi)基本恢復(fù); 注射用燈盞花素低劑量組6只動(dòng)物在激發(fā)后10 min內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的過敏反應(yīng)癥狀，其中3只動(dòng)物出現(xiàn)搔鼻癥狀，為弱陽性；3只動(dòng)物出現(xiàn)噴嚏和(或)排尿癥狀, 為陽性, 過敏反應(yīng)癥狀在35～50 min內(nèi)基本恢復(fù); 注射用燈盞花素高劑量組6只動(dòng)物在激發(fā)后10 min內(nèi)均出現(xiàn)了不同程度的過敏反應(yīng)癥狀，癥狀包括噴嚏、咳嗽和(或)排尿癥狀，為陽性，過敏反應(yīng)癥狀在35～50 m in內(nèi)基本恢復(fù)(表2)。

表1 大鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)(PCA)結(jié)果

表2 注射用燈盞花素豚鼠全身主動(dòng)過敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

注射用燈盞花素的臨床不良反應(yīng)主要以過敏反應(yīng)為主，其過敏反應(yīng)發(fā)生率約占其所有不良反應(yīng)的70%。主要臨床表現(xiàn)為輕者皮膚瘙癢、蕁麻疹、過敏性皮炎, 重者出現(xiàn)過敏性休克[3～5,7～8]。由于中藥注射劑受原料來源、采集季節(jié)、生產(chǎn)工藝、純度與雜質(zhì)含量等諸因素的影響，所以注射用燈盞花素引起不良反應(yīng)的機(jī)制尚不明確。本試驗(yàn)SD大鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果表明：注射用燈盞花素劑量為5 mg/kg、50 mg/kg及500 mg/kg均未引起陽性反應(yīng); 豚鼠全身主動(dòng)過敏研究結(jié)果表明: 注射用燈盞花素劑量為5 mg/kg和50 mg/kg時(shí)動(dòng)物全身主動(dòng)過敏反應(yīng)陽性率均為100%，說明注射用燈盞花素在兩種動(dòng)物體內(nèi)表現(xiàn)的過敏反應(yīng)存在著明顯的差異，豚鼠全身主動(dòng)過敏反應(yīng)相對(duì)于SD大鼠皮膚被動(dòng)過敏反應(yīng)更敏感。

SD大鼠和豚鼠是分別是被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)和全身主動(dòng)過敏中常用的兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，二者在注射用燈盞花素引起的過敏反應(yīng)的差異說明二者對(duì)注射用燈盞花素的敏感性不同，與文獻(xiàn)報(bào)道的不同品系的動(dòng)物對(duì)特定的藥物易感性有所不同相一致[9～10]。這種差異產(chǎn)生的原因與動(dòng)物的遺傳背景密切相關(guān)，具有Th2極化遺傳背景的動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)性過敏性疾病呈現(xiàn)易感體質(zhì)，從遺傳學(xué)的角度看，SD大鼠本身并無明顯的Th2極化遺傳背景，在一定程度上反應(yīng)了注射用燈盞花素SD大鼠皮膚被動(dòng)過敏反應(yīng)不易出現(xiàn)陽性結(jié)果。

《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光過敏反應(yīng)）研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》中規(guī)定，對(duì)于Ⅰ型過敏反應(yīng)，靜脈注射劑應(yīng)進(jìn)行主動(dòng)全身過敏性試驗(yàn)和被動(dòng)皮膚過敏性試驗(yàn)。然而，實(shí)際工作中面臨的情況是許多中藥注射劑過敏反應(yīng)的臨床報(bào)道與臨床前安全性評(píng)價(jià)中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。采用臨床上已發(fā)現(xiàn)過敏反應(yīng)的藥物，將同一批次的樣品參照《中藥、天然藥物免疫毒性(過敏性、光過敏反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行動(dòng)物的過敏試驗(yàn)，卻未得出陽性結(jié)果。分析其原因，一方面與不同種屬的動(dòng)物敏感程度有關(guān)，另一方面也與中藥注射劑具有多成分、成分又復(fù)雜的特點(diǎn)有關(guān)。因此，急需改進(jìn)和提高現(xiàn)有臨床前過敏試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法，建立新的更為敏感、可靠的動(dòng)物模型和過敏原檢測技術(shù)方法，以提高臨床前不良反應(yīng)的預(yù)測水平，保證用藥安全，是突破中藥注射劑安全性評(píng)價(jià)瓶頸的途徑，這為傳統(tǒng)中藥的發(fā)展和中藥現(xiàn)代化的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)也是目前中藥注射劑面臨的最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

[1] 高帥榮, 萬屏. 燈盞花素臨床應(yīng)用進(jìn)展[J]. 云南中醫(yī)藥雜志, 2009, 30(3):67-68.

[2] 姜秀娥. 燈盞花素的藥理作用研究進(jìn)展[J] . 醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐, 2009, 22(8):915-917.

[3] 胡杰, 郭澄. 燈盞細(xì)辛和燈盞花素注射劑致不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析[J]. 中國藥房, 2011, 22(24):2258-2260.

[4] 梅全喜, 范文昌, 曾聰彥. 燈盞花素注射劑型良反應(yīng)文獻(xiàn)分析[J]. 中國執(zhí)業(yè)藥師, 2010, 7(4):3-6.

[5] 杜娟, 李建麗, 傅文. 106例燈盞花類注射劑不良反應(yīng)事件分析[J]. 藥物警戒, 2008, 5(4):120-124.

[6] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.《中藥、天然藥物免疫性(過敏性、光變態(tài)反應(yīng))研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》[S]. 2005. 附錄9-16.

[7] 謝冬梅, 馬玲. 燈盞花素注射液的不良反應(yīng)文獻(xiàn)分析[J].中國實(shí)用醫(yī)藥, 2009, 4(15):65-67.

[8] 朱婉貞. 43例燈盞花素注射液不良反應(yīng)報(bào)告分析[J]. 藥事組織, 2010, 19(5):43-44.

[9] Antunes MA, Abreu SC, Damaceno-Rodrigues NR, et al. Different strains of m ice present distinct lung tissue mechanics and extracellular matrix composition in a model of chronic allergic asthma[J］. Respiratory Physiol Neurobio, 2009, 165(2/3):202.

[10] Gillespie KM, Saoudi A, Kuhn J, et al. Th1 /Th2 cytokine gene expression after mercuric chloride in susceptible and resistant rat strains [J]. Eur J Immunol, 1996, 26(10):2388.

Comparison on Immunotoxicity Difference of Breviscapine Injection between Rat and Guinea Pig

LUO Yong-wei1, YANG Chun-lei2, WANG Zhong-hui1, WANG Yong1, WANG Rong1, JIANG Juan, YAN Han1, SUN Zu-yue1
(1. Department of Pharmacology and Toxicology ,Shanghai Research Institute of Planned Parenthood, National Evaluation Centre for the Toxicology of Fertility Regulating Drugs, Shanghai 200032, China; 2. Kunming Longjin Pharmaceutical Co., Ltd., Kunming 650101, China)

ObjectiveTo study the immunotoxicity difference of Breviscapine Injection between rat and guinea pig.M ethodsAccording to the Chinese traditional medicine, natural medicine immunity toxicity study technical directed principle, the PCA and ASA tests were carried out in order to compare the immunotoxicity difference between the two animals.ResultsThe results of the allergy testing showed that no positive symptom in SD rat occurred at all the doses of 5 mg/kg、50 mg/kg and 500 mg/kg of Breviscapine injection group in PCA toxicity study. While in ASA toxicity study, 50 percent animals appeared weak positive and 50 percent animals appeared positive at the dose of 5 mg/kg of Breviscapine injection group; and all appeared the positive symptoms at the high dose of 50 mg/kg group.ConclusionsCompared w ith the allergic response in animal study, there are significant difference between the PCA and the ASA toxicity study and the ASA is more sensitive and more conformity to the application in clinical.

Chinese traditional medicine injectas; Immunotoxicity; Passive cutaneous anaphylaxis test (PCA); Active systemic anaphylaxis(ASA)

R285Q95-33

A

1674-5817(2014)01-0025-04

10.3969/j.issn.1674-5817.2014.01.005

2013-06-03

重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)(2011ZX09301-005),上海市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(11140901300)

駱永偉(1983-), 男, 碩士, 助理研究員,研究方向: 生殖藥理毒理學(xué)與藥物安全性評(píng)價(jià), E-mail: luoyongwei2009@163.com

孫祖越, 研究員, 博士生導(dǎo)師, 研究方向: 生殖藥理毒理與藥物安全性評(píng)價(jià), E-mail: sunzy64@163.com