尹仕偉，鄒麗云，張 瑩，張晉宇，唐 莎，施維維，吳玉章，袁發(fā)煥，張靜波△

（1.第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院腎內(nèi)科，重慶40037；2.第三軍醫(yī)大學(xué)全軍免疫研究所，重慶40038）

自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制主要是病原體通過(guò)分子模擬機(jī)制打破機(jī)體免疫耐受：即病原體某些抗原表位與宿主組織蛋白的結(jié)構(gòu)相同或相似，導(dǎo)致病原體刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答直接作用于結(jié)構(gòu)相似的自身組分［1］。Kain等［2］對(duì)寡免疫復(fù)合物局灶壞死性腎炎（FNGN）的研究發(fā)現(xiàn)了分子模擬的直接證據(jù)：尿路致病性大腸桿菌（pyelonephritic E.coli，UPEC）Ⅰ型菌毛FimH蛋白表位P72-80與人溶酶體膜蛋白2（lysosome membrane protein 2，LAMP-2）致病表位P41-49具有100%的同源性，機(jī)體通過(guò)識(shí)別細(xì)菌FimH抗原的同時(shí)，對(duì)自身的LAMP-2蛋白也發(fā)生了交叉反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，UPEC存在于多種菌毛，包括：P型、S型、Dr家族黏附素和Ⅰ型菌毛等［3］。Ⅰ型菌毛作為重要毒力因子在UPEC中分布廣泛，除黏附定殖能力外，F(xiàn)imH位于最頂端，是真正的黏附素能夠與含有甘露糖的糖蛋白受體結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)菌與多種宿主細(xì)胞黏附［4］。FimH蛋白在免疫方面也起重要作用［2］。然而，感染UPEC的患者與發(fā)生自身免疫疾病、甚至FNGN的可能機(jī)制有待進(jìn)一步探討。本研究通過(guò)克隆含有與LAMP-2P41-49完全同源序列的UPECⅠ型菌毛FimH1-156為目的基因的原核載體，表達(dá)并純化其融合蛋白，為建立FNGN實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型提供材料和基礎(chǔ)，也為基于LAMP-2靶抗原的多肽疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 pET-28a（＋）質(zhì)粒由全軍免疫研究所鄒麗云教師贈(zèng)送，含F(xiàn)imH1-156基因序列的pPKL241質(zhì)粒由丹麥Per Klemm教授饋贈(zèng)，大腸桿菌DH5α由本室保存，感受態(tài)菌株BL21（DE3）購(gòu)自北京中杉公司。BamHⅠ、HindⅢ、KpnⅠ、DNA Marker、T4DNA連接酶均購(gòu)自大連Takara公司；預(yù)染蛋白 Marker（10×103～170×103）購(gòu)自 MBI公司；質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試分析試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega公司；IPTG購(gòu)自Merk公司；Ni-NTA樹(shù)脂購(gòu)自Qiagen公司；抗6×His抗體購(gòu)自Abcam公司。引物合成，質(zhì)粒測(cè)序由英濰捷基（上海）公司完成。

1.2 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a（＋）-FimH1-156的構(gòu)建 根據(jù)FimH1-156的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物序列為5′-ACG GGA TCC AAA CGT GTT ATT ACC CTG TTT GC-3′（含BamHⅠ酶切位點(diǎn)），下游引物的序列為：5′-CGG AAG CTT TTA GCC GCC AGT AGG CAC CAC CA-3′（含 HindⅢ酶切位點(diǎn)），引物均由英濰捷基（上海）公司合成。以質(zhì)粒pPKL241為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：98℃2min；98℃10s、55℃20s、72℃45s，循環(huán)30次；72℃延伸2min。用BamHⅠ、HindⅢ分別酶切PCR產(chǎn)物與pET28a（＋）質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收，將載體和目的片段用T4連接酶室溫連接5 h。將連接的重組質(zhì)粒pET28a（＋）-FimH轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，在含有10mg／L卡拉霉素的LB瓊脂糖培養(yǎng)基平板中37℃培養(yǎng)過(guò)夜。沿平板一直徑挑選3個(gè)菌落，擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，并用KpnⅠ與HindⅢ酶切鑒定，并送英濰捷基（上海）公司測(cè)序，確認(rèn)得到正確的重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒命名為pET28a-FimH1-156。

1.3 FimH1-156的誘導(dǎo)表達(dá)及純化 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pET28a-FimH1-156轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3），在含有10mg／L卡拉霉素的LB培養(yǎng)基中37℃搖菌過(guò)夜，后以1∶100轉(zhuǎn)接到20 mL新鮮的含10mg／L卡拉霉素的LB培養(yǎng)基。37℃搖菌2 h，A600nm約為0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度分別為0.00、0.01、0.10、1.00mmol／L，37℃搖菌誘導(dǎo)4h，6 000r／min 4℃低溫離心10min收菌。對(duì)上清液和沉淀均進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析，判定表達(dá)形式。誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白包含有6×His片段，適用Ni-NTA樹(shù)脂親和層析法純化目的蛋白。用10倍體積PBS重懸細(xì)菌，分別用10、20、50、100、250、500mmol／L 咪 唑、0.5mol／L 氯 化 鈉、10mmol／L Tris-HCl（pH＝8.0）溶液洗脫。

1.4 SDS-PAGE及蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè) 將純化后的FimH1-156蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析，300mA轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜2h，50g／L的脫脂奶粉室溫封閉1h，抗6×His（一抗：1∶1 000）室溫孵育1h，PBS-Tween20（PBST）洗膜3次，每次10min，羊抗鼠IgG（二抗：1∶5 000）室溫孵育1h，PBST洗膜3次，每次10min。加入發(fā)光劑后曝光、顯影。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pET28a（＋）-FimH酶切及鑒定 pPKL241-FimH1-156基因PCR產(chǎn)物、pET-28a（＋）經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳顯示，pET-28a（＋）在5 000～6 000有一特異條帶，F(xiàn)imH1-156在549bp處有特異條帶（圖1）。pET-28a（＋）與FimH1-156基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接后，轉(zhuǎn)化DH-5α，沿平板一條直徑，挑取3個(gè)單克隆，KpnⅠ為FimH1-156基因序列上的一個(gè)酶切位點(diǎn)，經(jīng)KpnⅠ和HindⅢ酶切后，可見(jiàn)圖2“1、3”為FimH基因連接上載體，而“2”為載體自連接。進(jìn)一步對(duì)重組質(zhì)粒送至英濰捷基（上海）公司進(jìn)行DNA測(cè)序，結(jié)果序列和閱讀框均完全正確。

圖1 FimH1-156基因PCR產(chǎn)物及pET-28a（＋）載體電泳分析

2.2 目的蛋白的純化 篩選到的陽(yáng)性pET28a（＋）-FimH1-156，將表達(dá)菌E.coli BL21（DE3）于37℃振蕩培養(yǎng)至A600nm值為0.6時(shí)，在誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時(shí)間為4h、IPTG濃度依次0.00、0.01、0.10、1.00mmol／L，在IPTG濃度為1.00mmol／L時(shí)，目的蛋白的表達(dá)最高。表達(dá)形式主要以包涵體表達(dá)（圖3）。進(jìn)一步嘗試pET28a（＋）-FimH1-156在E.coli BL21（DE3）于16℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，電泳檢測(cè)顯示無(wú)目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。Ni-NTA親和層析純化，可見(jiàn)250mmol／L咪唑洗脫液中有少量目的蛋白，但濃度較低（虛線↑），流穿溶液中仍然有較多蛋白（實(shí)線↑），表明純化效果不太好，蛋白掛柱能力差，見(jiàn)圖4。

圖2 重組原核表達(dá)載體pET28a（＋）-FimH1-156的酶切分析

圖3 不同濃度IPTG誘導(dǎo)及融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE分析

圖4 重組質(zhì)粒pET28a（＋）-FimH1-156表達(dá)純化檢測(cè)

2.3 目的蛋白的鑒定 取未誘導(dǎo)E.coli BL21（DE3）／pET28a（＋）-FimH1-156對(duì)照菌株；純化后重組蛋白FimH1-156和超聲后上清液及沉淀，進(jìn)行Western blot鑒定，抗體為抗6×His單克隆抗體（圖5），表明FimH融合基因pET28a（＋）-FimH1-156在E.coli BL21（DE3）中正確表達(dá)，形式為包涵體表達(dá)。

圖5 FimH1-156融合蛋白的Western blot分析

3 討 論

抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相關(guān)性血管炎（ANCA-associated systemic vasculitis，AASV）是一種典型的自身免疫性疾病，已證實(shí)傳統(tǒng)的ANCA相關(guān)的靶抗原有中性粒細(xì)胞髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）及蛋白酶3（protease 3，PR3）。van Putten等［5］研究韋格納肉芽腫與金黃色葡萄球菌感染的關(guān)系中，明確了感染與自身抗體的間接證據(jù)，但一直未能找到感染與MPO或PR3相關(guān)的直接證據(jù)?？筁AMP-2抗體是最近才發(fā)現(xiàn)的ANCA新亞型，Kain等［6］關(guān)于FNGN發(fā)病機(jī)制的研究提示，UPEC入侵人體后，宿主通過(guò)FimH啟動(dòng)針對(duì)LAMP-2的自身免疫是LAMP-2-ANCA相關(guān)性FNGN發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵，這提供了分子模擬的直接證據(jù)。目前，抗LAMP-2抗體被認(rèn)為是AASV更為特異而有效的標(biāo)志，存在于幾乎所有的FNGN患者中，與病變的相關(guān)性是傳統(tǒng)抗MPO及PR3-ANCA的2倍［6］；然而，有關(guān)抗LAMP-2抗體的臨床實(shí)際價(jià)值仍存在較大的爭(zhēng)議，有報(bào)道就對(duì)抗LAMP-2抗體與疾病的相關(guān)性提出質(zhì)疑，更多標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步研究［7-8］。

Kain等［2］的研究證實(shí)了人FNGN的LAMP-2靶抗原的致病性的表位，即P41-49（HGTVTYNGS）和P331-341（QGKYSTAQDCS），并成功構(gòu)建了WKY大鼠FNGN動(dòng)物模型。明確致病性表位后，特異性誘導(dǎo)針對(duì)LAMP-2靶抗原的免疫耐受，這有望成為個(gè)性化治療FNGN的有力手段，也為基于LAMP-2靶抗原的多肽疫苗開(kāi)發(fā)提供了可能。作者利用LAMP-2靶抗原的致病性的表位P41-49多肽聯(lián)合完全弗氏佐劑（complete freund′s adjuvant，CFA），乳化 后皮下注射 WKY 大鼠建立FNGN模型實(shí)驗(yàn)已經(jīng)完成，3只實(shí)驗(yàn)組大鼠24h尿蛋白定量明顯增多，但腎病理檢查未見(jiàn)明顯新月體及小球壞死，這可能與人工合成多肽免疫原性低有關(guān)。本研究成功構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pET28a（＋）-FimH1-156，采用大腸桿菌表達(dá)，獲得免疫原性更高的UPECⅠ型菌毛FimH1-156表達(dá)蛋白，通過(guò)Ni-NTA純化后，利用標(biāo)簽抗體進(jìn)一步間接鑒定了該表達(dá)蛋白，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果類(lèi)似［9］，該蛋白的表達(dá)形式也為包涵體，這可能與表達(dá)蛋白自身特性有關(guān)。隨后，作者采用反復(fù)凍融、超聲、離心和反復(fù)洗滌的方法，經(jīng)SDS-PAGE分析，切膠純化出較高純度的FimH1-156融合蛋白，為進(jìn)一步采用FimH1-156融合蛋白誘導(dǎo)WKY大鼠建立FNGN模型奠定基礎(chǔ)。

［1］Rashid T，Ebringer A.Autoimmunity in rheumatic diseases is induced by microbial infections via crossreactivity or molecular mimicry［J］.Autoimmune Dis，2012，2012：539282.

［2］Kain R，Exner M，Brandes R，et al.Molecular mimicry in pauci-immune focal necrotizing glomerulonephritis［J］.Nat Med，2008，14（10）：1088-1096.

［3］Bower JM，Eto DS，Mulvey MA.Covert operations of uropathogenic Escherichia coli within the urinary tract［J］.Traffic，2005，6（1）：18-31.

［4］Connell I，Agace W，Klemm P，et al.Type 1fimbrial expression enhances Escherichia coli virulence for the urinary tract［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（18）：9827-9832.

［5］van Putten JW，van Haren EH，Lammers JW.Association between Wegener′s granulomatosis and Staphylococcus aureus infection［J］.Eur Respir J，1996，9（9）：1955-1957.

［6］Kain R，Tadema H，McKinney EF，et al.High prevalence of autoantibodies to hLAMP-2in anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23（3）：556-566.

［7］Roth AJ，Brown MC，Smith RN，et al.Anti-LAMP-2antibodies are not prevalent in patients with antineutrophil cytoplasmic autoantibody glomerulonephritis［J］.J Am Soc Nephrol，2012，23（3）：545-555.

［8］Fervenza FC，Specks U.Vasculitis：Will LAMP enlighten us about ANCA-associated vasculitis［J］.Nat Rev Nephrol，2012，8（6）：318-320.

［9］尹曉琳，石新麗，魏林，等.尿路致病性大腸桿菌I型菌毛fimH和fimC基因原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2007，23（11）：1131-1134.