李 焱,陳 石,魏 東,程 朋,彭晶晶,趙振國,譚 勇

巨噬細胞是人體重要的免疫細胞,通過直接吞噬或抗原呈遞來參與機體免疫反應。既往研究發(fā)現(xiàn),巨噬細胞可通過直接殺傷腫瘤細胞,或通過呈遞腫瘤相關抗原誘導機體免疫應答來清除腫瘤細胞。同時另有一些研究發(fā)現(xiàn),巨噬細胞可促進腫瘤細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。本實驗擬通過研究巨噬細胞與肝癌細胞的相互作用,揭示巨噬細胞對肝癌細胞侵襲能力的影響,并探討可能的機制。

1 材料與方法

1.1材料 人肝癌細胞株SMMC7721及人單核/巨噬細胞株THP-1均購自上海中科院細胞庫；胎牛血清(FBS)、細胞培養(yǎng)基RPMI 1640、DMEM、胰蛋白酶、Hank平衡液為GIBCO公司產(chǎn)品；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)為Sigma公司產(chǎn)品；Transwell遷移小室、Matrigel基質(zhì)膠為BD公司產(chǎn)品；MMP-9 ELISA試劑盒為R&D公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分化誘導 將THP-1細胞株接種于含有150 ml/L FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中,待細胞增殖至對數(shù)生長期時收集,以1×109個/L接種于培養(yǎng)瓶中,加入200 nmol/L的PMA作用24 h。

1.2.2活化的巨噬細胞與肝癌細胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的建立 參考章必成等[2]方法,選擇遷移小室和24孔培養(yǎng)板建立Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)。首先在下室內(nèi)接種含1×104個處于對數(shù)生長期的SMMC7721細胞,4 h后實驗組在上室內(nèi)接種活化的THP-1細胞(1×104個),然后共培養(yǎng)。根據(jù)上室內(nèi)的細胞類型分為對照組(未接種任何細胞)和實驗組(接種活化的THP-1細胞)。

1.2.3Transwell侵襲模型檢測肝癌細胞侵襲能力 將侵襲小室放入滅菌的24孔板中,其中侵襲小室內(nèi)鋪Matrigel基質(zhì)膠。培養(yǎng)板中分別加入實驗組和對照組的培養(yǎng)液上清各1 ml。將1×104個肝癌細胞接種于遷移小室中,孵育箱中培育24 h后取出,用棉簽擦去內(nèi)表面的基質(zhì)膠和細胞。將其置入95%乙醇中固定10 min,行HE染色。顯微鏡下計數(shù)膜背面的細胞數(shù)目。每個樣本計數(shù)5個視野,取平均值進行比較。

1.2.4MMP-9檢測 MMP-9檢測按試劑盒說明進行。取實驗組和對照組的細胞培養(yǎng)液各12份,與稀釋液混合,孵育2 h,緩沖液清洗,依次加入結合物、底物、終止液,用酶標儀檢測結果。

2 結果

2.1兩組肝癌細胞侵襲能力的比較 在細胞培養(yǎng)基趨化作用下,對照組和實驗組肝癌細胞穿過Transwell小室的細胞數(shù)分別為40.2±7.1和61.2±13.8,對照組顯著多于實驗組(t=3.022,P=0.017)。

2.2兩組MMP-9水平的比較 兩組培養(yǎng)體系中,MMP-9水平分別是,實驗組(353.58±55.07)ng/ml,對照組(308.37±34.48)ng/ml,實驗組顯著高于對照組(t=2.411,P=0.025)。

3 討論

腫瘤與炎癥的聯(lián)系已被流行病學調(diào)查所證實,一方面慢性炎癥可以誘發(fā)腫瘤,與炎癥相關的腫瘤約占15%左右[3],肝癌就是其中的典型。另一方面腫瘤細胞和間質(zhì)細胞可產(chǎn)生大量的炎癥因子,在腫瘤局部微環(huán)境中產(chǎn)生一系列的生物學效應,諸如促進血管、淋巴管生成；抑制局部免疫反應和免疫監(jiān)視,形成免疫逃逸；破壞細胞基質(zhì),促進侵襲轉(zhuǎn)移等等。而腫瘤局部微環(huán)境中的炎癥因子可趨化大量的巨噬細胞聚集。Takanami等[4]研究113例肺腺癌患者手術標本中巨噬細胞浸潤的密度,發(fā)現(xiàn)巨噬細胞是獨立的預后因素,高密度巨噬細胞浸潤的患者預后較差。

細胞外基質(zhì)是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的主要屏障,基質(zhì)的降解與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關。金屬基質(zhì)蛋白酶是目前發(fā)現(xiàn)的參與基質(zhì)降解的主要因子[5]。在肝癌相關研究中有報道,腫瘤基質(zhì)中金屬基質(zhì)蛋白酶的表達水平是肝癌術后復發(fā)的預測因素之一[6]。

巨噬細胞可分泌包括金屬蛋白酶在內(nèi)的多種基質(zhì)水解酶,還可分泌一些因子作為金屬基質(zhì)蛋白酶的活化劑,參與細胞外基質(zhì)的破壞。Hagemann等[7]報道,將巨噬細胞和卵巢癌細胞共培養(yǎng)后,可上調(diào)腫瘤細胞和巨噬細胞的基質(zhì)金屬蛋白酶表達。Hiraoka等[8]在使用特異性巨噬細胞清除劑后,明顯抑制了肺癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生。研究者分析原因,認為巨噬細胞在腫瘤局部的趨化因子的誘導下,進入腫瘤組織并分泌多種基質(zhì)水解酶；同時細胞外基質(zhì)的分解產(chǎn)物又與腫瘤細胞及巨噬細胞表面的Toll樣受體結合,逆向激活一系列活性細胞因子的表達(含金屬基質(zhì)蛋白酶的表達)[9-10]。本研究通過模擬腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞與腫瘤細胞的相互作用,也看到了類似現(xiàn)象,在腫瘤細胞與巨噬細胞共培養(yǎng)的體系中,腫瘤細胞的侵襲能力得到增強,并且與金屬基質(zhì)蛋白酶的表達增高有關。

因此,更深入地研究巨噬細胞促進腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機制,并將這些機制應用于巨噬細胞在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的研究,將為腫瘤的治療提供新的方法。

【參考文獻】

[1] Lewis CE,Pollard JW.Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments[J].Cancer Res,2006,66(2):605-612.

[2] 章必成,王俊,趙勇,等.不同活化表型的巨噬細胞對Lewis肺癌細胞增殖和侵襲的影響[J].第三軍醫(yī)大學學報,2007,29(11):1013-1016.

[3] Allavena P,Garlanda C,Borrello MG.Pathways connecting inflam-mation and cancer[J].Curr Opin Gene Dev,2008,18(1):3-10.

[4] Takanami I,Takeuchi K,Kodaira S.Tumor-associated macrophage infiltration in pulmonary adenocarcinoma:association with angiogenesis and poor prognosis[J].Oncology,1999,57(2):138-142.

[5] Vasiljeva O,Papazoglou A,Kruger A,et al.Tumor cell-derived and macrophage-derived cathepsin B promotes progression and lung metastasis of mammary cancer[J].Cancer Res,2006,66(10):5242-5250.

[6] Zhang Q,Chen X,Zhou J,et al.CD147,MMP-2,MMP-9 and MVD-CD34 are significant predictors of recurrence after liver transplantation in hepatocellular carcinoma patients[J].Cancer Biol Ther,2006,5(7):808-814.

[7] Hagemann T,Hagemann T,Wilson J,et al.Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-κB and JNK[J].J Immunol,2005,175:1197-1205.

[8] Hiraoka K,Zenmyo M,Watari K,et al.Inhibition of bone and muscle metastases of lung cancer cells by a decrease in the number of monocytes/macrophages[J].Cancer Sci,2008,99(8):1595-1602.

[9] Tsan MF,Gao B.Endogenous ligands of Toll-like receptors[J].J Leukoc Biol,2004,76(3):514-519.

[10] Kawamura T,Murakami K,Bujo H,et al.Matrix metallo-proteinase-3 enhances the free fatty acids-induced VEGF expression in adipocytes through Toll-like receptor 2[J].Exp Biol Med,2008,233(10):1213-1221.