李金綜述，唐燕華審校

NKX2-5與先天性心臟病發(fā)病關系的研究進展

李金綜述，唐燕華審校

NKX2-5是最早被發(fā)現與心臟發(fā)育及成熟相關的轉錄因子，其異常的表達將影響胚胎心臟發(fā)育，最終可能導致心臟結構畸形和傳導功能受損，甚至死亡。本文簡要地回顧了NKX2-5的生物學特性及其在心臟發(fā)育中的作用，并匯總了近幾年來在先天性心臟?。–HD）患者樣本中新發(fā)現的NKX2-5 基因突變，為后繼臨床研究提供參考。

轉錄因子；先天性心臟病；心臟發(fā)育；基因突變

先天性心臟?。–HD）是指在胚胎發(fā)育時期心臟及大血管的形成障礙或發(fā)育異常，或出生后應自動關閉的通道未能閉合的一類常見先天畸形。流行病學資料顯示，活產嬰兒先天性心臟病發(fā)病率約為0. 5%～0.8%[1]，由于CHD 表現形式多，病因復雜，其具體的發(fā)病機制至今仍不明確。隨著遺傳學研究的深入開展及分子生物技術的廣泛應用，人們對 CHD 的分子遺傳學研究已取得了令人矚目的成就，目前已有 NKX2-5、GATA4、TBX5、MYH6、ACTC1、 NOTCH1 等基因突變被證實與CHD的發(fā)生存在關聯(lián)[2]。其中NKX2-5最早被發(fā)現與心臟的發(fā)育及成熟相關，是心臟發(fā)育過程中的重要轉錄因子之一。自1998年 Schott 等[3]首次在 CHD 患者中檢測到NKX2-5基因的三個突變位點以來，在人群中開展 NKX2-5基因突變掃描已成為研究的熱點。本文就轉錄因子 NKX2-5在心臟發(fā)育中的作用及近年來新發(fā)現的基因突變位點與單純型 CHD 的關系進行闡述。

1 先天性心臟病簡述

CHD 是人類出生缺陷中最常見的畸形，約有80%的患者僅表現為心臟畸形，而不伴有其他系統(tǒng)的先天異常，稱之為單純型 CHD。CHD 多為散發(fā)病例，也有少數呈家族性發(fā)病。根據 CHD 臨床表現有無紫紺可分為紫紺型心臟病和非紫紺型 心臟病。紫紺型心臟病是因心臟和大血管結構異常而導致心內血液右向左分流的一類疾病，早期即可出現肺動脈高壓，包括法樂四聯(lián)癥（TOF）、單心室（SV）、大動脈轉位（TGV）等。而非紫紺型心臟病表型則更為復雜多樣，臨床上常見的類型有：房間隔缺損（ASD）、室間隔缺損（VSD）、動脈導管未閉（PDA）和房室傳導阻滯（AVB）等。

2 NKX2.5 生物學特征

人類 NKX2-5基因在進化過程中高度保守，也常被稱為CSX 基因或心臟特異性同源盒基因，其定位于染色體 5q35，具有兩個外顯子，互補脫氧核糖核酸（cDNA）全長1 585bp，可編碼含有324個氨基酸的蛋白[4]。NKX2.5 蛋白分子量為35 kDa，含有三個高度保守的結構域，它們分別是 TN 結構域（氨基酸10-21）、同源結構域（氨基酸138-197）及 NK2-SD結構域（氨基酸212-234）[3，4]。其中同源結構域又稱為 HD結構域，蛋白質三級結構表現為3個 a-螺旋，為可辨識螺旋，可特異結合于 DNA 順式作用元件5’-T（C/T）AAGTG-3’（NKE）序列，從而啟動下游基因的轉錄[5]。NK2-SD 結構域在體外基因實驗中表現出轉錄活性的抑制作用，而關于 TN區(qū)域的作用目前尚不明確。以上信息提示 HD 結構域可能是NKX2-5發(fā)揮下游基因調控作用的核心部位。

3 NKX2-5 在心臟發(fā)育中的作用

心臟發(fā)育是一個極其復雜的過程。最初心臟起源于三胚層胚盤頭端、口咽膜前方的臟壁中胚層（生心區(qū)），經歷了心臟細胞特化、心管發(fā)生、心臟環(huán)化，最終發(fā)育形成具有心房、心室、間隔和瓣膜等結構的成熟心臟。這些結構的形成和正常發(fā)育均涉及胚胎發(fā)育過程中的不同時間和空間的若干個特定基因或基因組的先后精準表達[6]。

在心臟發(fā)育過程中，相關特定基因的正常表達是形成具有功能性心臟的關鍵，而 NKX2-5正是這些相關特定基因中最早表達產物之一，也是心臟前體細胞最早的標志物。NKX2-5作為轉錄因子調控網絡的起始端，參與了心臟前體細胞的分化、心臟環(huán)化、房室分隔、房室流出道和傳導系統(tǒng)的形成及成體心臟正常功能的維持，并持續(xù)表達于心肌細胞分化的各個階段，在胚胎、胎兒乃至成體心肌細胞中均保持一定的表達水平[6]。

早在上世紀90年代，人們就從果蠅身上分離出與果蠅心臟發(fā)育密切相關的 tinman 基因（NK-2 型基因），并在以后的研究中證實其與 NKX2-5基因高度同源，它的突變會導致果蠅心臟形成異常。為進一步探討 NKX2-5基因的表達與人類心臟發(fā)育的關系，研究者們在與人類基因組類似的小鼠模型中初見端倪。Ueyama 等[7]報道了 NKX2-5從小鼠胚胎發(fā)育的第 7.5天開始表達，NKX2-5基因缺失的小鼠心臟環(huán)化受阻，約在第 11天左右死亡。Terada 等[8]利用他莫昔芬誘導敲除胚胎發(fā)育第 12.5天的小鼠 NKX2-5基因，結果發(fā)現小鼠在第 16天時出現心律失常、結構異常等現象，于第 17.5天時死亡。這些現象提示無論在胚胎發(fā)育的早期還是中期，NKX2-5基因的缺失都可能使心臟發(fā)育停滯在相應階段，甚至導致胚胎死亡。此外，Kasahara 等[9]NKX2-5基因過表達的研究中，也發(fā)現了小鼠于胚胎發(fā)育過程中出現房室傳導阻滯和心臟結構缺陷等表型。綜上可推測人類 NKX2-5基因表達的異常也可能對心臟正常形態(tài)、結構和傳導系統(tǒng)等造成重要影響。

4 NKX2-5 基因突變與先天性心臟病的關系

NKX2-5作為目前研究與心臟發(fā)育相關最廣泛的轉錄因子之一，其基因的測序和突變篩查備受研究者們關注。以往報道了40余種 NKX2-5基因突變位點可能與 CHD 的各種表型發(fā)生相關[4]。近年來，國內外學者在單純型 CHD 患者的血樣本或/和心肌組織樣本中至少探測出28種突變類型[10-24]，它們大部分為新發(fā)現的基因突變位點，其中發(fā)生在 HD 結構域的有4種，有1種發(fā)生在 NK2-SD結構域。這些基因突變廣泛分布于 NKX2-5基因編碼區(qū)及非編碼區(qū)的各個區(qū)域，包括錯義突變、缺失突變、插入突變和同義突變等（見表1和表2）。從表中不難看出NKX2-5基因突變與 CHD 的發(fā)生缺乏“突變—表型”對應關系，即同一突變位點可有多種 CHD表型，而同一 CHD 表型又可對應多種突變位點。此外，由于地理環(huán)境不同，人種不同，NKX2-5基因突變位點的檢出還存在明顯地域和人種差異[21]。

錯義突變是指編碼某種氨基酸的密碼子經堿基替換以后，變成編碼另一種氨基酸的密碼子，從而可使多肽鏈的氨基酸種類和序列發(fā)生改變，甚至對蛋白質的功能造成一定影響。新發(fā)現的錯義突變多在罕見的家族性 CHD 中被檢出，只有少部分來自于臨床常見的散發(fā)性 CHD 患者。2010年，Gioli-Pereira等[17]在1例散發(fā)性三尖瓣下移畸形的患者中發(fā)現了 C.124 G＞C 的變異，同時卻意外地在其無 CHD 表型的父母的血樣本中同樣檢測到了該突變。這提示用單基因突變解釋散發(fā)性 CHD 的發(fā)病機理可能存在缺陷。2012年，Granados-Riveron 等[20]在另1例散發(fā)性 ASD 患者中檢測到了NKX2-5基因與 MYH6 基因的聯(lián)合突變，其中前一個突變來源于無 CHD表型的父親，而后者則來源于無 CHD表型的母親。根據以上現象可以推測多基因聯(lián)合突變更應該用于闡明散發(fā)性單純型 CHD 的發(fā)病機制，而單基因錯義突變可能只增加 CHD 患病的易感性。

插入和缺失突變可導致核苷酸的總數發(fā)生變化，常在突變位點后產生新的讀碼框，編碼與之前完全不同的多肽鏈。新發(fā)現的2個缺失突變和1個插入突變，均來自于家族性單純型 ASD 患者，它們的出現使 NK2-SD 結構域氨基酸序列發(fā)生較大改變[16]，甚至導致 HD 結構域和 NK2-SD 結構域部分或完全缺失[12，18]。這暗示著插入和缺失突變對NKX2-5結構和功能的影響可能大于錯義突變，且與家族性 CHD 的發(fā)生關系可能更為密切。

不同于錯義突變，發(fā)生堿基替換而不引起編碼氨基酸的改變則稱為同義突變。傳統(tǒng)觀點認為同義突變因其未導致氨基酸一級結構改變，從而不引起蛋白質功能的變化，因此不會成為致病因素。然而隨著研究的深入，人們發(fā)現同義突變可能通過影響 mRNA 的轉錄進程或蛋白質的構象來調節(jié)蛋白質的表達和功能[25]。就高頻率出現于編碼區(qū)的 c.63 A＞G 變異而言[10-13，21]，有學者在獨立擴增實驗中發(fā)現堿基替換雖未引起21位的谷氨酸發(fā)生改變，但卻導致 mRNA 轉錄活性下降20%[12]，并且最新的 Meta 分析也證實了 c.63 A＞G 可能成為CHD 患病的危險因素[26]。另外，在 NKX2-5基因調控區(qū)、啟動區(qū)等非編碼區(qū)突變的研究中，學者們先后證實了部分增強子及啟動子區(qū)域位點的突變也將對轉錄活性產生減低或增強的影響，從而導致 NKX2-5異常表達[23，24]，進一步引發(fā)下游基因調控網絡的失衡，為CHD的發(fā)生機制提供另外一種可能的依據。

表1 NKX2-5基因編碼區(qū)突變位點、氨基酸改變及先天性心臟病表型等對比

表2 NKX2-5基因非編碼區(qū)位點突變及轉錄活性影響分析

5 結語與展望

總而言之，轉錄因子NKX2-5在胚胎心臟的發(fā)育過程中起到了舉足輕重的作用，它的異常表達將對心臟結構和傳導系統(tǒng)的發(fā)育造成重要影響。近年來，新檢出的突變在一定程度上擴增了 NKX2-5基因突變在 CHD 相關研究中的種類，為闡明 NKX2-5基因突變與單純性CHD的發(fā)病關系提供了更多的新思路。然而，遺憾的是新發(fā)現的突變大多未進一步行蛋白質表達和功能學分析，所以由這些突變所引發(fā)的氨基酸序列改變是否都能成為 CHD 患病的危險因素還缺乏有力證據。期待今后有更多的學者能參與到CHD患者 NKX2-5基因及其相關基因突變篩查的研究中，并同時能對新發(fā)現的或以往報道的突變行轉錄活性、蛋白質功能、轉染等相關分析，以明確突變引發(fā)的后果。為今后闡明 CHD的發(fā)病機理、基因產前診斷和基因靶向治療等提供新向導。

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2014-03-03）

（編輯：曹洪紅）

330006，江西省南昌市，南昌大學第二附屬醫(yī)院 心胸外科

李金 碩士研究生 主要從事心臟各類疾病與基因突變相關性研究 Email:m15870005858@163.com 通訊作者：唐燕華

Email:tyh6565@163.com

R541

A

1000-3614（2014）12-1061-03

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.026