劉崗, 鄭欣馨，魯潔，陳敬州，黃曉紅

茶多酚EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝基因和長(zhǎng)鏈非編碼RNA表達(dá)的影響*

劉崗, 鄭欣馨，魯潔，陳敬州，黃曉紅

目的：通過(guò)生物芯片技術(shù)觀察茶多酚表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNAs）表達(dá)的影響并探討后兩者可能的作用關(guān)系。

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯；脂質(zhì)代謝；長(zhǎng)鏈非編碼核糖核酸；生物芯片

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1039.)

茶多酚是綠茶中的主要有效成分。綠茶多酚又以兒茶素為主，其中表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG） 含量最高，約占兒茶素的80%。以往研究表明茶或茶多酚能降低血漿膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇水平, 預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展[1,2]，而茶多酚降脂作用的機(jī)制仍不明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs, lncRNAs）是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的RNA分子，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)lncRNAs在心臟發(fā)育及心血管疾病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用[3]。本研究運(yùn)用基因芯片技術(shù)，研究茶多酚EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因以及l(fā)ncRNAs表達(dá)的影響，從分子水平探討茶多酚影響脂質(zhì)代謝的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

材料：EGCG（純度＞95%）購(gòu)自Sigma 公司（美國(guó)）。EGCG溶解于0.1%二甲基亞砜（DMSO）溶液4℃貯存?zhèn)溆?。HepG2 細(xì)胞株購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)和RNA 提?。簩epG2 細(xì)胞用含10%的胎牛血清、100 U/ml 青霉素以及 100 μg/ml的鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5% CO2濃度及飽和濕度的恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到5×106～1×107/ml 時(shí)，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞分別接受以下2種處理：25 μmol/L EGCG（EGCG組）和0.1% DMSO（對(duì)照組）處理24 h。采用Trizol總抽提試劑盒 （Invitrogen公司，美國(guó)）抽提RNA。采用A260/280 分光光度比值及變性凝膠電泳鑒定mRNA質(zhì)量。

樣品標(biāo)記和芯片雜交：采用Affymetrix公司Human Transcriptome Array 2.0全轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)芯片（HTA2.0）。該芯片設(shè)計(jì)了約七百萬(wàn)條特異性探針，覆蓋人類基因組上近24萬(wàn)條編碼RNA轉(zhuǎn)錄本和4萬(wàn)條非編碼RNA轉(zhuǎn)錄本。樣品RNA按照Affymetrix公司的基因表達(dá)擴(kuò)增、標(biāo)記試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作（Affymetrix公司,美國(guó)）。首先對(duì)樣品中的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后通過(guò)生物素標(biāo)記的核糖核酸和末端轉(zhuǎn)移酶，以體外轉(zhuǎn)錄（IVT）的方式擴(kuò)增并標(biāo)記cDNA探針。芯片雜交按照Affymetrix公司的標(biāo)準(zhǔn)化操作流程和提供的配套試劑盒 （Affymetrix公司,美國(guó)）進(jìn)行，在滾動(dòng)雜交爐中45℃，16小時(shí)滾動(dòng)雜交，雜交完成后按照Affymetrix提供的標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行芯片的洗滌。

芯片掃描及數(shù)據(jù)分析：芯片結(jié)果采用GeneChip?Scanner 3000 （Affymetrix公司,美國(guó)）進(jìn)行掃描，用Command Console Software 3.1 （Affymetrix公 司 ,美國(guó)）讀取原始數(shù)據(jù)，質(zhì)控合格的數(shù)據(jù)采用Expression Console進(jìn)行歸一化處理。差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)：兩組差異為有效基因，且EGCG組單個(gè)樣本Fold Change（探針在細(xì)胞中表達(dá)差異程度） ≥1.5或 ≤-1.5。運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)差異lncRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)。利用UCSC基因組瀏覽器在lncRNA的位置上下游10 kbp范圍內(nèi)尋找相關(guān)mRNA-順式作用[4]。根據(jù)與mRNA的序列互補(bǔ)性及RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)算法，評(píng)價(jià)lncRNA與mRNA結(jié)合的能力，通過(guò)BLAST軟件初篩后用RNAplex軟件篩選出lncRNAs反式作用的靶基因[5]。

實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）驗(yàn)證：HepG2細(xì)胞經(jīng)EGCG 10 μmol/L 和25 μmol/L處理后，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR法驗(yàn)證lncRNA AT102202、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶及低密度脂蛋白受體。PCR 反應(yīng)采用SYBR Green PCR 試劑盒（Takara公司，日本），在FTC3000 實(shí)時(shí)定量PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)條件如下：95℃，3min；（1 個(gè)循環(huán)），95℃，30 s, 62℃，40 s；（40 個(gè)循環(huán)）。PCR 引物由上海生工公司合成：低密度脂蛋白受體（forward primer：5’GGTCTTTACGTGTTCCAAGG3’；reverse primer：5’CGCAGTTTTCCTCGTCAGAT3’）。 羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（forward primer：5’GCAGCAAACATTGTCACCG3’; reverse primer：5’CACCACCCACCGTTCCTAT3’）, AT102202（forward primer：5’AAAGTTTGCCCTCAGTTCCA 3’；reverse primer：5’GCAGCCAAAGCAGCACATAA 3’）。選擇3-磷酸甘油醛脫氫酶作為內(nèi)參基因，間接標(biāo)定靶cDNA 含量。用比較閾值法2（-ΔΔCT）計(jì)算EGCG組和對(duì)照組之間的基因表達(dá)水平的差異。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

細(xì)胞總RNA：A260/A280 值在1.9～2.0 之間，顯示RNA質(zhì)量良好，可供后續(xù)研究。

茶多酚EGCG對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝相關(guān)基因和lncRNA表達(dá)的影響：芯片結(jié)果顯示有27條脂質(zhì)代謝相關(guān)基因差異表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中12條表達(dá)上調(diào)，15條表達(dá)下調(diào)，主要涉及脂質(zhì)合成與代謝、脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝、胞核受體（表1）。其中有11個(gè)基因主要涉及膽固醇代謝，如羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶、低密度脂蛋白受體及乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶2（ACAT2）等，表明茶多酚EGCG可直接影響肝細(xì)胞的膽固醇代謝。此外, 茶多酚EGCG處理后共有180個(gè)lncRNA表達(dá)下調(diào)，85個(gè)lncRNA表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）。其中共有29條lncRNAs的表達(dá)差異在2倍以上（表2）。

表1 25μ mol/L 茶多酚EGCG處理HepG2細(xì)胞后芯片篩選出的差異表達(dá)脂代謝基因

表2 25μ mol/L茶多酚 EGCG處理HepG2細(xì)胞后芯片篩選出差異性表達(dá)2倍以上的lncRNA

lncRNA的靶基因預(yù)測(cè): lncRNA可能通過(guò)調(diào)控相應(yīng)的mRNA發(fā)揮功能，因此本研究根據(jù)生物信息學(xué)的方法對(duì)這些差異lncRNA進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)可能受相關(guān)lncRNA的順式調(diào)控（表3），其中AT102202預(yù)測(cè)的靶基因?yàn)榱u甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶。AT102202是一長(zhǎng)度為303個(gè)核苷酸的lncRNA，含4個(gè)外顯子，其3個(gè)外顯子與羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶基因第4～6外顯子高度重合（來(lái)自UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)），并且兩者的表達(dá)改變方向相反，提示AT102202可能通過(guò)順式作用抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的表達(dá)。此外，另一靶基因-ACAT2可能即受lncRNA（N342928）的順式調(diào)控亦可受lncRNA（AT115872）的反式調(diào)控。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證：結(jié)果顯示10 μmol/L和25μmol/L EGCG處理后，AT102202與低密度脂蛋白受體表達(dá)均增加（P＜0.05），而羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的表達(dá)呈顯著性下降（P＜0.05, 圖1）。說(shuō)明茶多酚EGCG誘導(dǎo)的差異基因的表達(dá)在實(shí)時(shí)定量PCR 和芯片結(jié)果具有一致性。

表3 長(zhǎng)鏈非編碼RNA的靶基因預(yù)測(cè)

圖1 熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)分析EGCG處理后對(duì)HepG2 細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA AT102202（1A）、羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（1B）、低密度脂蛋白受體（1C）mRNA水平的影響

3 討論

本研究采用生物芯片技術(shù)證實(shí)了茶多酚EGCG可廣泛地影響脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，涉及了脂質(zhì)合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝和降解各個(gè)過(guò)程。同時(shí)，EGCG能上調(diào)或下調(diào)數(shù)量眾多的lncRNA表達(dá)。我們通過(guò)生物信息學(xué)的方法建立了這些脂代謝相關(guān)基因與lncRNA的作用關(guān)系，提示這些lncRNA可能參與了EGCG對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控過(guò)程。

低密度脂蛋白膽固醇水平增高是影響動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生與發(fā)展的主要危險(xiǎn)因素，因此降低低密度脂蛋白膽固醇成為降脂治療、防治動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的首要目標(biāo)。最近一項(xiàng)納入1136名人群的薈萃分析系統(tǒng)評(píng)價(jià)了飲用綠茶或口服綠茶提取物對(duì)血脂譜的影響，結(jié)果表明綠茶多酚可顯著性地降低血總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平[1]。另一項(xiàng)大規(guī)模的流行病學(xué)研究顯示綠茶多酚的攝入量與高脂血癥的發(fā)病與進(jìn)展呈負(fù)相關(guān)，常年飲用綠茶≥2杯/天的人群具有更低的血脂水平，并且死于心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)降低達(dá)22%～33%[2]。因此我們推測(cè)綠茶多酚的降脂效應(yīng)可能是其心血管保護(hù)作用的重要原因。

芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶多酚EGCG可顯著地上調(diào)低密度脂蛋白受體和ACAT2的基因表達(dá)。低密度脂蛋白受體是調(diào)節(jié)血漿低密度脂蛋白膽固醇水平的細(xì)胞跨膜糖蛋白，在降低血漿低密度脂蛋白膽固醇水平中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可介導(dǎo)血中近2/3的低密度脂蛋白膽固醇進(jìn)入肝細(xì)胞降解[6]。因此茶多酚EGCG增加低密度脂蛋白受體的表達(dá)，并由低密度脂蛋白受體介導(dǎo)的低密度脂蛋白膽固醇的內(nèi)吞作用可能是其降低血漿膽固醇水平的主要機(jī)制之一。茶多酚EGCG降脂活性的另一個(gè)候選基因?yàn)锳CAT2。ACAT2 主要作用是催化肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的生成，在腸道膽固醇的吸收，極低密度脂蛋白的合成和分泌以及細(xì)胞內(nèi)膽固醇的儲(chǔ)存方面起重要作用[7]。以上表明茶多酚EGCG可直接作用于膽固醇的代謝過(guò)程，為綠茶多酚的降脂和心血管保護(hù)作用提供了有力的理論基礎(chǔ)。

此外，我們發(fā)現(xiàn)茶多酚EGCG可顯著地降低羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的表達(dá)，羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶是細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成的限速酶和膽固醇反饋調(diào)節(jié)的主要節(jié)點(diǎn)，也是他汀類藥物作用的靶點(diǎn)[8]。全基因組關(guān)聯(lián)研究表明羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶單核苷酸多態(tài)性是決定血漿膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平的重要因素之一，其效應(yīng)大?。‥ffect Size）與載脂蛋白B和低密度脂蛋白受體相近[9]。本研究中，我們觀察到茶多酚EGCG降低羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶表達(dá)同時(shí)可增加低密度脂蛋白受體基因的表達(dá)。因?yàn)榈兔芏戎鞍资荏w基因的表達(dá)主要受到細(xì)胞內(nèi)膽固醇內(nèi)水平經(jīng)過(guò)反饋機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量降低時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子-膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP）活化并進(jìn)入胞核激活靶基因低密度脂蛋白受體的表達(dá)[6]。因此EGCG可能通過(guò)抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇合成從而反饋性地增加低密度脂蛋白受體基因的表達(dá)。

目前，lncRNAs在脂代謝中的作用仍不清楚。本研究利用基因芯片技術(shù)觀察到EGCG可廣泛地引起lncRNAs基因表達(dá)的改變。這些表達(dá)差異的lncRNAs可能參與了茶多酚EGCG對(duì)心血管的保護(hù)作用包括它的降脂效應(yīng)。本研究首次通過(guò)生物信息學(xué)的方法構(gòu)建了這些脂代謝基因與lncRNAs的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多個(gè)脂代謝相關(guān)基因可能受lncRNAs的順式抑或反式調(diào)控。其中l(wèi)ncRNAAT102202預(yù)測(cè)的靶基因即為羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶，兩組在基因位置上重疊并且表達(dá)改變方向相反，提示AT102202可能通過(guò)某種機(jī)制抑制羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的表達(dá)。LncRNAs對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用表現(xiàn)為多樣復(fù)雜性，它既可與染色質(zhì)修飾復(fù)合物（如PcG蛋白復(fù)合體）結(jié)合引起特異性的組蛋白修飾模式，通過(guò)表觀遺傳作用激活或抑制轉(zhuǎn)錄[10,11]，亦可通過(guò)多種機(jī)制在轉(zhuǎn)錄水平激活或抑制基因表達(dá)，如lncRNA能夠和靶基因啟動(dòng)子區(qū)域形成RNADNA3螺旋結(jié)構(gòu)，從而阻止轉(zhuǎn)錄因子TFIID的結(jié)合抑制基因的表達(dá)[12]。而AT102202對(duì)羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的作用關(guān)系及機(jī)制仍需今后的功能研究證實(shí)，若能闡明這些問(wèn)題，將有望成為潛在的降脂治療新靶標(biāo)。

綜上所述，綠茶多酚可廣泛地引起脂質(zhì)代謝基因和lncRNA表達(dá)的改變，而lncRNA可能在脂質(zhì)代謝基因表達(dá)中發(fā)揮了調(diào)控作用。今后對(duì)lncRNA在脂代謝調(diào)控作用的闡明有望成為降脂治療的新的靶標(biāo)。

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Effects of Epigallocatechingallate on Lipid Metabolism Related Gene and Long Non-coding RNA Expression Profile in HepG2 Cells

LIU Gang, ZHENG Xin-xin, LU Jie, CHEN Jing-Zhou, HUANG Xiao-hong.
Department of Special Medical Treatment Center, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China.

HUANG Xiao-hong, Email: huangxhong12@gmail.com

Objective: To investigate the effects of epigallocatechingallate (EGCG) on lipid metabolism related gene and long noncoding RNA (lncRNA) expression prof i le by biochip technology, and to explore the possible relationship between the two elements.Methods: HepG2 cell was cultured with EGCG at 25μ mol/L for 24 hours, the total RNA was extracted and hybridized into the biochip of Human Transcriptome Array 2.0 for mRNA and lncRNA expression profile analysis. Bioinformatics technology was used to establish the possible relationship between lncRNA and the predicted target genes; the data obtained from biochip microarray was conf i rmed by real time RT-PCR examination.Results: The microarray revealed that EGCG treated HepG2 cell expressed 27 differential lipid metabolism genes and 11 of them involved in cholesterol metabolism. In addition, there 285 lncRNA expressions were up- or down-regulated. Bioinformatics technology indicated that the predicted target genes for lipid metabolism might be cis- or trans-regulated by lncRNA; the data from real-time RT-PCR was consistent with the data from biochip microarray.Conclusion: Tea polyphenols improves lipid metabolism and lncRNA might be involved in the regulation of lipid metabolism related gene.

Epigallocatechingallate; Lipid metabolism; Long non-coding RNA; Biochip

2014-03-12）

（編輯：常文靜）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81241007）

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 阜外心血管病醫(yī)院 特需醫(yī)療診治中心

劉崗 博士研究生 主要從事心血管病研究 Email：liugang327@126.com 通訊作者：黃曉紅 Email：huanxhong12@gmail.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1039-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.019

方法:人HepG2細(xì)胞經(jīng)EGCG（25 μmol/L）處理24 h 后，抽提RNA，并雜交至Human Transcriptome Array 2.0芯片進(jìn)行mRNA和lncRNAs表達(dá)譜的分析。通過(guò)生物信息學(xué)進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)建立兩者的可能作用關(guān)系，并應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（PCR ） 技術(shù)對(duì)芯片結(jié)果驗(yàn)證。

結(jié)果: HepG2細(xì)胞經(jīng)EGCG處理后表達(dá)差異的脂質(zhì)代謝相關(guān)基因?yàn)?7條，其中11條涉及膽固醇代謝。此外，芯片結(jié)果顯示有285條lncRNAs表達(dá)上調(diào)或下調(diào)。靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)多個(gè)脂代謝基因可能受lncRNAs順式或反式調(diào)控，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證與芯片結(jié)果一致。

結(jié)論: 茶多酚EGCG可直接改善脂質(zhì)代謝包括膽固醇的代謝，lncRNAs可能參與了對(duì)脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)調(diào)控。