齊康，蔣雷培，李向東，崔賀賀，金辰，李娜，李清，田夏秋，楊躍進

通心絡減輕糖尿病心肌缺血/再灌注損傷與其改善內(nèi)皮屏障功能有關(guān)*

齊康，蔣雷培，李向東，崔賀賀，金辰，李娜，李清，田夏秋，楊躍進

目的：探討通心絡對糖尿病心肌缺血/再灌注損傷的影響是否與調(diào)控內(nèi)皮屏障功能有關(guān)。

心肌再灌注損傷；血管內(nèi)皮鈣黏蛋白；微血管通透性；通心絡；2型糖尿病

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1020.)

再灌注治療的時代遺留了微血管缺血/再灌注損傷的難題。糖尿病損傷微血管內(nèi)皮，加重心肌再灌注損傷。研究發(fā)現(xiàn)通心絡可增加心臟微血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達，減輕心臟無再流和梗死范圍，因此通心絡具有潛在的內(nèi)皮屏障保護功能[1]。作為通心絡主要有效成分之一的人參皂苷Rg1可減輕心肌缺血/再灌注損傷[2]。通心絡是否通過改善內(nèi)皮屏障功能保護糖尿病心肌再灌注損傷尚不清楚。本研究通過對比通心絡和胰島素的心肌保護作用，明確通心絡對糖尿病心肌的保護作用和可能機制。

1 材料與方法

實驗動物與分組： 實驗時間自2013-12至2014-04。購自北京維通利華公司12周齡雄性Zucker糖尿病大鼠32只及Zucker非糖尿病大鼠8只，體質(zhì)量（325±25）g。糖尿病大鼠隨機分成4組（每組8只）：假手術(shù)組，模型組，胰島素組，通心絡組。8只非糖尿病大鼠作為對照組。模型組：結(jié)扎冠狀動脈前降支45 min，再灌注3 h。通心絡組：在結(jié)扎冠狀動脈前降支前30 min，將通心絡膠囊干粉（1.43 g生藥/g干粉，由河北以嶺藥業(yè)提供）混于蒸餾水中并進行一次大鼠灌胃（5 mg/100 g體重，劑量依據(jù)通心絡膠囊臨床用量換算）。胰島素組：在結(jié)扎冠狀動脈前降支前30 min開始給予胰島素（5 U/100 g體重）靜脈注射，監(jiān)測并維持血糖10 mmol/L。假手術(shù)組和對照組不給藥。

急性心肌梗死及再灌注模型的建立:手術(shù)前1 h，以10%水合氯醛（2 mg/kg）腹腔注射麻醉Zucker大鼠，呼吸機輔助呼吸。分離右側(cè)頸總動脈，進行血流動力學監(jiān)測。開胸結(jié)扎冠狀動脈前降支，阻斷血流45 min，松開絲線再灌注3 h。假手術(shù)組只穿線不結(jié)扎。

血流動力學監(jiān)測：結(jié)扎前和再灌注3 h時記錄左心室舒張末壓（LVEDP）和左心室內(nèi)壓最大收縮和舒張變化速率（+dP/dtmax和-dP/dtmin）。

動物處死、取材和梗死面積測定：再灌注3 h時，于原位重新結(jié)扎冠狀動脈前降支，從左心耳注入2%伊文氏藍（1 ml/kg）。10%氯化鉀靜脈注射后立即取出心臟，沿心臟長軸將心臟切成4～5片。將整個心肌片放入1% 2，3，5-氯化三苯基四氮唑溶液，37℃水浴15 min。測量左心室壁心肌面積、結(jié)扎區(qū)面積、梗死區(qū)面積。

微血管內(nèi)皮屏障功能評價：按照Li等[3]的方法，利用酶標儀測定心肌組織萃取液異硫氰酸熒光素濃度。按照經(jīng)典膜蛋白提取方法[4，5]，利用FOCUSTMGlobal Fractionation試劑盒進行膜蛋白提取，再通過蛋白印跡（Western blot）技術(shù)檢測心肌結(jié)扎區(qū)胞漿聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）不溶性和可溶性血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的表達量，并計算兩者的比值對定位于胞膜的血管內(nèi)皮鈣黏蛋白水平進行定量評估。

統(tǒng)計分析：用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。所有變量以表示。兩組間比較用t檢驗。結(jié)扎區(qū)面積、梗死區(qū)面積及異硫氰酸熒光素濃度等變量采用單因素方差分析中的Duncan法進行組間比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1各組動物急性心肌梗死再灌注前后生化和血流動力學變化（表1）

心肌缺血前：各組間血流動力學各指標差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。血糖模型組明顯高于對照組,胰島素組明顯低于模型組及假手術(shù)組（P均＜0.01）。

再灌注3 h時：血糖模型組、通心絡組均高于假手術(shù)組，胰島素組低于假手術(shù)組及模型組，通心絡組明顯高于胰島素組（P均＜0.01）。LVEDP模型組、胰島素組、通心絡組均高于假手術(shù)組，模型組高于對照組，胰島素組、通心絡組均低于模型組（P均＜0.01）。+dP/dtmax模型組顯著低于假手術(shù)組，胰島素組、通心絡組均顯著高于模型組（P均＜0.01）。- dP/dtmin模型組顯著高于假手術(shù)組，胰島素組、通心絡組均顯著低于模型組（P均＜0.01）。

2.2各組大鼠心肌梗死面積比較（表2）

各組間結(jié)扎區(qū)面積差異無統(tǒng)計學意義。模型組梗死面積明顯大于對照組（P＜0.01）。胰島素組和通心絡組梗死面積顯著小于模型組（P均＜0.01），而胰島素組和通心絡組梗死面積差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠急性心肌梗死再灌注前后生化和血流動力學參數(shù)(n=8，

表1 各組大鼠急性心肌梗死再灌注前后生化和血流動力學參數(shù)(n=8，

注：與假手術(shù)組比較**P＜0.01；與對照組比較△△P＜0.01；與模型組比較▲▲P＜0.01；與胰島素組比較##P＜0.01。 LVEDP：左心室舒張末壓 +dP/dtmax和-dP/dtmin：左心室內(nèi)壓最大收縮和舒張變化速率。1 mmHg=0.133 kPa

假手術(shù)組 對照組 模型組 胰島素組 通心絡組缺血前血糖 (mmol/L) 20.4±3.2 4.6±0.3 21.3±3.3△△ 10.2±1.9**▲▲ 21.6±3.1 LVEDP (mmHg) 4.5±1.1 4.6±1.3 4.5±1.2 4.1±1.1 4.5±1.2 +dP/dtmax(mmHg/s) 3998.1±152.3 3934.2±155.2 3957.3±165.3 3953.2±183.3 3923.1±167.4 -dP/dtmin(mmHg/s) -3746.4±175.4 -3795.5±189.4 -3802.4±183.3 -3805.3±181.2 -3738.4±180.3再灌注3 h時血糖 (mmol/L) 21.1±2.9 9.8±0.7 28.3±4.5**△△ 9.8±2.4**▲▲ 27.5±4.4**##LVEDP(mmHg) 7.3±1.2 16.7±1.1 19.9±1.4**△△ 12.4±1.2**▲▲ 12.6±1.3**▲▲+dP/dtmax(mmHg/s) 3359.2±167.2 2169.4±145.2 1952.3±138.4**△△ 3359.3±164.2▲▲ 3363.7±147.3▲▲-dP/dtmin(mmHg/s) -2167.3±183.5 -1599.3±175.8 -1240.3±167.6**△△ -2163.3±193.5▲▲ -2192.3±167.7▲▲

表2 各組大鼠結(jié)扎區(qū)和梗死區(qū)面積(n=8,%,

表2 各組大鼠結(jié)扎區(qū)和梗死區(qū)面積(n=8,%,

注：與對照組比較△△P＜0.01；與模型組比較▲▲P＜0.01。-：無

假手術(shù)組 對照組 模型組 胰島素組 通心絡組結(jié)扎區(qū)面積 - 40.8±1.4 40.3±1.2 41.7±1.1 42.0±1.2梗死面積 - 36.2±1.3 55.2±1.4△△36.8±1.2▲▲36.7±1.1▲▲

2.3各組大鼠心肌微血管通透性比較（表3）

模型組正常區(qū)異硫氰酸熒光素濃度略高于假手術(shù)組及對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。但模型組結(jié)扎區(qū)異硫氰酸熒光素濃度顯著高于對照組（P＜0.05）。胰島素組和通心絡組結(jié)扎區(qū)異硫氰酸熒光素濃度顯著低于模型組（P＜0.01），并且兩組間異硫氰酸熒光素濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。胰島素組和通心絡組正常區(qū)異硫氰酸熒光素濃度與假手術(shù)組濃度差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠正常區(qū)和結(jié)扎區(qū)異硫氰酸熒光素濃度的比較（ n=8,μ g/μl,

表3 各組大鼠正常區(qū)和結(jié)扎區(qū)異硫氰酸熒光素濃度的比較（ n=8,μ g/μl,

注：與假手術(shù)組比較**P＜0.01；與對照組比較△P＜0.05；與模型組比較▲▲P＜0.01。-：無

假手術(shù)組 對照組 模型組 胰島素組 通心絡組正常區(qū) 102.1±21.3 101.4±24.3 118.3±21.3 98.8±18.3 101.9±20.4結(jié)扎區(qū) - 164.2±16.4 204.7±18.1**△ 114.5±21.6▲▲ 113.5±20.9▲▲

2.4通心絡對大鼠血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達水平的影響（表4）

表4 各組大鼠結(jié)扎區(qū)或?qū)φ諈^(qū)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達水平的比較（n=8,%,

表4 各組大鼠結(jié)扎區(qū)或?qū)φ諈^(qū)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達水平的比較（n=8,%,

注：與假手術(shù)組比較*P＜0.05**P＜0.01；與對照組比較△P＜0.05△△P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.05

假手術(shù)組 對照組 模型組 胰島素組 通心絡組心肌結(jié)扎區(qū)胞膜 101.2±13.1 67.2±12.1 46.2±9.5**△ 84.2±6.4**▲ 83.5±6.7**▲心肌結(jié)扎區(qū)胞漿 100.4±14.3 146.3±21.4 165.2±29.4** 125.2±14.2*▲124.5±13.5▲胞膜/胞漿比值 101.1±12.2 46.2±6.4 28.3±4.5**△△ 66.2±7.6**▲ 67.3±6.4**▲

心肌結(jié)扎區(qū)胞膜(Triton X-100不溶性部分)血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達：模型組低于假手術(shù)組（P＜0.01），胰島素組和通心絡組也低于假手術(shù)組（P＜0.01），但兩組均高于模型組（P＜0.05）。心肌結(jié)扎區(qū)胞漿（Triton X-100可溶性部分）血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達：模型組、胰島素組均高于假手術(shù)組（P均＜0.01），胰島素組和通心絡組低于假手術(shù)組（P＜0.05）。胞膜/胞漿比值：模型組明顯低于假手術(shù)組及對照組（P＜0.01），胰島素組和通心絡組明顯高于模型組（P＜0.05），但低于假手術(shù)組（P＜0.01），并且胰島素組和通心絡組兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

本實驗結(jié)果顯示：① Zucker糖尿病大鼠再灌注3 h后，出現(xiàn)明顯的再灌注損傷，結(jié)扎區(qū)微血管通透性明顯增大，胞漿血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達增高，而胞膜血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達降低。②胰島素可明顯縮小梗死面積，減輕了再灌注損傷，降低了胞漿血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達，增加了胞膜血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達水平。③通心絡明顯縮小梗死面積，減輕再灌注損傷，降低胞漿血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達，增加胞膜血管內(nèi)皮鈣黏蛋白表達水平。

Ruder等[6]利用磁共振技術(shù)證實心肌缺血/再灌注損傷區(qū)域與血管內(nèi)皮通透性增加的區(qū)域相吻合，提示心肌再灌注損傷中存在著微血管屏障功能的破壞。本實驗中我們觀察到模型組心肌結(jié)扎區(qū)微血管的通透性與梗死面積呈明顯正相關(guān)，提示心肌微血管屏障功能的破壞在糖尿病大鼠的心肌再灌注損傷中同樣存在[3,7]。微血管內(nèi)皮屏障作為防止血液中有害物質(zhì)侵入心肌的第一道屏障，在再灌注損傷中可能具有重要意義。內(nèi)皮屏障破壞所導致的心肌水腫和間質(zhì)滲透壓的升高將帶來心肌血液灌注的進一步減少[3]。同時再灌注區(qū)微血管屏障的破壞促進了白細胞向心肌組織中的遷移和浸潤，進一步加重心肌損傷[8]。因此，缺血區(qū)血流恢復后的內(nèi)皮屏障障礙是引起再灌注損傷的可能機制。糖尿病作為心血管事件的公認危險因素，本身即可影響心臟微血管的構(gòu)成，可能使合并再灌注損傷時微血管通透性進一步增加[9-11]。

血管內(nèi)皮鈣黏蛋白是構(gòu)成心肌微血管屏障的重要結(jié)構(gòu)[12]。其水平的變化常常影響屏障功能，尤其是其定位于胞膜上的水平。靜息狀態(tài)下，血管內(nèi)皮鈣黏蛋白和血管內(nèi)皮生長因子受體-2結(jié)合形成復合體，是維持微血管完整性的關(guān)鍵。而當缺血時，二者解聚，血管內(nèi)皮鈣黏蛋白內(nèi)化、降解，最終導致了細胞連接蛋白的松散。此外，血管內(nèi)皮鈣黏蛋白還通過與肌球蛋白輕鏈激酶和整合素等蛋白的互相協(xié)調(diào)，以及信號轉(zhuǎn)導作用，調(diào)節(jié)內(nèi)皮的通透性，維護血管完整性，并且發(fā)揮信號轉(zhuǎn)導作用[13]。我們發(fā)現(xiàn)雖然模型中胞漿中的血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的含量增加，而胞膜血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的表達卻降低，提示再灌注損傷時的微血管屏障破壞可能與血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的功能不良相關(guān)。給予胰島素或通心絡治療后，糖尿病大鼠心肌梗死面積明顯下降，內(nèi)皮屏障功能改善，再灌注損傷減輕，同時胞膜上的血管內(nèi)皮鈣黏蛋白水平增加，提示這兩種治療的心肌保護作用可能與血管內(nèi)皮鈣黏蛋白介導的心肌微血管內(nèi)皮屏障功能的改善有關(guān)。

胰島素可降低糖尿病大鼠的血糖，減輕心肌再灌注損傷。但心肌梗死時降糖治療存在低血糖的風險，使胰島素在急性心肌梗死時的臨床應用存在局限性。本研究發(fā)現(xiàn)通心絡減輕心肌再灌注損傷的作用不依賴于血糖降低，但心肌保護效果不亞于胰島素降糖治療。胰島素和通心絡均可明顯減輕糖尿病大鼠結(jié)扎區(qū)心肌微血管通透性，胰島素和通心絡的保護作用與調(diào)控血管內(nèi)皮鈣黏蛋白在心臟微血管內(nèi)皮細胞的表達和分布有關(guān)。

結(jié)論：通心絡減輕心肌再灌注損傷與保護黏附連接介導的微血管內(nèi)皮屏障功能有關(guān)，這一保護作用不依賴于降糖，并且不亞于胰島素降糖治療。

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Protection of Tongxinluo Against Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury Relates to Enhancing Endothelial Barrier in Diabetic Rats

QI Kang, JIANG Lei-pei, LI Xiang-dong, CUI He-he, JIN Chen, Li Na, Li Qing, TIAN Xia-qiu, YANG Yue-jin.
State Key Laboratory of Cardiovascular Disease, Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital, CAMS and PUMC, Beijing (100037), China

YANG Yue-jin, Email: yangyjfw@126.com

Objective: To clarify that protection of Tongxinluo against myocardial ischemia/reperfusion injury relates to enhancing endothelial barrier in diabetic rats.Methods: A total of 32 Zucker diabetic rats were randomized into 4 groups: Sham group, Model group, Insulin group and Tongxinluo group, n=8 in each group. In addition, there was a Control group containing 8 non-diabetic Zucker rats. Myocardial ischemia/reperfusion injury model was established by a 45-min ischemia and 3-h reperfusion protocol. The size of infarction was detected by pathological staining, the microvascular permeability was examined by Miles assay to obtain the fl uorescein isothiocyanate concentration in myocardial tissue, the Triton X-100 soluble and insoluble VE-cadherin was measured by membrane protein extraction and western blot analysis.Results: The size of infarction in Model group was obviously higher than that in Control group (55.2 ± 1.4) % vs (36.2± 1.3) %, P＜0.05 and the fl uorescein isothiocyanate concentration was also higher in Model group than Control group. Both insulin group and Tongxinluo group had the similar size of infarction with Model group (36.8 ± 1.2) % vs (38.7 ± 1.1) %, P＞0.05. Both insulin group and Tongxinluo group got lower fl uorescein isothiocyanate concentration (all P＜0.01) and VE-cadherin internalization (all P＜0.05) than that in Model group.Conclusion: Protection of Tongxinluo against myocardial ischemia/reperfusion injury in diabetic rats is as effective asinsulin, but the effect is independent of reducing blood glucose and may be related to enhancing endothelial barrier.

Myocardial reperfusion injury; VE-cadherin; Microvascular permeability; Tongxinluo; Type 2 diabetes

2014-06-13）

（編輯: 王寶茹）

國家重點基礎研究發(fā)展規(guī)劃項目（項目編號：2012CB518602）資助 (973計劃項目)；國家自然科學基金（項目編號：81370223）；北京協(xié)和醫(yī)學院研究生創(chuàng)新基金項目（項目編號：2013-1002-39）

100037 北京市，北京協(xié)和醫(yī)學院 中國醫(yī)學科學院 國家心血管病中心 阜外心血管病醫(yī)院 心血管疾病國家重點實驗室

齊康 住院醫(yī)師 博士研究生 主要從事心血管病研究 Email: qikang1985@163.com 通訊作者：楊躍進 Email: yangyjfw@126.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1020-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.015

方法：將32只Zucker糖尿病大鼠隨機分為假手術(shù)組，模型組，胰島素組，通心絡組，每組8只。8只Zucker非糖尿病大鼠作為對照組。通過進行心肌缺血45 min/再灌注3 h干預以建立心肌再灌注損傷模型。通過病理染色法測定心肌梗死面積。采用Miles法，通過酶標儀測定心肌組織萃取液異硫氰酸熒光素濃度，從而反映心肌微血管通透性。利用膜蛋白提取和蛋白印跡（Western blot） 技術(shù)檢測聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）不溶性和可溶性血管內(nèi)皮鈣黏蛋白的表達量。

結(jié)果：模型組梗死面積顯著高于對照組[（55.2±1.4）% vs （36.2±1.3）%，P＜0.05]，模型組異硫氰酸熒光素濃度和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白內(nèi)化顯著高于對照組。胰島素組和通心絡組梗死面積均低于模型組[（36.8±1.2）% vs （38.7±1.1）%，P＞0.05]，胰島素組和通心絡組異硫氰酸熒光素濃度（P＜0.01）和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白內(nèi)化（P＜0.05）均明顯低于模型組。

結(jié)論：通心絡減輕心肌缺血/再灌注損傷與保護內(nèi)皮屏障功能有關(guān)，這一保護作用不依賴于降糖治療，并且不亞于胰島素降糖治療。