孟保英，張青，潘曉蘭，王元祥，沈定榮，提運(yùn)幸，馬超，彭樂

含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡的影響*

孟保英，張青，潘曉蘭，王元祥，沈定榮，提運(yùn)幸，馬超，彭樂

目的：探討含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對(duì)未成熟心肌細(xì)胞凋亡及Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)的影響。

先天性心臟?。粸跛舅?；自體冷血停搏液；凋亡

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:1011.)

心內(nèi)直視手術(shù)中主動(dòng)脈阻斷后，心肌保護(hù)效果關(guān)系到術(shù)中及術(shù)后心功能的恢復(fù)，故在缺血期間加強(qiáng)心肌細(xì)胞保護(hù)，減輕再灌注損傷尤為重要，因此尋求與未成熟心肌生理功能相適應(yīng)的保護(hù)措施，是國內(nèi)外心臟外科關(guān)注的焦點(diǎn)。近年來，我中心開展嬰幼兒心內(nèi)直視手術(shù)應(yīng)用自體冷血停搏液保護(hù)未成熟心肌的研究，已證實(shí)自體冷血停搏液對(duì)未成熟心肌保護(hù)優(yōu)于冷血停博液和晶體停搏液，但是仍然發(fā)現(xiàn)存在不同程度的心肌損傷，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上進(jìn)一步探索，開展嬰兒心內(nèi)直視手術(shù)應(yīng)用含烏司他丁自體冷血心臟停搏液，以期減輕心肌缺血－再灌注損傷。

1 資料與方法

選取2011-10至2012-08在我院收治的行體外循環(huán)室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)患兒60例，其中男32例，女28例，年齡3～12月，平均年齡（3.5±0.4）個(gè)月，體重4.1～10.5 kg，平均體重（5.3±0.3）kg。隨機(jī)分為含烏司他丁自體冷血心臟停搏液組（實(shí)驗(yàn)組）30例，男17例，女13例，及自體冷血心臟停搏液組（對(duì)照組） 30例，男15例，女15例。術(shù)前將所有患兒按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行心功能分級(jí)[1]，均為心功能Ⅱ級(jí)，術(shù)前無肝腎功能異常、肺炎等合并癥，末梢血象正常。（本研究符合作者所在單位人體實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并取得患兒家屬的知情同意。）

心臟停搏液制備：經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過，并經(jīng)監(jiān)護(hù)人知情同意，實(shí)驗(yàn)組：體外循環(huán)開始前，將烏司他?。◤V東天普生化醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，純度為5000 U/kg）加入前期抽取制備的心臟停搏液中（晶體母液15 ml），經(jīng)主動(dòng)脈根部按血液：晶體4∶1比例快速抽取血液，K+濃度20 mmol/L，抽血時(shí)間約30～50秒，保持動(dòng)脈收縮壓≥40 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），停搏液制備完畢后，經(jīng)主動(dòng)脈插管補(bǔ)充血容量以維持循環(huán)穩(wěn)定，并將配制的心臟停博液浸入冰屑液中制成4℃冷停搏液備用。對(duì)照組：停跳液抽取及制備均與實(shí)驗(yàn)組相同，但不含烏司他丁。

麻醉與灌注方法及標(biāo)本采集：二組患兒均全身麻醉及氣管插管，采用JOSTRA人工心肺機(jī)，POLYSTAN膜式氧合器，全血預(yù)充，體外循環(huán)采用淺、中低溫（25～32）℃，紅細(xì)胞比積0.25～0.30。并行循環(huán)降溫，阻斷升主動(dòng)脈，對(duì)照組經(jīng)主動(dòng)脈根部灌注4℃自體冷血心臟停搏液，實(shí)驗(yàn)組灌注含烏司他丁自體冷血心臟停搏液，首次劑量均為30 ml/kg，灌注壓力50 mmHg，間隔40 min灌注一次，體外循環(huán)結(jié)束時(shí)進(jìn)行改良超濾。分別于術(shù)前、主動(dòng)脈開放后10 min分別取手術(shù)患兒右心房組織。所有患兒體外循環(huán)時(shí)間（35～75）min，平均（53.3±3.2）min，主動(dòng)脈阻斷（20～50）min，平均（32.5±5.2）min。手術(shù)由同一組醫(yī)生、麻醉師、體外循環(huán)師合作完成。

dUTP缺口末端標(biāo)記法（TUNEL法）檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡：采用末端脫氧核糖核酸苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。按照福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司試劑盒說明書進(jìn)行。石蠟切片脫蠟至水，蛋白激酶K消化，過氧化氫阻斷，PBS液沖洗，TUNEL反應(yīng)液37℃ 60 min，DAB/ H2O2顯色（DAB為3,3二氨基聯(lián)苯胺），蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。正常心肌細(xì)胞核呈藍(lán)色，而凋亡陽性心肌細(xì)胞核呈棕黃色。每個(gè)標(biāo)本觀察4張切片，每張切片在光學(xué)顯微鏡400倍視野下分別隨機(jī)選擇5個(gè)工作區(qū)域，每個(gè)工作區(qū)域計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按公式計(jì)算：凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總觀察細(xì)胞數(shù)×100%。

心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)測(cè)定（免疫組化檢測(cè)）： 按照福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司試劑盒說明書進(jìn)行。制備石蠟切片，石蠟切片經(jīng)過二甲苯脫蠟（2次）、無水乙醇（2次）、95%乙醇及85%乙醇使組織再水化，進(jìn)行抗原修復(fù)（Bcl-2蛋白采用檸檬酸組織抗原修復(fù)，Bax蛋白采用EDTA法進(jìn)行抗原修復(fù)，嚴(yán)格按照說明書操作）。過氧化氫消除內(nèi)源性過氧化物酶，加非特異性染色阻斷劑，分別加一抗，4℃冰箱過夜，加酶標(biāo)羊抗小鼠IgG聚合物，室溫下孵育15 min。DAB顯色，自來水沖洗后用蘇木素復(fù)染，再用梯度乙醇和二甲苯脫水透明，中性樹膠封片。陽性表達(dá)判斷為鏡下胞漿內(nèi)有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，計(jì)數(shù)每個(gè)高倍鏡視野中100個(gè)細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)，每張切片中采集5個(gè)視野，求出均值，得出陽性細(xì)胞百分率。應(yīng)用GD-8型病理影像多媒體圖文操作系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析： 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用秩和檢驗(yàn)及t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組患兒體外循環(huán)情況

兩組患兒的主動(dòng)脈阻斷時(shí)間、體外循環(huán)時(shí)間、自動(dòng)復(fù)跳率及心室顫動(dòng)發(fā)生率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表1

表1 兩組患兒體外循環(huán)情況（n=30 ,

表1 兩組患兒體外循環(huán)情況（n=30 ,

注：對(duì)照組為自體冷血心臟停搏液組 實(shí)驗(yàn)組為含烏司他丁自體冷血心臟停搏液組

2.2兩組患兒心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

體外循環(huán)前5 min兩組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。主動(dòng)脈開放10 min兩組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較體外循環(huán)前5 min明顯增加（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組心肌凋亡指數(shù)較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表2

表2 兩組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè)結(jié)果（n=30 ,

表2 兩組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)檢測(cè)結(jié)果（n=30 ,

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05；與本組體外循環(huán)前5 min比較△P＜0.05。余注見表1

時(shí)間 對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組體外循環(huán)前5 min 6.98±0.51 7.22±0.56主動(dòng)脈開放10 min 23.47±3.01△ 13.56±2.28*△

2.3兩組不同時(shí)點(diǎn)心肌Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)比較

體外循環(huán)前5 min兩組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整, Bcl-2蛋白與Bax蛋白輕度表達(dá)，兩組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。主動(dòng)脈開放10 min兩組心肌Bcl-2蛋白與Bax蛋白明顯表達(dá)，較體外循環(huán)前5 min明顯增加，且實(shí)驗(yàn)組心肌Bcl-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，實(shí)驗(yàn)組心肌Bax蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Bcl-2蛋白及Bax蛋白表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)有棕黃色著色。表3，圖1、2

表3 兩組不同時(shí)點(diǎn)Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)比較（n=30,%,

表3 兩組不同時(shí)點(diǎn)Bcl-2蛋白和Bax蛋白表達(dá)比較（n=30,%,

注：與對(duì)照組比較*P＜0.05；與本組體外循環(huán)前5min比較△P＜0.05。余注見表1

對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組Bcl-2蛋白表達(dá)體外循環(huán)前5 min 12.94±0.98 13.21±1.01主動(dòng)脈開放10 min 40.17±3.54△ 68. 31±4.26*△Bax蛋白表達(dá)體外循環(huán)前5 min 8.93±0.91 8.25±0.88主動(dòng)脈開放10 min 49.58±5.58△ 23.64±3.43*△

圖1 免疫組化分析兩組患兒右心房心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)（×400）

圖2 免疫組化分析兩組患兒右心房心肌細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)（×400）

2.4術(shù)后隨訪

兩組患兒術(shù)后均存活，術(shù)后隨訪1月～2年，隨訪率100%，心功能均為I級(jí)與術(shù)前心功能均為Ⅱ級(jí)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

先天性心臟病是引起嬰幼兒死亡的主要疾病之一，近年來盡管心臟外科技術(shù)發(fā)展迅速，但手術(shù)患兒日趨低齡、復(fù)雜、危重，心肌保護(hù)的不夠完善仍是嬰幼兒心臟術(shù)后心功能不全及住院病死率較高的重要原因[2]。自體血停搏液是我中心首創(chuàng)，抽取的自體血未接觸體外循環(huán)管道，不含有活化的中性粒細(xì)胞、各種細(xì)胞因子、細(xì)胞毒素和氧自由基等，紅細(xì)胞未被破壞，產(chǎn)生內(nèi)源性氧自由基清除劑，對(duì)消除氧自由基等有害物質(zhì)有一定作用。近年來，我中心開展嬰幼兒心內(nèi)直視手術(shù)應(yīng)用冷自體血停搏液保護(hù)未成熟心肌的研究，已證實(shí)冷自體血停搏液對(duì)未成熟心肌保護(hù)優(yōu)于冷血停博液和晶體停搏液，但是仍然存在不同程度的心肌損傷[3，4]。而研究表明烏司他丁對(duì)于消除自由基、防止心臟直視手術(shù)中心肌再灌注損傷有明顯作用。故我中心采用烏司他丁及自體血配制停跳液，進(jìn)行心內(nèi)直視手術(shù)灌注停跳，以期減輕心肌缺血再灌注損傷及及心肌細(xì)胞凋亡。

烏司他丁是一種能夠抑制多種蛋白水解酶活力的糖蛋白，能夠同時(shí)抑制胰蛋白酶、NE、磷脂酶A2、透明蛋白酶等多種水解蛋白酶的活性；其代謝產(chǎn)物也具有很強(qiáng)的水解酶的抑制作用，可抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，尤其可抑制黏附因子、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-8及氧自由基等的釋放，促進(jìn)白細(xì)胞介素-10的釋放。趙亞玲等[5]綜述可能存在一種通過凋亡和炎癥介導(dǎo)的心肌再灌注損傷。體外循環(huán)心臟直視手術(shù)心肌損傷主要是缺血－再灌注損傷，大量研究表明，缺血缺氧不僅導(dǎo)致心肌細(xì)胞的壞死，亦誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；而細(xì)胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的病理特征之一，且與心肌缺血再灌注損傷后的心律失常密切相關(guān)，亦與心肌重構(gòu)、心肌頓抑及心力衰竭等病理機(jī)理密切相關(guān)[6,7]。李琛等[8]研究發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死患者早期應(yīng)用烏司他丁，通過降低血清白介素-6水平，升高白介素-10、超氧化物歧化酶水平，對(duì)缺血-再灌注心肌起到保護(hù)作用。陽世雄等研究發(fā)現(xiàn)體外循環(huán)中應(yīng)用研究表明烏司他丁對(duì)于降低炎性介質(zhì)白細(xì)胞介素-6和白細(xì)胞介素-8有明顯作用，對(duì)于消除自由基、防止心臟直視手術(shù)中心肌再灌注損傷有明顯作用。烏司他丁可在一定程度上抑制心肌組織細(xì)胞粘附因子-1（ICAM-1）表達(dá)上調(diào)，減輕炎癥性反應(yīng)，起到心肌保護(hù)作用[9-11]。楊明紅等[12]研究表明含烏司他丁晶體心臟停搏液能夠減輕心肌損傷，具有良好的心肌保護(hù)作用。綜上所述采用烏司他丁及自體血配制停跳液，進(jìn)行心內(nèi)直視手術(shù)灌注停跳，以期減輕心肌缺血再灌注損傷及心肌細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞凋亡是由基因控制的主動(dòng)性死亡過程，機(jī)體內(nèi)存在多條細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑，其中“線粒體途徑”是最重要的途徑之一，Bcl-2家族蛋白是該途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[13]。Bcl-2和Bax蛋白是該族的兩個(gè)主要成員。Bcl-2蛋白主要定位于線粒體外膜，起抗凋亡的作用。而具有促凋亡作用的Bax蛋白則主要定位于細(xì)胞質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞受到調(diào)亡因子的誘導(dǎo)便向線粒體轉(zhuǎn)位。Bcl-2和Bax兩者相互競爭，雙相調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Bax表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)則阻止細(xì)胞凋亡，因此學(xué)者將Bcl-2和Bax稱為細(xì)胞的“死亡開關(guān)”[14,15]。

主動(dòng)脈開放10 min兩組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較體外循環(huán)前明顯增高，但烏司他丁自體血冷停搏液組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較自體血冷停搏液組明顯減低。主動(dòng)脈開放10 min兩組心肌Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)較體外循環(huán)前5 min明顯增加，且烏司他丁自體血冷停搏液組心肌Bcl-2蛋白表達(dá)較自體血冷停搏液組明顯增加，自體血冷停搏液組心肌Bax蛋白表達(dá)較烏司他丁自體血冷停搏液組明顯增加（P＜0.05）。以上結(jié)果可能是由于烏司他丁可抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，能夠消除自由基、減輕心臟直視手術(shù)中心肌再灌注損傷，使得心肌Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，可抑制體外循環(huán)心臟直視手術(shù)再灌注心肌細(xì)胞的凋亡，減輕心肌細(xì)胞損傷。故含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對(duì)未成熟心肌保護(hù)作用可能通過減輕心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷及抑制心肌細(xì)胞凋亡，從而減輕體外循環(huán)未成熟心肌細(xì)胞損傷，利于未成熟心肌保護(hù)。

通過本研究我們認(rèn)為含烏司他丁自體冷血心臟停搏液對(duì)未成熟心肌保護(hù)效果明顯優(yōu)于自體冷血心臟停搏液，能夠減輕心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷，利于術(shù)后心功能恢復(fù)，值得臨床推廣。

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Effect of Cold Self-blood Cardioplegia With Ulinastatin on Immature Myocardial Cell Apoptosis in Infant Patients

MENG Bao-ying, ZHANG Qing, PAN Xiao-lan, WANG Yuan-xiang, SHEN Ding-rong, TI Yun-xing, MA Chao, PENG Le.
Cardiovascular Center, Shenzhen Children’s Hospital, Shenzhen (518038), Guangdong, China

ZHANG Qing, Email:szzhangqing@126.com

Objective: To investigate the effect of cold self-blood cardioplegia with ulinastatin on immature myocardial cell apoptosis and protein expressions of Bcl-2, Bax in ventricular septal defect (VSD) infants.Methods: A total of 60 infants received VSD repairing operation with cardiopulmonary bypass (CPB) in our hospital were summarized. The patients were randomly divided into 2 groups: Test group, the infants received cold self-blood cardioplegia with ulinastatin when aortic cross-clamp was closed. Control group, the infants received cold self-blood cardioplegia when aortic cross-clamp was closed. n=30 in each group. The right atrium tissue was collected before CPB and 10 min after releasing aortic cross-clamp. The index of myocardial cell apoptosis was observed by TUNEL method, and the protein expressions of Bcl-2, Bax were examined by immunohistological method.Results: Both groups showed the higher index of myocardial cell apoptosis at 10 min after releasing aortic cross-clamp than 5 min before CPB, and the apoptosis index in Test group was lower than that in Control group, all P＜0.05. The protein expressions of Bcl-2 and Bax were obviously increased at 10 min after releasing aortic cross-clamp than 5 min before CPB in both groups. Compared with Control group, Test group presented the higher Bcl-2 protein expression and lower Bax protein expression, all P＜0.05.Conclusion: Cold self-blood cardioplegia with ulinastatin could protect immature myocardum from ischemia-reperfusion injury in VSD infants during CPB operation in clinical practice.

Congenital heart disease; Ulinastatin; Self-blood Cardioplegia; Apoptosis

2014-04-30）

（編輯: 王寶茹）

本項(xiàng)目為深圳市科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：201002115）

518038 廣東省，深圳市兒童醫(yī)院 心血管科

孟保英 主治醫(yī)師 碩士研究生 主要從事體外循環(huán)直視手術(shù)心肌保護(hù)方面的研究 Email:szmengbaoying@163.com 通訊作者：張青

Email:szzhangqing@126.com

R54

A

1000-3614（2014）12-1011-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.12.013

方法：選取在我院收治的行體外循環(huán)室間隔缺損修補(bǔ)術(shù)患兒60例，隨機(jī)分成含烏司他丁冷血停搏液組（實(shí)驗(yàn)組，n=30）和自體冷血停搏液組（對(duì)照組，n=30）。分別于術(shù)前、主動(dòng)脈開放后10 min分別取手術(shù)患兒右心房組織，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記（TUNEL）法觀察心肌細(xì)胞凋亡情況，免疫組化檢測(cè)Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)。

結(jié)果：主動(dòng)脈開放10 min兩組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)較體外循環(huán)前5 min明顯增加（P＜0.05），且實(shí)驗(yàn)組心肌凋亡指數(shù)較對(duì)照組明顯降低（P＜0.05），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。主動(dòng)脈開放10 min兩組心肌Bcl-2 蛋白與Bax蛋白明顯表達(dá)，較體外循環(huán)前5 min明顯增加，且實(shí)驗(yàn)組心肌Bcl-2蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，實(shí)驗(yàn)組心肌Bax蛋白表達(dá)較對(duì)照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

結(jié)論：含烏司他丁自體冷血停搏液對(duì)缺血再灌注心肌有保護(hù)作用，值得臨床廣泛推廣。