周鵬　林欽　黃紅霞等

摘 要 建立了同時定性與定量分析動物飼料種24中禁用藥物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLCMS/MS）分析方法。樣品經(jīng)Na2HPO4與飽和NaCl溶液共同鹽析， 乙腈提取，混合陽離子交換固相萃取柱（PCX）凈化，乙腈和0.3%甲酸溶液梯度洗脫，經(jīng)BEH C18色譜柱分離，串聯(lián)四級桿質(zhì)譜動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式監(jiān)測，穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)法定量。在最佳實驗條件下，24種禁用獸藥在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.9960，檢出限為1.0 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg，加標(biāo)回收率在77%～115%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。本方法的樣品前處理過程簡單，凈化效果好，有效解決了基質(zhì)效應(yīng)問題，靈敏度高，適用于各種飼料中多組分禁用獸藥的快速定性與定量分析。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)； 動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測； 禁用獸藥； 飼料

1 引 言

獸藥在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中具有舉足輕重的作用，但是由于養(yǎng)殖環(huán)境以及養(yǎng)殖水平不佳，或者為了提高飼料轉(zhuǎn)化率，出現(xiàn)濫用獸藥的現(xiàn)象。農(nóng)業(yè)部分別于2002年和2010年發(fā)布176號公告 [1 ]、193號公告 [2 ]和1519號公告 [3 ]，向社會公布了禁用藥物清單，包括腎上腺素受體激動劑、β1受體阻斷藥、抗組胺藥、抗高血壓藥等藥物。這些藥物多會通過食物鏈傳導(dǎo)，給人類帶來巨大危害。

近年來，科研人員針對不同種類藥物，研發(fā)出多種分析方法，主要包括基因芯片法 [4 ]、毛細(xì)管電泳法 [5 ]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 [6，7 ]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 [8，9 ]、高效液相色譜法 [10，11 ]、酶聯(lián)免疫法 [12 ]等。然而現(xiàn)有方法存在分析目標(biāo)物種類單一、部分化合物還未發(fā)現(xiàn)檢測方法，對預(yù)混料等復(fù)雜基質(zhì)樣品回收率較差等問題，不利于復(fù)雜樣本的大規(guī)模篩查。本研究對樣品處理方法進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了24種禁用藥物的分析方法，為飼料中違禁藥物的監(jiān)管提供了一種快速、可靠的檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

6490三重四級桿質(zhì)譜儀，配1290超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Waters BEH C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美國Waters 公司）；Avanti JE 離心機(jī)（美國貝克曼公司）； DS8510 DTH超聲波清洗機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)分別購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH和德國Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國Merck公司）；Na2HPO4、NaCl、氨水（分析純，國藥集團(tuán)）。Cleanert PCX混合陽離子交換固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL，博納艾杰爾科技公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜（津騰公司）；實驗樣品為市售樣品。

2.2 實驗方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取各種標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于

Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。準(zhǔn)確移取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列，其中4種內(nèi)標(biāo)濃度均為2.0 μg/L。

2.2.2 樣品的提取與凈化

稱取粉碎并混合均勻的飼料樣品（2.0±0.05） g于50 mL離心管中，分別加入100 μL內(nèi)標(biāo)（濃度為200 μg/L）、5 mL 1.0 mol/L Na2HPO4、5 mL飽和NaCl和5 mL乙腈溶液，振搖混勻后超聲提取30 min，每隔10 min振搖一次。超聲結(jié)束后離心5 min（4000 r/min），吸取上層乙腈于10 mL比色管中，下層再次加入5 mL 乙腈，搖勻后超聲提取20 min， 離心5 min（4000 r/min），合并乙腈層，用乙腈定容至10.0 mL。移取乙腈提取液2.0 mL，40 ℃下氮吹至近干，加入3mL 1%甲酸水渦旋復(fù)溶后待凈化。將上述溶液過柱（使用前依次用3 mL 1%甲酸甲醇、3 mL 1%甲酸水活化），依次用3 mL 1%甲酸水、3 mL 1%甲酸甲醇淋洗并抽干，最后3 mL 5%氨水甲醇洗脫。流速控制在1 mL/min以下。洗脫液在40 ℃下氮?dú)獯抵两桑?0%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液定容至2.0 mL，過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜后上機(jī)測試。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量 2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流動相A：0.3%甲酸水，流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min，0% B；0.5～8.0 min， 0%～65% B；8.01～10.0 min， 90% B；10.01～12.0 min， 0% B。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式；動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（dMRM）；脫溶劑氣溫度200 ℃；脫溶劑氣流速15 L/min；霧化氣壓力241.3 kPa； 鞘氣溫度350 ℃； 鞘氣流速12 L /min；毛細(xì)管電壓3.5 kV； 噴嘴電壓 0 V。

3 結(jié)果與討論

3.1 液相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

各化合物分別采用約1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。本實驗中的目標(biāo)化合物多數(shù)具有胺基結(jié)構(gòu)，易與質(zhì)子結(jié)合，形成 [M+H ]+離子，因此采用正離子模式進(jìn)行檢測，并選擇 [M+H ]+為母離子，響應(yīng)最高的子離子作為定量離子，響應(yīng)次高的離子作為定性離子。由于同時監(jiān)測的離子對較多，采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式可以有效地分配掃描時間，保證每個色譜峰足夠的采集點(diǎn)數(shù)以及靈敏度。萊克多巴胺與苯氧丙酚胺為同分異構(gòu)體，具有相同質(zhì)荷比的母離子及子離子，需優(yōu)化液相色譜分離條件，避免兩種化合物檢測中的相互干擾。流動相中加入少量甲酸不僅可以改善色譜峰形，而且有利于目標(biāo)化合物離子化，提高靈敏度。優(yōu)化后的各種待測化合物的保留時間、定性定量離子、碰撞能量、監(jiān)測時間窗口等參數(shù)見表1。

摘 要 建立了同時定性與定量分析動物飼料種24中禁用藥物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLCMS/MS）分析方法。樣品經(jīng)Na2HPO4與飽和NaCl溶液共同鹽析， 乙腈提取，混合陽離子交換固相萃取柱（PCX）凈化，乙腈和0.3%甲酸溶液梯度洗脫，經(jīng)BEH C18色譜柱分離，串聯(lián)四級桿質(zhì)譜動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式監(jiān)測，穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)法定量。在最佳實驗條件下，24種禁用獸藥在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.9960，檢出限為1.0 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg，加標(biāo)回收率在77%～115%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。本方法的樣品前處理過程簡單，凈化效果好，有效解決了基質(zhì)效應(yīng)問題，靈敏度高，適用于各種飼料中多組分禁用獸藥的快速定性與定量分析。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)； 動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測； 禁用獸藥； 飼料

1 引 言

獸藥在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中具有舉足輕重的作用，但是由于養(yǎng)殖環(huán)境以及養(yǎng)殖水平不佳，或者為了提高飼料轉(zhuǎn)化率，出現(xiàn)濫用獸藥的現(xiàn)象。農(nóng)業(yè)部分別于2002年和2010年發(fā)布176號公告 [1 ]、193號公告 [2 ]和1519號公告 [3 ]，向社會公布了禁用藥物清單，包括腎上腺素受體激動劑、β1受體阻斷藥、抗組胺藥、抗高血壓藥等藥物。這些藥物多會通過食物鏈傳導(dǎo)，給人類帶來巨大危害。

近年來，科研人員針對不同種類藥物，研發(fā)出多種分析方法，主要包括基因芯片法 [4 ]、毛細(xì)管電泳法 [5 ]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 [6，7 ]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 [8，9 ]、高效液相色譜法 [10，11 ]、酶聯(lián)免疫法 [12 ]等。然而現(xiàn)有方法存在分析目標(biāo)物種類單一、部分化合物還未發(fā)現(xiàn)檢測方法，對預(yù)混料等復(fù)雜基質(zhì)樣品回收率較差等問題，不利于復(fù)雜樣本的大規(guī)模篩查。本研究對樣品處理方法進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了24種禁用藥物的分析方法，為飼料中違禁藥物的監(jiān)管提供了一種快速、可靠的檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

6490三重四級桿質(zhì)譜儀，配1290超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Waters BEH C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美國Waters 公司）；Avanti JE 離心機(jī)（美國貝克曼公司）； DS8510 DTH超聲波清洗機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)分別購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH和德國Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國Merck公司）；Na2HPO4、NaCl、氨水（分析純，國藥集團(tuán)）。Cleanert PCX混合陽離子交換固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL，博納艾杰爾科技公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜（津騰公司）；實驗樣品為市售樣品。

2.2 實驗方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取各種標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于

Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。準(zhǔn)確移取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列，其中4種內(nèi)標(biāo)濃度均為2.0 μg/L。

2.2.2 樣品的提取與凈化

稱取粉碎并混合均勻的飼料樣品（2.0±0.05） g于50 mL離心管中，分別加入100 μL內(nèi)標(biāo)（濃度為200 μg/L）、5 mL 1.0 mol/L Na2HPO4、5 mL飽和NaCl和5 mL乙腈溶液，振搖混勻后超聲提取30 min，每隔10 min振搖一次。超聲結(jié)束后離心5 min（4000 r/min），吸取上層乙腈于10 mL比色管中，下層再次加入5 mL 乙腈，搖勻后超聲提取20 min， 離心5 min（4000 r/min），合并乙腈層，用乙腈定容至10.0 mL。移取乙腈提取液2.0 mL，40 ℃下氮吹至近干，加入3mL 1%甲酸水渦旋復(fù)溶后待凈化。將上述溶液過柱（使用前依次用3 mL 1%甲酸甲醇、3 mL 1%甲酸水活化），依次用3 mL 1%甲酸水、3 mL 1%甲酸甲醇淋洗并抽干，最后3 mL 5%氨水甲醇洗脫。流速控制在1 mL/min以下。洗脫液在40 ℃下氮?dú)獯抵两?，?0%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液定容至2.0 mL，過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜后上機(jī)測試。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量 2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流動相A：0.3%甲酸水，流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min，0% B；0.5～8.0 min， 0%～65% B；8.01～10.0 min， 90% B；10.01～12.0 min， 0% B。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式；動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（dMRM）；脫溶劑氣溫度200 ℃；脫溶劑氣流速15 L/min；霧化氣壓力241.3 kPa； 鞘氣溫度350 ℃； 鞘氣流速12 L /min；毛細(xì)管電壓3.5 kV； 噴嘴電壓 0 V。

3 結(jié)果與討論

3.1 液相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

各化合物分別采用約1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。本實驗中的目標(biāo)化合物多數(shù)具有胺基結(jié)構(gòu)，易與質(zhì)子結(jié)合，形成 [M+H ]+離子，因此采用正離子模式進(jìn)行檢測，并選擇 [M+H ]+為母離子，響應(yīng)最高的子離子作為定量離子，響應(yīng)次高的離子作為定性離子。由于同時監(jiān)測的離子對較多，采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式可以有效地分配掃描時間，保證每個色譜峰足夠的采集點(diǎn)數(shù)以及靈敏度。萊克多巴胺與苯氧丙酚胺為同分異構(gòu)體，具有相同質(zhì)荷比的母離子及子離子，需優(yōu)化液相色譜分離條件，避免兩種化合物檢測中的相互干擾。流動相中加入少量甲酸不僅可以改善色譜峰形，而且有利于目標(biāo)化合物離子化，提高靈敏度。優(yōu)化后的各種待測化合物的保留時間、定性定量離子、碰撞能量、監(jiān)測時間窗口等參數(shù)見表1。

摘 要 建立了同時定性與定量分析動物飼料種24中禁用藥物的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLCMS/MS）分析方法。樣品經(jīng)Na2HPO4與飽和NaCl溶液共同鹽析， 乙腈提取，混合陽離子交換固相萃取柱（PCX）凈化，乙腈和0.3%甲酸溶液梯度洗脫，經(jīng)BEH C18色譜柱分離，串聯(lián)四級桿質(zhì)譜動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測正離子模式監(jiān)測，穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)法定量。在最佳實驗條件下，24種禁用獸藥在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.9960，檢出限為1.0 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg，加標(biāo)回收率在77%～115%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。本方法的樣品前處理過程簡單，凈化效果好，有效解決了基質(zhì)效應(yīng)問題，靈敏度高，適用于各種飼料中多組分禁用獸藥的快速定性與定量分析。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜； 穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)； 動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測； 禁用獸藥； 飼料

1 引 言

獸藥在養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展中具有舉足輕重的作用，但是由于養(yǎng)殖環(huán)境以及養(yǎng)殖水平不佳，或者為了提高飼料轉(zhuǎn)化率，出現(xiàn)濫用獸藥的現(xiàn)象。農(nóng)業(yè)部分別于2002年和2010年發(fā)布176號公告 [1 ]、193號公告 [2 ]和1519號公告 [3 ]，向社會公布了禁用藥物清單，包括腎上腺素受體激動劑、β1受體阻斷藥、抗組胺藥、抗高血壓藥等藥物。這些藥物多會通過食物鏈傳導(dǎo)，給人類帶來巨大危害。

近年來，科研人員針對不同種類藥物，研發(fā)出多種分析方法，主要包括基因芯片法 [4 ]、毛細(xì)管電泳法 [5 ]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 [6，7 ]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法 [8，9 ]、高效液相色譜法 [10，11 ]、酶聯(lián)免疫法 [12 ]等。然而現(xiàn)有方法存在分析目標(biāo)物種類單一、部分化合物還未發(fā)現(xiàn)檢測方法，對預(yù)混料等復(fù)雜基質(zhì)樣品回收率較差等問題，不利于復(fù)雜樣本的大規(guī)模篩查。本研究對樣品處理方法進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了24種禁用藥物的分析方法，為飼料中違禁藥物的監(jiān)管提供了一種快速、可靠的檢測方法。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

6490三重四級桿質(zhì)譜儀，配1290超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Waters BEH C18色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.7 μm， 美國Waters 公司）；Avanti JE 離心機(jī)（美國貝克曼公司）； DS8510 DTH超聲波清洗機(jī)（上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司）。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)以及穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)分別購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH和德國Witega公司。甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國Merck公司）；Na2HPO4、NaCl、氨水（分析純，國藥集團(tuán)）。Cleanert PCX混合陽離子交換固相萃取柱（PCX，60 mg/3 mL，博納艾杰爾科技公司）； 0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜（津騰公司）；實驗樣品為市售樣品。

2.2 實驗方法

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 分別準(zhǔn)確稱取各種標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于

Symbolm@@ 18 ℃下避光保存。準(zhǔn)確移取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用10%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液逐級稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列，其中4種內(nèi)標(biāo)濃度均為2.0 μg/L。

2.2.2 樣品的提取與凈化

稱取粉碎并混合均勻的飼料樣品（2.0±0.05） g于50 mL離心管中，分別加入100 μL內(nèi)標(biāo)（濃度為200 μg/L）、5 mL 1.0 mol/L Na2HPO4、5 mL飽和NaCl和5 mL乙腈溶液，振搖混勻后超聲提取30 min，每隔10 min振搖一次。超聲結(jié)束后離心5 min（4000 r/min），吸取上層乙腈于10 mL比色管中，下層再次加入5 mL 乙腈，搖勻后超聲提取20 min， 離心5 min（4000 r/min），合并乙腈層，用乙腈定容至10.0 mL。移取乙腈提取液2.0 mL，40 ℃下氮吹至近干，加入3mL 1%甲酸水渦旋復(fù)溶后待凈化。將上述溶液過柱（使用前依次用3 mL 1%甲酸甲醇、3 mL 1%甲酸水活化），依次用3 mL 1%甲酸水、3 mL 1%甲酸甲醇淋洗并抽干，最后3 mL 5%氨水甲醇洗脫。流速控制在1 mL/min以下。洗脫液在40 ℃下氮?dú)獯抵两?，?0%乙腈水（含0.2%甲酸）溶液定容至2.0 mL，過0.22 μm 聚四氟乙烯濾膜后上機(jī)測試。

2.3 色譜質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 柱溫 40 ℃；進(jìn)樣量 2.0 μL；流速：0.3 mL/min；流動相A：0.3%甲酸水，流動相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～0.5 min，0% B；0.5～8.0 min， 0%～65% B；8.01～10.0 min， 90% B；10.01～12.0 min， 0% B。

2.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子模式；動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測（dMRM）；脫溶劑氣溫度200 ℃；脫溶劑氣流速15 L/min；霧化氣壓力241.3 kPa； 鞘氣溫度350 ℃； 鞘氣流速12 L /min；毛細(xì)管電壓3.5 kV； 噴嘴電壓 0 V。

3 結(jié)果與討論

3.1 液相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

各化合物分別采用約1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液直接進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化。本實驗中的目標(biāo)化合物多數(shù)具有胺基結(jié)構(gòu)，易與質(zhì)子結(jié)合，形成 [M+H ]+離子，因此采用正離子模式進(jìn)行檢測，并選擇 [M+H ]+為母離子，響應(yīng)最高的子離子作為定量離子，響應(yīng)次高的離子作為定性離子。由于同時監(jiān)測的離子對較多，采用動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測模式可以有效地分配掃描時間，保證每個色譜峰足夠的采集點(diǎn)數(shù)以及靈敏度。萊克多巴胺與苯氧丙酚胺為同分異構(gòu)體，具有相同質(zhì)荷比的母離子及子離子，需優(yōu)化液相色譜分離條件，避免兩種化合物檢測中的相互干擾。流動相中加入少量甲酸不僅可以改善色譜峰形，而且有利于目標(biāo)化合物離子化，提高靈敏度。優(yōu)化后的各種待測化合物的保留時間、定性定量離子、碰撞能量、監(jiān)測時間窗口等參數(shù)見表1。