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        基于聚(3,4—乙烯二氧噻吩)/天青Ⅰ復(fù)合物薄膜和納米金修飾的電流型甲胎蛋白免疫傳感器的研究

        2014-03-04 21:23:56劉珂珂等
        分析化學(xué) 2014年2期
        關(guān)鍵詞:甲胎蛋白超純水電化學(xué)

        劉珂珂等

        摘要 研制了一種基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)與天青Ⅰ(Azure Ⅰ)為基體的電化學(xué)免疫傳感器,可靈敏檢測甲胎蛋白(AFP)。在鉑盤電極表面,電化學(xué)聚合PEDOT為基體,利用靜電組裝技術(shù)固定Azure Ⅰ和納米金顆粒(nanoAus),將甲胎蛋白抗體(antiAFP)組裝到nanoAus的表面。采用辣根過氧化物酶(HRP)封閉非特異性吸附位點(diǎn),制得電流型AFP免疫傳感器。采用循環(huán)伏安、掃描電鏡技術(shù)研究組裝過程及電極性質(zhì),探討了影響免疫傳感器性能的因素。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,電極響應(yīng)與AFP的濃度在0.01~120 μg/L的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,檢出限為0.003 μg/L。取臨床血清樣品用本方法檢測AFP含量,得到的結(jié)果與臨床常用的ELISA法得到的結(jié)果無顯著性差異。

        關(guān)鍵詞 聚(3,4乙烯二氧噻吩); 電化學(xué)免疫傳感器; 甲胎蛋白; 天青Ⅰ

        1引言

        血清中甲胎蛋白(AFP)的含量是臨床用于原發(fā)性肝癌和畸胎瘤的早期診斷、療效觀察和愈后判斷的重要指標(biāo)。目前,臨床用于AFP檢測的方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫測定法、化學(xué)發(fā)光法、熒光免疫法等[1,2],但存在靈敏度不高、步驟繁瑣或者放射性危害等不足。電流型免疫傳感器將電化學(xué)檢測與ELISA的特點(diǎn)結(jié)合,具有靈敏度高、操作簡便、干擾少等特點(diǎn)。在電化學(xué)免疫分析中,標(biāo)記抗體的數(shù)量直接影響免疫傳感器的靈敏度[3~6]。因此, 開發(fā)新型的抗體標(biāo)記材料,增加抗體的負(fù)載量,是提高免疫傳感器靈敏度的關(guān)鍵。

        聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)是一類功能高分子,可直接用做電極功能基質(zhì)膜[7,8]。天青Ⅰ(Azure Ⅰ)作為一種生物染料,是一種比較活潑的電子轉(zhuǎn)移體 [9,10]?;谝陨显?,本實(shí)驗(yàn)研究了PEDOTAzure Ⅰ納米復(fù)合物、納米金(nanoAus)共修飾于鉑盤電極表面固定甲胎蛋白抗體(antiAFP)的電流型免疫傳感器。該免疫傳感器基于PEDOT與Azure Ⅰ的協(xié)同效應(yīng),促進(jìn)酶活性中心與電極表面的電子傳遞;同時(shí),基于靜電吸附的原理將帶負(fù)電荷的nanoAus固定在PEDOT/Azure Ⅰ復(fù)合物表面,固定antiAFP;用辣根過氧化物酶(HRP)代替常用的牛血清蛋白(BSA)封閉非特異性吸附位點(diǎn)。由于PEDOT具有疏松多孔的納米結(jié)構(gòu),可有效增大電極的比表面積,增加抗體的固載量;同時(shí)HRP對H2O2有電催化作用,可擴(kuò)增電流響應(yīng),這種納米技術(shù)增強(qiáng)與酶催化底物信號增強(qiáng)的聯(lián)用,可實(shí)現(xiàn)信號雙重放大,制得高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器。

        2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        CHI 660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司),S4800 掃描電子顯微鏡(Hitachi公司)。

        EDOT(純度>97%,Bayer AG)。Azure Ⅰ(Coleman & Bell公司), AFP試劑盒(鄭州博賽生物技術(shù)研究所),HRP(Sigma公司),H2O2(30%, w/V,上?;瘜W(xué)試劑公司)。[Bmim]BF4(>99%,蘭州綠色化學(xué)與催化中心),氯金酸(Sigma公司)。其它試劑均為分析純。

        nanoAus在100 ℃的溫度下還原氯金酸制得[11],電鏡結(jié)構(gòu)表征其平均粒徑為16 nm。所有溶液均采用超純水配制。

        2.2免疫傳感器的制備

        鉑盤電極(=1 mm)經(jīng)氧化鋁粉末拋光成鏡面,超純水沖洗,然后依次用乙醇和超純水超聲清洗,氮?dú)獯蹈?。清洗好的電極浸入含有0.1 mol/L EDOT的[Bmim]BF4中,+1.25 V (vs Ag wire)的工作電位恒電位電聚合得到藍(lán)色的PEDOT薄膜,用超純水洗凈;取2 μL 5% Azure Ⅰ溶液滴涂于修飾電極表面,晾干后,洗去結(jié)合不夠穩(wěn)定的的Azure Ⅰ,浸入nanoAus溶液中浸泡8 h;將該修飾電極置于30 μL 含有0.25 mg/mL antiAFP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,于4 ℃放置過夜;用pH 7.4的PBS溶液洗凈,浸入含0.4 mg/mL HRP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,4 ℃放置4 h。將制備好的電極在4 ℃下保存?zhèn)溆?。該免疫傳感器的制備過程見圖1。

        2.3免疫傳感器的檢測原理及方法

        通過對免疫傳感器與待測抗原發(fā)生特異性結(jié)合前后的電流變化值來對抗原進(jìn)行定量分析。當(dāng)待測抗原與抗體特異性結(jié)合后,生成的免疫復(fù)合物阻礙了H2O2靠近酶催化中,響應(yīng)電流下降,電流下降值會隨著抗原濃度的增加而增大。

        電化學(xué)免疫傳感器的檢測采用循環(huán)伏安法(CV),以免疫電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑片為對電極。每次實(shí)驗(yàn)前通氮?dú)?0 min,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持在氮?dú)夥諊?。掃描電位?0.6~0.3 V,掃速為50 mV/s。免疫測定時(shí),將修飾有抗體的工作電極置于不同濃度的抗原溶液中孵育20 min(25 ℃),然后取出,用0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)洗凈,浸入含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液(0.1 mol/L, pH 6.5)中,進(jìn)行CV實(shí)驗(yàn)。

        3結(jié)果與討論

        3.1免疫傳感器的電化學(xué)表征

        用CV法研究了電極在不同修飾狀態(tài)下的電化學(xué)行為(圖2)。從圖2可知,當(dāng)鉑電極表面電聚合修飾一層PEDOT薄膜后,循環(huán)伏安電流明顯增加(曲線b),說明在離子液體電解液中聚合得到的PEDOT具有良好的電子傳遞性能[12,13]。當(dāng)修飾了一層Azure Ⅰ后,電極呈現(xiàn)一對峰形良好的氧化還原峰(曲線c),說明Azure Ⅰ在電極表面形成了很好的導(dǎo)電膜。當(dāng)nanoAus修飾在電極上后,氧化還原峰電流進(jìn)一步增大(曲線d),這是由于nanoAus的電子通道作用,有助于電極表面電子的傳輸。當(dāng)antiAFP(曲線e)進(jìn)一步修飾在電極上,由于蛋白的絕緣性,阻礙電子的傳輸,氧化還原峰電流明顯下降。最后,用HRP封閉電極上的活性位點(diǎn),氧化還原峰電流進(jìn)一步減?。ㄇ€f)。

        3.2免疫傳感器的形貌表征

        采用掃描電鏡(SEM)技術(shù)對組裝過程進(jìn)行了形貌表征。圖3為不同修飾電極的SEM圖。從圖3a可見,離子液體中聚合得到的PEDOT具有疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這是由于離子液體較高的粘度,降低了單體的擴(kuò)散速率,從而有助于形成多層的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14]。該材料具有較大的比表面積,可有效增加電極的比表面積,提高電活性物質(zhì)Azure Ⅰ和antiAFP的固載量,加快電活性物質(zhì)與電極之間的電子傳遞,提高免疫傳感器的靈敏度。經(jīng)AzureⅠ修飾后,整個(gè)表面交聯(lián)形成一個(gè)比較致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3b)。當(dāng)nanoAus修飾到電極表面,可以觀察到表面覆蓋了一層粒徑為10Symbolm@@ 8 m的顆粒(圖3c)。 antiAFP被吸附到修飾電極上時(shí)由于蛋白的絕緣性,其表面變得模糊,表明antiAFP已成功修飾到電極表面(圖3d)。

        3.3免疫傳感器的催化特性

        修飾在電極表面的HRP具有兩方面作用,一是封閉電極表面未被占據(jù)的活性點(diǎn),避免非特異性反應(yīng);二是基于HRP對H2O2的催化作用來放大免疫反應(yīng)信號。圖4a為修飾電極在pH 6.5的PBS中添加以及未添加H2O2的CV圖。當(dāng)溶液中不含有H2O2時(shí),曲線2出現(xiàn)一對Azure Ⅰ的氧化還原峰;當(dāng)加入2.5 mmol/L H2O2后(曲線1),氧化電流減小,還原峰電流從2.3 μA增加到3.7 μA,說明采用HRP代替BSA封閉活性位點(diǎn)的同時(shí)還可以放大電流信號[9]。

        摘要 研制了一種基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)與天青Ⅰ(Azure Ⅰ)為基體的電化學(xué)免疫傳感器,可靈敏檢測甲胎蛋白(AFP)。在鉑盤電極表面,電化學(xué)聚合PEDOT為基體,利用靜電組裝技術(shù)固定Azure Ⅰ和納米金顆粒(nanoAus),將甲胎蛋白抗體(antiAFP)組裝到nanoAus的表面。采用辣根過氧化物酶(HRP)封閉非特異性吸附位點(diǎn),制得電流型AFP免疫傳感器。采用循環(huán)伏安、掃描電鏡技術(shù)研究組裝過程及電極性質(zhì),探討了影響免疫傳感器性能的因素。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,電極響應(yīng)與AFP的濃度在0.01~120 μg/L的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,檢出限為0.003 μg/L。取臨床血清樣品用本方法檢測AFP含量,得到的結(jié)果與臨床常用的ELISA法得到的結(jié)果無顯著性差異。

        關(guān)鍵詞 聚(3,4乙烯二氧噻吩); 電化學(xué)免疫傳感器; 甲胎蛋白; 天青Ⅰ

        1引言

        血清中甲胎蛋白(AFP)的含量是臨床用于原發(fā)性肝癌和畸胎瘤的早期診斷、療效觀察和愈后判斷的重要指標(biāo)。目前,臨床用于AFP檢測的方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫測定法、化學(xué)發(fā)光法、熒光免疫法等[1,2],但存在靈敏度不高、步驟繁瑣或者放射性危害等不足。電流型免疫傳感器將電化學(xué)檢測與ELISA的特點(diǎn)結(jié)合,具有靈敏度高、操作簡便、干擾少等特點(diǎn)。在電化學(xué)免疫分析中,標(biāo)記抗體的數(shù)量直接影響免疫傳感器的靈敏度[3~6]。因此, 開發(fā)新型的抗體標(biāo)記材料,增加抗體的負(fù)載量,是提高免疫傳感器靈敏度的關(guān)鍵。

        聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)是一類功能高分子,可直接用做電極功能基質(zhì)膜[7,8]。天青Ⅰ(Azure Ⅰ)作為一種生物染料,是一種比較活潑的電子轉(zhuǎn)移體 [9,10]?;谝陨显恚緦?shí)驗(yàn)研究了PEDOTAzure Ⅰ納米復(fù)合物、納米金(nanoAus)共修飾于鉑盤電極表面固定甲胎蛋白抗體(antiAFP)的電流型免疫傳感器。該免疫傳感器基于PEDOT與Azure Ⅰ的協(xié)同效應(yīng),促進(jìn)酶活性中心與電極表面的電子傳遞;同時(shí),基于靜電吸附的原理將帶負(fù)電荷的nanoAus固定在PEDOT/Azure Ⅰ復(fù)合物表面,固定antiAFP;用辣根過氧化物酶(HRP)代替常用的牛血清蛋白(BSA)封閉非特異性吸附位點(diǎn)。由于PEDOT具有疏松多孔的納米結(jié)構(gòu),可有效增大電極的比表面積,增加抗體的固載量;同時(shí)HRP對H2O2有電催化作用,可擴(kuò)增電流響應(yīng),這種納米技術(shù)增強(qiáng)與酶催化底物信號增強(qiáng)的聯(lián)用,可實(shí)現(xiàn)信號雙重放大,制得高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器。

        2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        CHI 660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司),S4800 掃描電子顯微鏡(Hitachi公司)。

        EDOT(純度>97%,Bayer AG)。Azure Ⅰ(Coleman & Bell公司), AFP試劑盒(鄭州博賽生物技術(shù)研究所),HRP(Sigma公司),H2O2(30%, w/V,上?;瘜W(xué)試劑公司)。[Bmim]BF4(>99%,蘭州綠色化學(xué)與催化中心),氯金酸(Sigma公司)。其它試劑均為分析純。

        nanoAus在100 ℃的溫度下還原氯金酸制得[11],電鏡結(jié)構(gòu)表征其平均粒徑為16 nm。所有溶液均采用超純水配制。

        2.2免疫傳感器的制備

        鉑盤電極(=1 mm)經(jīng)氧化鋁粉末拋光成鏡面,超純水沖洗,然后依次用乙醇和超純水超聲清洗,氮?dú)獯蹈?。清洗好的電極浸入含有0.1 mol/L EDOT的[Bmim]BF4中,+1.25 V (vs Ag wire)的工作電位恒電位電聚合得到藍(lán)色的PEDOT薄膜,用超純水洗凈;取2 μL 5% Azure Ⅰ溶液滴涂于修飾電極表面,晾干后,洗去結(jié)合不夠穩(wěn)定的的Azure Ⅰ,浸入nanoAus溶液中浸泡8 h;將該修飾電極置于30 μL 含有0.25 mg/mL antiAFP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,于4 ℃放置過夜;用pH 7.4的PBS溶液洗凈,浸入含0.4 mg/mL HRP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,4 ℃放置4 h。將制備好的電極在4 ℃下保存?zhèn)溆?。該免疫傳感器的制備過程見圖1。

        2.3免疫傳感器的檢測原理及方法

        通過對免疫傳感器與待測抗原發(fā)生特異性結(jié)合前后的電流變化值來對抗原進(jìn)行定量分析。當(dāng)待測抗原與抗體特異性結(jié)合后,生成的免疫復(fù)合物阻礙了H2O2靠近酶催化中,響應(yīng)電流下降,電流下降值會隨著抗原濃度的增加而增大。

        電化學(xué)免疫傳感器的檢測采用循環(huán)伏安法(CV),以免疫電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑片為對電極。每次實(shí)驗(yàn)前通氮?dú)?0 min,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持在氮?dú)夥諊?。掃描電位?0.6~0.3 V,掃速為50 mV/s。免疫測定時(shí),將修飾有抗體的工作電極置于不同濃度的抗原溶液中孵育20 min(25 ℃),然后取出,用0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)洗凈,浸入含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液(0.1 mol/L, pH 6.5)中,進(jìn)行CV實(shí)驗(yàn)。

        3結(jié)果與討論

        3.1免疫傳感器的電化學(xué)表征

        用CV法研究了電極在不同修飾狀態(tài)下的電化學(xué)行為(圖2)。從圖2可知,當(dāng)鉑電極表面電聚合修飾一層PEDOT薄膜后,循環(huán)伏安電流明顯增加(曲線b),說明在離子液體電解液中聚合得到的PEDOT具有良好的電子傳遞性能[12,13]。當(dāng)修飾了一層Azure Ⅰ后,電極呈現(xiàn)一對峰形良好的氧化還原峰(曲線c),說明Azure Ⅰ在電極表面形成了很好的導(dǎo)電膜。當(dāng)nanoAus修飾在電極上后,氧化還原峰電流進(jìn)一步增大(曲線d),這是由于nanoAus的電子通道作用,有助于電極表面電子的傳輸。當(dāng)antiAFP(曲線e)進(jìn)一步修飾在電極上,由于蛋白的絕緣性,阻礙電子的傳輸,氧化還原峰電流明顯下降。最后,用HRP封閉電極上的活性位點(diǎn),氧化還原峰電流進(jìn)一步減?。ㄇ€f)。

        3.2免疫傳感器的形貌表征

        采用掃描電鏡(SEM)技術(shù)對組裝過程進(jìn)行了形貌表征。圖3為不同修飾電極的SEM圖。從圖3a可見,離子液體中聚合得到的PEDOT具有疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這是由于離子液體較高的粘度,降低了單體的擴(kuò)散速率,從而有助于形成多層的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14]。該材料具有較大的比表面積,可有效增加電極的比表面積,提高電活性物質(zhì)Azure Ⅰ和antiAFP的固載量,加快電活性物質(zhì)與電極之間的電子傳遞,提高免疫傳感器的靈敏度。經(jīng)AzureⅠ修飾后,整個(gè)表面交聯(lián)形成一個(gè)比較致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3b)。當(dāng)nanoAus修飾到電極表面,可以觀察到表面覆蓋了一層粒徑為10Symbolm@@ 8 m的顆粒(圖3c)。 antiAFP被吸附到修飾電極上時(shí)由于蛋白的絕緣性,其表面變得模糊,表明antiAFP已成功修飾到電極表面(圖3d)。

        3.3免疫傳感器的催化特性

        修飾在電極表面的HRP具有兩方面作用,一是封閉電極表面未被占據(jù)的活性點(diǎn),避免非特異性反應(yīng);二是基于HRP對H2O2的催化作用來放大免疫反應(yīng)信號。圖4a為修飾電極在pH 6.5的PBS中添加以及未添加H2O2的CV圖。當(dāng)溶液中不含有H2O2時(shí),曲線2出現(xiàn)一對Azure Ⅰ的氧化還原峰;當(dāng)加入2.5 mmol/L H2O2后(曲線1),氧化電流減小,還原峰電流從2.3 μA增加到3.7 μA,說明采用HRP代替BSA封閉活性位點(diǎn)的同時(shí)還可以放大電流信號[9]。

        摘要 研制了一種基于聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)與天青Ⅰ(Azure Ⅰ)為基體的電化學(xué)免疫傳感器,可靈敏檢測甲胎蛋白(AFP)。在鉑盤電極表面,電化學(xué)聚合PEDOT為基體,利用靜電組裝技術(shù)固定Azure Ⅰ和納米金顆粒(nanoAus),將甲胎蛋白抗體(antiAFP)組裝到nanoAus的表面。采用辣根過氧化物酶(HRP)封閉非特異性吸附位點(diǎn),制得電流型AFP免疫傳感器。采用循環(huán)伏安、掃描電鏡技術(shù)研究組裝過程及電極性質(zhì),探討了影響免疫傳感器性能的因素。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,電極響應(yīng)與AFP的濃度在0.01~120 μg/L的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系,檢出限為0.003 μg/L。取臨床血清樣品用本方法檢測AFP含量,得到的結(jié)果與臨床常用的ELISA法得到的結(jié)果無顯著性差異。

        關(guān)鍵詞 聚(3,4乙烯二氧噻吩); 電化學(xué)免疫傳感器; 甲胎蛋白; 天青Ⅰ

        1引言

        血清中甲胎蛋白(AFP)的含量是臨床用于原發(fā)性肝癌和畸胎瘤的早期診斷、療效觀察和愈后判斷的重要指標(biāo)。目前,臨床用于AFP檢測的方法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫測定法、化學(xué)發(fā)光法、熒光免疫法等[1,2],但存在靈敏度不高、步驟繁瑣或者放射性危害等不足。電流型免疫傳感器將電化學(xué)檢測與ELISA的特點(diǎn)結(jié)合,具有靈敏度高、操作簡便、干擾少等特點(diǎn)。在電化學(xué)免疫分析中,標(biāo)記抗體的數(shù)量直接影響免疫傳感器的靈敏度[3~6]。因此, 開發(fā)新型的抗體標(biāo)記材料,增加抗體的負(fù)載量,是提高免疫傳感器靈敏度的關(guān)鍵。

        聚(3,4乙烯二氧噻吩)(PEDOT)是一類功能高分子,可直接用做電極功能基質(zhì)膜[7,8]。天青Ⅰ(Azure Ⅰ)作為一種生物染料,是一種比較活潑的電子轉(zhuǎn)移體 [9,10]?;谝陨显?,本實(shí)驗(yàn)研究了PEDOTAzure Ⅰ納米復(fù)合物、納米金(nanoAus)共修飾于鉑盤電極表面固定甲胎蛋白抗體(antiAFP)的電流型免疫傳感器。該免疫傳感器基于PEDOT與Azure Ⅰ的協(xié)同效應(yīng),促進(jìn)酶活性中心與電極表面的電子傳遞;同時(shí),基于靜電吸附的原理將帶負(fù)電荷的nanoAus固定在PEDOT/Azure Ⅰ復(fù)合物表面,固定antiAFP;用辣根過氧化物酶(HRP)代替常用的牛血清蛋白(BSA)封閉非特異性吸附位點(diǎn)。由于PEDOT具有疏松多孔的納米結(jié)構(gòu),可有效增大電極的比表面積,增加抗體的固載量;同時(shí)HRP對H2O2有電催化作用,可擴(kuò)增電流響應(yīng),這種納米技術(shù)增強(qiáng)與酶催化底物信號增強(qiáng)的聯(lián)用,可實(shí)現(xiàn)信號雙重放大,制得高靈敏的電化學(xué)免疫傳感器。

        2實(shí)驗(yàn)部分

        2.1儀器與試劑

        CHI 660B電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司),S4800 掃描電子顯微鏡(Hitachi公司)。

        EDOT(純度>97%,Bayer AG)。Azure Ⅰ(Coleman & Bell公司), AFP試劑盒(鄭州博賽生物技術(shù)研究所),HRP(Sigma公司),H2O2(30%, w/V,上?;瘜W(xué)試劑公司)。[Bmim]BF4(>99%,蘭州綠色化學(xué)與催化中心),氯金酸(Sigma公司)。其它試劑均為分析純。

        nanoAus在100 ℃的溫度下還原氯金酸制得[11],電鏡結(jié)構(gòu)表征其平均粒徑為16 nm。所有溶液均采用超純水配制。

        2.2免疫傳感器的制備

        鉑盤電極(=1 mm)經(jīng)氧化鋁粉末拋光成鏡面,超純水沖洗,然后依次用乙醇和超純水超聲清洗,氮?dú)獯蹈?。清洗好的電極浸入含有0.1 mol/L EDOT的[Bmim]BF4中,+1.25 V (vs Ag wire)的工作電位恒電位電聚合得到藍(lán)色的PEDOT薄膜,用超純水洗凈;取2 μL 5% Azure Ⅰ溶液滴涂于修飾電極表面,晾干后,洗去結(jié)合不夠穩(wěn)定的的Azure Ⅰ,浸入nanoAus溶液中浸泡8 h;將該修飾電極置于30 μL 含有0.25 mg/mL antiAFP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,于4 ℃放置過夜;用pH 7.4的PBS溶液洗凈,浸入含0.4 mg/mL HRP的0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)中,4 ℃放置4 h。將制備好的電極在4 ℃下保存?zhèn)溆谩T撁庖邆鞲衅鞯闹苽溥^程見圖1。

        2.3免疫傳感器的檢測原理及方法

        通過對免疫傳感器與待測抗原發(fā)生特異性結(jié)合前后的電流變化值來對抗原進(jìn)行定量分析。當(dāng)待測抗原與抗體特異性結(jié)合后,生成的免疫復(fù)合物阻礙了H2O2靠近酶催化中,響應(yīng)電流下降,電流下降值會隨著抗原濃度的增加而增大。

        電化學(xué)免疫傳感器的檢測采用循環(huán)伏安法(CV),以免疫電極為工作電極,飽和甘汞電極為參比電極,鉑片為對電極。每次實(shí)驗(yàn)前通氮?dú)?0 min,整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程保持在氮?dú)夥諊?。掃描電位?0.6~0.3 V,掃速為50 mV/s。免疫測定時(shí),將修飾有抗體的工作電極置于不同濃度的抗原溶液中孵育20 min(25 ℃),然后取出,用0.05 mol/L PBS溶液(pH 7.4)洗凈,浸入含有2.5 mmol/L H2O2的PBS溶液(0.1 mol/L, pH 6.5)中,進(jìn)行CV實(shí)驗(yàn)。

        3結(jié)果與討論

        3.1免疫傳感器的電化學(xué)表征

        用CV法研究了電極在不同修飾狀態(tài)下的電化學(xué)行為(圖2)。從圖2可知,當(dāng)鉑電極表面電聚合修飾一層PEDOT薄膜后,循環(huán)伏安電流明顯增加(曲線b),說明在離子液體電解液中聚合得到的PEDOT具有良好的電子傳遞性能[12,13]。當(dāng)修飾了一層Azure Ⅰ后,電極呈現(xiàn)一對峰形良好的氧化還原峰(曲線c),說明Azure Ⅰ在電極表面形成了很好的導(dǎo)電膜。當(dāng)nanoAus修飾在電極上后,氧化還原峰電流進(jìn)一步增大(曲線d),這是由于nanoAus的電子通道作用,有助于電極表面電子的傳輸。當(dāng)antiAFP(曲線e)進(jìn)一步修飾在電極上,由于蛋白的絕緣性,阻礙電子的傳輸,氧化還原峰電流明顯下降。最后,用HRP封閉電極上的活性位點(diǎn),氧化還原峰電流進(jìn)一步減小(曲線f)。

        3.2免疫傳感器的形貌表征

        采用掃描電鏡(SEM)技術(shù)對組裝過程進(jìn)行了形貌表征。圖3為不同修飾電極的SEM圖。從圖3a可見,離子液體中聚合得到的PEDOT具有疏松多孔的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這是由于離子液體較高的粘度,降低了單體的擴(kuò)散速率,從而有助于形成多層的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14]。該材料具有較大的比表面積,可有效增加電極的比表面積,提高電活性物質(zhì)Azure Ⅰ和antiAFP的固載量,加快電活性物質(zhì)與電極之間的電子傳遞,提高免疫傳感器的靈敏度。經(jīng)AzureⅠ修飾后,整個(gè)表面交聯(lián)形成一個(gè)比較致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖3b)。當(dāng)nanoAus修飾到電極表面,可以觀察到表面覆蓋了一層粒徑為10Symbolm@@ 8 m的顆粒(圖3c)。 antiAFP被吸附到修飾電極上時(shí)由于蛋白的絕緣性,其表面變得模糊,表明antiAFP已成功修飾到電極表面(圖3d)。

        3.3免疫傳感器的催化特性

        修飾在電極表面的HRP具有兩方面作用,一是封閉電極表面未被占據(jù)的活性點(diǎn),避免非特異性反應(yīng);二是基于HRP對H2O2的催化作用來放大免疫反應(yīng)信號。圖4a為修飾電極在pH 6.5的PBS中添加以及未添加H2O2的CV圖。當(dāng)溶液中不含有H2O2時(shí),曲線2出現(xiàn)一對Azure Ⅰ的氧化還原峰;當(dāng)加入2.5 mmol/L H2O2后(曲線1),氧化電流減小,還原峰電流從2.3 μA增加到3.7 μA,說明采用HRP代替BSA封閉活性位點(diǎn)的同時(shí)還可以放大電流信號[9]。

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