張蕓　郭敏杰等

摘要 實(shí)驗(yàn)以聚乙烯醇分子為客體分子，與γ環(huán)糊精（γCD）分子組裝制備環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷（CDPPRs）；在金屬離子存在下，以丙烯酰胺（AM）為單體，N，N亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以CDPPRs為“假載體”，制備了以牛血清白蛋白（BSA）為模板的分子印跡聚合物（cpMIP）。結(jié)果表明，隨著功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印跡聚合物吸附量先增加后減小，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為0.55時(shí)，印跡聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存時(shí)，吸附量最高可達(dá)5.16 mg/g；將cpMIP用于4種混合蛋白溶液吸附，結(jié)果表明， 引入CDPPRs使印跡聚合物的特異性吸附能力明顯提高，特異性吸附量可提高約6倍。

關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物； 聚乙烯醇； 環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷； 假載體； 蛋白質(zhì)吸附

1引言

蛋白質(zhì)分子印跡聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通過(guò)功能單體交聯(lián)聚合而成[1，2]，MIPs可以選擇性地從混合物中吸附分離模板蛋白，其制備方法主要有包埋法[3]、表面印跡法[4]，抗原決定基法[5]、輔助識(shí)別鏈輔助法[6，7]、碳納米管為載體法[8]及借助某些物質(zhì)或載體在二維或三維空間上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡[9]方法等。環(huán)糊精（CD）與鏈狀大分子通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用組裝超分子聚集體，可形成準(zhǔn)聚輪烷或者聚輪烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印跡氨基酸、多肽的研究較多[11]，用于蛋白質(zhì)分子印跡的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅膠為載體，將βCD與丙烯酰胺進(jìn)行鍵合制備MIPs。Nagaoka等[14]將環(huán)糊精引入印跡體系，以三肽為模板分子，分別在硅膠、氧化鋁薄膜及聚羥乙基丙烯酸甲酯表面制備了印跡聚合物。

本實(shí)驗(yàn)將環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷充當(dāng)“假載體”，參與交聯(lián)聚合過(guò)程而被固定在聚合物網(wǎng)絡(luò)中，以實(shí)現(xiàn)功能單體與目標(biāo)分子良好的空間匹配，從而達(dá)到對(duì)模板蛋白的專一性識(shí)別[15]。印跡吸附過(guò)程見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)提出的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷這種“假載體”有別于小分子單體，由于CD是低聚環(huán)狀物，結(jié)構(gòu)類似一截頂圓錐，它能夠在體系聚合過(guò)程中在橫向和縱向空間上較好的維持與蛋白質(zhì)匹配的空間結(jié)構(gòu)而區(qū)別于普通的包埋法印跡。CD的空腔直徑約為1 nm，其縱向尺寸也不超過(guò)10 nm， 因此對(duì)多數(shù)三維線長(zhǎng)在10 nm這個(gè)數(shù)量級(jí)上的蛋白質(zhì)而言， CDPPRs并不提供一個(gè)真正的載體作用，因而稱之為“假載體”。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

DYCZ24DN型電泳儀（北京市六一儀器廠）； TU1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）； MIPAⅡXMU/H掃描電鏡（美國(guó)SIRION公司）。

聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ環(huán)糊精（γCD， 藥品級(jí)， 德國(guó)Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V組分（BSA）、大豆蛋白酶抑制劑（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1CDPPRs的制備稱1.00 g PVA于100 mL圓底燒瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室溫下靜置12 h，循環(huán)5次。將反應(yīng)物用乙醇沉淀，經(jīng)水洗、分離、真空干燥，制得CDPPRs。稱2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亞砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗滌，真空干燥后得到CDPPRsAc。

2.2.2印跡聚合物MIPs的制備依次將丙烯酰胺AM、N，N′亞甲基雙丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到裝有20.0 mL去離子水的三口燒瓶中，冰水浴中攪拌1 h，通氮?dú)?，加入過(guò)硫酸銨（APS），繼續(xù)攪拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反應(yīng)4 h，得到cpMIPs?？瞻子≯E聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同；對(duì)比組印跡聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同。

2.2.3 印跡聚合物吸附性能測(cè)試（1）吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)將各組MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分別于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上層清液1.0 mL，檢測(cè)MIPs對(duì)模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)稱取1.00 g 各組MIPs，加入到10 mL蛋白質(zhì)混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL濃度均為0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗滌。取洗脫蛋白液各10 μL上樣，恒流條件下進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），用考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析。

3結(jié)果與討論

3.1CDPPRs結(jié)構(gòu)分析

CD為高旋光性物質(zhì)，PVA旋光度為零，當(dāng)兩者形成組裝體后，分子的空間形象及分子對(duì)稱性發(fā)生了較大的改變。兩者混合物的比旋光度與γCD的比旋光度相同，均為+175°；而組裝體的比旋光度為+85°，初步證明聚乙烯醇與γ環(huán)糊精進(jìn)行了包結(jié)。

CDPPRs的核磁譜圖（圖2c）進(jìn)一步證明主客體間的各種弱作用相互疊加形成了較強(qiáng)的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的質(zhì)子和PVA分子鏈上與羥基相連碳上的質(zhì)子的共同貢獻(xiàn)，對(duì)比圖2b與2c可見(jiàn)，該部分貢獻(xiàn)并不是γCD與聚乙烯醇兩種物質(zhì)質(zhì)子的簡(jiǎn)單物理加和，峰形已經(jīng)發(fā)生變化。

3.2蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備

3.2.1CDPPRsAc的含量對(duì)MIPs吸附量的影響在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著CDPPRsAc用量的增加，印跡聚合物的吸附量增大（圖4），這應(yīng)歸因于環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷的引入使識(shí)別位點(diǎn)增多。當(dāng)CDPPRsAc用量繼續(xù)增加時(shí)，印跡聚合物的吸附量下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)多的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷使得印跡聚合物的交聯(lián)過(guò)于密集，不利于印跡聚合物的識(shí)別。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為1.1時(shí)，此時(shí)的印跡聚合物的吸附量最大，為3.54 mg/g。

3.2.2金屬離子用量對(duì)MIPs吸附量的影響金屬離子可以特異性地鍵合蛋白質(zhì)的某些官能團(tuán)。分別使用Ni2+和Cu2+輔助蛋白質(zhì)印跡識(shí)別過(guò)程，金屬離子與模板所形成的空間取向，在環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷所在的聚合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中能夠被較好地保留下來(lái)，因此可提高對(duì)模板分子的選擇性識(shí)別（表1）。加入金屬離子的MIPs比未加入金屬離子的MIPs吸附量高，這可能是因?yàn)榧尤虢饘匐x子后，CDPPRAc、功能單體與模板蛋白之間可以通過(guò)金屬離子形成穩(wěn)定的配位作用，從而產(chǎn)生了更多的有效識(shí)別位點(diǎn)，提高對(duì)模板蛋白的識(shí)別能力。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，引入Cu2+的MIPs對(duì)模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。

摘要 實(shí)驗(yàn)以聚乙烯醇分子為客體分子，與γ環(huán)糊精（γCD）分子組裝制備環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷（CDPPRs）；在金屬離子存在下，以丙烯酰胺（AM）為單體，N，N亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以CDPPRs為“假載體”，制備了以牛血清白蛋白（BSA）為模板的分子印跡聚合物（cpMIP）。結(jié)果表明，隨著功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印跡聚合物吸附量先增加后減小，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為0.55時(shí)，印跡聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存時(shí)，吸附量最高可達(dá)5.16 mg/g；將cpMIP用于4種混合蛋白溶液吸附，結(jié)果表明， 引入CDPPRs使印跡聚合物的特異性吸附能力明顯提高，特異性吸附量可提高約6倍。

關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物； 聚乙烯醇； 環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷； 假載體； 蛋白質(zhì)吸附

1引言

蛋白質(zhì)分子印跡聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通過(guò)功能單體交聯(lián)聚合而成[1，2]，MIPs可以選擇性地從混合物中吸附分離模板蛋白，其制備方法主要有包埋法[3]、表面印跡法[4]，抗原決定基法[5]、輔助識(shí)別鏈輔助法[6，7]、碳納米管為載體法[8]及借助某些物質(zhì)或載體在二維或三維空間上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡[9]方法等。環(huán)糊精（CD）與鏈狀大分子通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用組裝超分子聚集體，可形成準(zhǔn)聚輪烷或者聚輪烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印跡氨基酸、多肽的研究較多[11]，用于蛋白質(zhì)分子印跡的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅膠為載體，將βCD與丙烯酰胺進(jìn)行鍵合制備MIPs。Nagaoka等[14]將環(huán)糊精引入印跡體系，以三肽為模板分子，分別在硅膠、氧化鋁薄膜及聚羥乙基丙烯酸甲酯表面制備了印跡聚合物。

本實(shí)驗(yàn)將環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷充當(dāng)“假載體”，參與交聯(lián)聚合過(guò)程而被固定在聚合物網(wǎng)絡(luò)中，以實(shí)現(xiàn)功能單體與目標(biāo)分子良好的空間匹配，從而達(dá)到對(duì)模板蛋白的專一性識(shí)別[15]。印跡吸附過(guò)程見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)提出的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷這種“假載體”有別于小分子單體，由于CD是低聚環(huán)狀物，結(jié)構(gòu)類似一截頂圓錐，它能夠在體系聚合過(guò)程中在橫向和縱向空間上較好的維持與蛋白質(zhì)匹配的空間結(jié)構(gòu)而區(qū)別于普通的包埋法印跡。CD的空腔直徑約為1 nm，其縱向尺寸也不超過(guò)10 nm， 因此對(duì)多數(shù)三維線長(zhǎng)在10 nm這個(gè)數(shù)量級(jí)上的蛋白質(zhì)而言， CDPPRs并不提供一個(gè)真正的載體作用，因而稱之為“假載體”。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

DYCZ24DN型電泳儀（北京市六一儀器廠）； TU1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）； MIPAⅡXMU/H掃描電鏡（美國(guó)SIRION公司）。

聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ環(huán)糊精（γCD， 藥品級(jí)， 德國(guó)Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V組分（BSA）、大豆蛋白酶抑制劑（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1CDPPRs的制備稱1.00 g PVA于100 mL圓底燒瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室溫下靜置12 h，循環(huán)5次。將反應(yīng)物用乙醇沉淀，經(jīng)水洗、分離、真空干燥，制得CDPPRs。稱2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亞砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗滌，真空干燥后得到CDPPRsAc。

2.2.2印跡聚合物MIPs的制備依次將丙烯酰胺AM、N，N′亞甲基雙丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到裝有20.0 mL去離子水的三口燒瓶中，冰水浴中攪拌1 h，通氮?dú)猓尤脒^(guò)硫酸銨（APS），繼續(xù)攪拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反應(yīng)4 h，得到cpMIPs?？瞻子≯E聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同；對(duì)比組印跡聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同。

2.2.3 印跡聚合物吸附性能測(cè)試（1）吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)將各組MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分別于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上層清液1.0 mL，檢測(cè)MIPs對(duì)模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)稱取1.00 g 各組MIPs，加入到10 mL蛋白質(zhì)混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL濃度均為0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗滌。取洗脫蛋白液各10 μL上樣，恒流條件下進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），用考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析。

3結(jié)果與討論

3.1CDPPRs結(jié)構(gòu)分析

CD為高旋光性物質(zhì)，PVA旋光度為零，當(dāng)兩者形成組裝體后，分子的空間形象及分子對(duì)稱性發(fā)生了較大的改變。兩者混合物的比旋光度與γCD的比旋光度相同，均為+175°；而組裝體的比旋光度為+85°，初步證明聚乙烯醇與γ環(huán)糊精進(jìn)行了包結(jié)。

CDPPRs的核磁譜圖（圖2c）進(jìn)一步證明主客體間的各種弱作用相互疊加形成了較強(qiáng)的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的質(zhì)子和PVA分子鏈上與羥基相連碳上的質(zhì)子的共同貢獻(xiàn)，對(duì)比圖2b與2c可見(jiàn)，該部分貢獻(xiàn)并不是γCD與聚乙烯醇兩種物質(zhì)質(zhì)子的簡(jiǎn)單物理加和，峰形已經(jīng)發(fā)生變化。

3.2蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備

3.2.1CDPPRsAc的含量對(duì)MIPs吸附量的影響在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著CDPPRsAc用量的增加，印跡聚合物的吸附量增大（圖4），這應(yīng)歸因于環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷的引入使識(shí)別位點(diǎn)增多。當(dāng)CDPPRsAc用量繼續(xù)增加時(shí)，印跡聚合物的吸附量下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)多的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷使得印跡聚合物的交聯(lián)過(guò)于密集，不利于印跡聚合物的識(shí)別。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為1.1時(shí)，此時(shí)的印跡聚合物的吸附量最大，為3.54 mg/g。

3.2.2金屬離子用量對(duì)MIPs吸附量的影響金屬離子可以特異性地鍵合蛋白質(zhì)的某些官能團(tuán)。分別使用Ni2+和Cu2+輔助蛋白質(zhì)印跡識(shí)別過(guò)程，金屬離子與模板所形成的空間取向，在環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷所在的聚合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中能夠被較好地保留下來(lái)，因此可提高對(duì)模板分子的選擇性識(shí)別（表1）。加入金屬離子的MIPs比未加入金屬離子的MIPs吸附量高，這可能是因?yàn)榧尤虢饘匐x子后，CDPPRAc、功能單體與模板蛋白之間可以通過(guò)金屬離子形成穩(wěn)定的配位作用，從而產(chǎn)生了更多的有效識(shí)別位點(diǎn)，提高對(duì)模板蛋白的識(shí)別能力。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，引入Cu2+的MIPs對(duì)模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。

摘要 實(shí)驗(yàn)以聚乙烯醇分子為客體分子，與γ環(huán)糊精（γCD）分子組裝制備環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷（CDPPRs）；在金屬離子存在下，以丙烯酰胺（AM）為單體，N，N亞甲基雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，以CDPPRs為“假載體”，制備了以牛血清白蛋白（BSA）為模板的分子印跡聚合物（cpMIP）。結(jié)果表明，隨著功能基化CDPPRs（CDPPRsAc）用量增加，印跡聚合物吸附量先增加后減小，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為0.55時(shí)，印跡聚合物的吸附量最大；在Cu2+共存時(shí)，吸附量最高可達(dá)5.16 mg/g；將cpMIP用于4種混合蛋白溶液吸附，結(jié)果表明， 引入CDPPRs使印跡聚合物的特異性吸附能力明顯提高，特異性吸附量可提高約6倍。

關(guān)鍵詞 分子印跡聚合物； 聚乙烯醇； 環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷； 假載體； 蛋白質(zhì)吸附

1引言

蛋白質(zhì)分子印跡聚合物（MIPs）是在模板蛋白存在下通過(guò)功能單體交聯(lián)聚合而成[1，2]，MIPs可以選擇性地從混合物中吸附分離模板蛋白，其制備方法主要有包埋法[3]、表面印跡法[4]，抗原決定基法[5]、輔助識(shí)別鏈輔助法[6，7]、碳納米管為載體法[8]及借助某些物質(zhì)或載體在二維或三維空間上進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡[9]方法等。環(huán)糊精（CD）與鏈狀大分子通過(guò)非共價(jià)鍵相互作用組裝超分子聚集體，可形成準(zhǔn)聚輪烷或者聚輪烷（CDPPRs）[10]。目前，CD用于印跡氨基酸、多肽的研究較多[11]，用于蛋白質(zhì)分子印跡的研究很少[12]。 Zhang等[13]以硅膠為載體，將βCD與丙烯酰胺進(jìn)行鍵合制備MIPs。Nagaoka等[14]將環(huán)糊精引入印跡體系，以三肽為模板分子，分別在硅膠、氧化鋁薄膜及聚羥乙基丙烯酸甲酯表面制備了印跡聚合物。

本實(shí)驗(yàn)將環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷充當(dāng)“假載體”，參與交聯(lián)聚合過(guò)程而被固定在聚合物網(wǎng)絡(luò)中，以實(shí)現(xiàn)功能單體與目標(biāo)分子良好的空間匹配，從而達(dá)到對(duì)模板蛋白的專一性識(shí)別[15]。印跡吸附過(guò)程見(jiàn)圖1。本實(shí)驗(yàn)提出的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷這種“假載體”有別于小分子單體，由于CD是低聚環(huán)狀物，結(jié)構(gòu)類似一截頂圓錐，它能夠在體系聚合過(guò)程中在橫向和縱向空間上較好的維持與蛋白質(zhì)匹配的空間結(jié)構(gòu)而區(qū)別于普通的包埋法印跡。CD的空腔直徑約為1 nm，其縱向尺寸也不超過(guò)10 nm， 因此對(duì)多數(shù)三維線長(zhǎng)在10 nm這個(gè)數(shù)量級(jí)上的蛋白質(zhì)而言， CDPPRs并不提供一個(gè)真正的載體作用，因而稱之為“假載體”。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

DYCZ24DN型電泳儀（北京市六一儀器廠）； TU1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）； MIPAⅡXMU/H掃描電鏡（美國(guó)SIRION公司）。

聚乙烯醇（PVA，醇解度80%，MW=9000～10000，日本Kuraray公司）； γ環(huán)糊精（γCD， 藥品級(jí)， 德國(guó)Wacker公司）； 牛血清白蛋白第V組分（BSA）、大豆蛋白酶抑制劑（SBTL）、卵清蛋白（OVA）、溶菌酶（LYS），天津博迪化工有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1CDPPRs的制備稱1.00 g PVA于100 mL圓底燒瓶中，用20.0 mL水溶解；加入3.00 g γCD， 80 ℃下回流12 h，在室溫下靜置12 h，循環(huán)5次。將反應(yīng)物用乙醇沉淀，經(jīng)水洗、分離、真空干燥，制得CDPPRs。稱2.00 g CDPPRs，溶于40.0 mL二甲基亞砜中，逐滴加入2.00 mL 丙烯酰氯（AC）。4 h后，用乙醇沉淀，用乙醚洗滌，真空干燥后得到CDPPRsAc。

2.2.2印跡聚合物MIPs的制備依次將丙烯酰胺AM、N，N′亞甲基雙丙烯酰胺MBA、CDPPRsAc、模板蛋白BSA加入到裝有20.0 mL去離子水的三口燒瓶中，冰水浴中攪拌1 h，通氮?dú)?，加入過(guò)硫酸銨（APS），繼續(xù)攪拌0.5 h后加入Na2SO3溶液，40℃反應(yīng)4 h，得到cpMIPs?？瞻子≯E聚合物NMIP的合成，除不加入模板分子外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同；對(duì)比組印跡聚合物aMIP的合成，除不加CDPPRsAc外，其它與制備cpMIPs印跡聚合物的方法相同。

2.2.3 印跡聚合物吸附性能測(cè)試（1）吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)將各組MIPs加入到0.50 g/L BSA溶液中，于4 ℃吸附，分別于0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，6.0，12.0和24.0 h取上層清液1.0 mL，檢測(cè)MIPs對(duì)模板蛋白BSA的吸附量Q。（2）競(jìng)爭(zhēng)吸附實(shí)驗(yàn)稱取1.00 g 各組MIPs，加入到10 mL蛋白質(zhì)混合溶液（BSA，LYS，OVA和SBTL濃度均為0.50 g/L）中，4 ℃吸附12 h。取聚合物各0.10 g，依次用1.0 mL的0.15， 0.50和2.0 mol/L的KCl溶液洗滌。取洗脫蛋白液各10 μL上樣，恒流條件下進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），用考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行分析。

3結(jié)果與討論

3.1CDPPRs結(jié)構(gòu)分析

CD為高旋光性物質(zhì)，PVA旋光度為零，當(dāng)兩者形成組裝體后，分子的空間形象及分子對(duì)稱性發(fā)生了較大的改變。兩者混合物的比旋光度與γCD的比旋光度相同，均為+175°；而組裝體的比旋光度為+85°，初步證明聚乙烯醇與γ環(huán)糊精進(jìn)行了包結(jié)。

CDPPRs的核磁譜圖（圖2c）進(jìn)一步證明主客體間的各種弱作用相互疊加形成了較強(qiáng)的超分子作用。3.7～3.9 ppm的峰是γCD的3，5位的質(zhì)子和PVA分子鏈上與羥基相連碳上的質(zhì)子的共同貢獻(xiàn)，對(duì)比圖2b與2c可見(jiàn)，該部分貢獻(xiàn)并不是γCD與聚乙烯醇兩種物質(zhì)質(zhì)子的簡(jiǎn)單物理加和，峰形已經(jīng)發(fā)生變化。

3.2蛋白質(zhì)印跡聚合物的制備

3.2.1CDPPRsAc的含量對(duì)MIPs吸附量的影響在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，隨著CDPPRsAc用量的增加，印跡聚合物的吸附量增大（圖4），這應(yīng)歸因于環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷的引入使識(shí)別位點(diǎn)增多。當(dāng)CDPPRsAc用量繼續(xù)增加時(shí)，印跡聚合物的吸附量下降，這可能是因?yàn)檫^(guò)多的環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷使得印跡聚合物的交聯(lián)過(guò)于密集，不利于印跡聚合物的識(shí)別。在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，當(dāng)CDPPRsAc與AM的質(zhì)量比為1.1時(shí)，此時(shí)的印跡聚合物的吸附量最大，為3.54 mg/g。

3.2.2金屬離子用量對(duì)MIPs吸附量的影響金屬離子可以特異性地鍵合蛋白質(zhì)的某些官能團(tuán)。分別使用Ni2+和Cu2+輔助蛋白質(zhì)印跡識(shí)別過(guò)程，金屬離子與模板所形成的空間取向，在環(huán)糊精準(zhǔn)聚輪烷所在的聚合網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中能夠被較好地保留下來(lái)，因此可提高對(duì)模板分子的選擇性識(shí)別（表1）。加入金屬離子的MIPs比未加入金屬離子的MIPs吸附量高，這可能是因?yàn)榧尤虢饘匐x子后，CDPPRAc、功能單體與模板蛋白之間可以通過(guò)金屬離子形成穩(wěn)定的配位作用，從而產(chǎn)生了更多的有效識(shí)別位點(diǎn)，提高對(duì)模板蛋白的識(shí)別能力。實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，引入Cu2+的MIPs對(duì)模板蛋白的吸附量比引入Ni2+的MIPs要高一些。