張丹　馮流星　王軍　熊金平

摘要 建立了高效液相色譜（HPLC）與電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS）聯(lián)用，同時(shí)結(jié)合柱后同位素稀釋法，通過直接測定硫及鐵元素，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)絕對定量的分析方法。選取分子量不同的4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白：轉(zhuǎn)鐵蛋白、β乳球蛋白、肌紅蛋白和溶菌酶作為混合蛋白，34S或54Fe同位素稀釋劑與液相色譜洗脫液經(jīng)三通混合后，在線進(jìn)入ICPMS檢測。根據(jù)同位素稀釋法公式及蛋白中硫、鐵的含量計(jì)算混合蛋白中每種蛋白的濃度，與天平稱量結(jié)果一致，對方法進(jìn)行了驗(yàn)證。將方法應(yīng)用到人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白的定量分析，針對兩種蛋白含量差別大導(dǎo)致的信號(hào)差異，通過改變同位素稀釋劑的流速，成功測定了人血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白的含量。采用34S及54Fe同位素稀釋劑分別定量的血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白濃度為（2.35±0.01）g/L和（2.22±0.13）g/L，結(jié)果基本吻合。方法精密度RSD均小于10%，可用于基體樣品中含硫蛋白及金屬蛋白的定量分析。

關(guān)鍵詞 同位素稀釋； 蛋白質(zhì)定量； 電感耦合等離子體質(zhì)譜； 轉(zhuǎn)鐵蛋白； 白蛋白

1引言

蛋白質(zhì)組學(xué)的快速發(fā)展，不但需要準(zhǔn)確鑒定蛋白質(zhì)，還要求對處于動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析[1～4]。目前比較成熟的定量方法多是基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的生物質(zhì)譜[5，6]，但是生物質(zhì)譜的信號(hào)響應(yīng)與蛋白質(zhì)或肽段含量間的關(guān)系十分復(fù)雜，沒有蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)作歸一化處理，很難對蛋白質(zhì)或肽段定量。與生物質(zhì)譜不同，電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICPMS）分析中元素的響應(yīng)與原子所處的分子環(huán)境無關(guān)[7]，而且樣品處理簡單，易于色譜聯(lián)用，可進(jìn)行同位素分析[8]。因此，利用ICPMS對蛋白質(zhì)中的元素定量分析，是近年來蛋白質(zhì)定量技術(shù)研究的熱點(diǎn)。硫是最適合作為蛋白質(zhì)定量分析的元素[9]。根據(jù)SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計(jì)分析，分別有96.6%、98.8%的蛋白質(zhì)含有半胱氨酸、甲硫氨酸等含硫氨基酸[10]。如果蛋白質(zhì)的氨基酸序列已知，就能確定其中的硫原子數(shù)；那么通過ICPMS測定硫的含量來實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的定量是完全可行的[11]。但是，目前ICPMS直接測定硫來定量的蛋白，主要是標(biāo)準(zhǔn)蛋白，涉及基體樣品的很少，因?yàn)镮CPMS測量硫存在一些困難：需使用碰撞池技術(shù)或高分辨ICPMS克服O+2對硫的譜線干擾[12]。常見的ICPMS對蛋白質(zhì)定量研究集中在金屬蛋白上[13，14]，定量原理與含硫蛋白相同。

為保證定量分析的準(zhǔn)確度，需使用與待測蛋白匹配的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來保障質(zhì)控與量傳，但由于蛋白質(zhì)種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，目前可獲得的蛋白標(biāo)準(zhǔn)十分匱乏。同位素稀釋法（ID）是國際公認(rèn)的具有權(quán)威性化學(xué)計(jì)量方法，只需硫或金屬的濃縮同位素即可實(shí)現(xiàn)不同基體蛋白的定量分析[15]。

高效液相色譜（HPLC）的同位素稀釋法分為特異性、非特異性形態(tài)[16]。前者在前處理時(shí)就將稀釋劑加入到樣品中，具有傳統(tǒng)同位素稀釋法的優(yōu)點(diǎn)；但是必須開發(fā)針對目標(biāo)蛋白的特異性稀釋劑制備方法，目前商品化或人工合成的稀釋劑非常有限，直到2005年才有文獻(xiàn)報(bào)道第一次應(yīng)用到蛋白質(zhì)的定量分析[17]。而非特異性形態(tài)同位素稀釋（也稱柱后同位素稀釋）對蛋白質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)沒有要求，同位素稀釋劑常為某元素的簡單離子，基本都有商品化的產(chǎn)品，適合于蛋白質(zhì)的定量分析。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道了高效液相色譜柱后同位素稀釋質(zhì)譜法（HPLCIDICPMS）， 通過測硫定量標(biāo)準(zhǔn)蛋白[11]和測鐵定量轉(zhuǎn)鐵蛋白[14]，但是未見對硫、鐵共同定量蛋白的比較及人血清中多種蛋白的定量。本研究采用液相色譜分離混合蛋白，ICPMS測硫、鐵分別定量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白結(jié)果與天平稱量結(jié)果比較，驗(yàn)證了HPLCIDICPMS方法，并對硫、鐵定量分析進(jìn)行比較。在此基礎(chǔ)上，將方法應(yīng)用到人血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白的定量分析，測定了血清中兩種蛋白的含量。本方法體系可應(yīng)用在食品安全、環(huán)境監(jiān)測、臨床檢驗(yàn)的化學(xué)計(jì)量、相關(guān)實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證等生命科學(xué)研究的重要領(lǐng)域，促進(jìn)我國生命科學(xué)測量水平的不斷提高和測量溯源性研究的深入發(fā)展。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器、試劑與樣品

Element 2扇形磁場電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（美國ThermoFisher Scientific公司）；高效液相色譜系統(tǒng)（日本Shimadzu公司）：含LC30AD泵、LC20AD泵、SIL30AC自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO20A柱溫箱、SPD20A紫外檢測器；Toledo型電子天平（瑞士Mettler公司）；MillQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；TSKGel G3000SWxl凝膠柱（300 mm×7.8 mm，日本Tosoh公司）；Shodex QA825 IEC色譜柱（75 mm×8.0 mm， 日本Shodex公司）

Tris、人血清轉(zhuǎn)鐵蛋白Transferrin（Tf，75.2 kDa，每分子含47個(gè)S原子）、白蛋白Albumin（Alb，66.4 kDa，含41個(gè)S原子）、牛β乳球蛋白Lactoglobulin（Lacb，18.36 kDa，含9個(gè)S原子）、雞溶菌酶Lysozyme（Lys，14.31 kDa，含12個(gè)S原子），均購自Sigma公司；甲酸銨、乙酸銨，購于Fisher Scientific公司；馬心肌紅蛋白Myoglobin（Myo，16.95 kDa，含3個(gè)S原子）、人血清樣品來自中國計(jì)量科學(xué)研究院；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

4種標(biāo)準(zhǔn)蛋白Tf， Lacb， Myo和 Lys用天平準(zhǔn)確稱量后混合，溶于超純水中備用；人血清樣品不經(jīng)任何處理，直接進(jìn)入液相色譜進(jìn)行分析。

34S濃縮同位素（美國橡樹嶺實(shí)驗(yàn)室）：同位素32S/34S豐度比為0.01417；54Fe濃縮同位素（中國計(jì)量科學(xué)研究院）：同位素56Fe/54Fe豐度比為0.11313。

2.2電感耦合等離子體質(zhì)譜儀條件

儀器工作參數(shù)為：功率 1300 W，樣品氣流速1.05 L/min，輔助氣流速0.87 L/min，冷卻氣流速16.0 L/min， 分辨率（m/Δm） 4000；掃描次數(shù) 700×1。

2.3高效液相色譜分離條件

2.3.1尺寸排阻色譜（SEC）分離混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動(dòng)相中高濃度鹽（如NaCl等）在質(zhì)譜錐上的堆積會(huì)影響ICPMS測量；文獻(xiàn)[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 mol/L乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)既能保證分離效果，又不會(huì)引入高濃度鹽；而且質(zhì)譜連續(xù)工作8 h，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的碳堆積。本實(shí)驗(yàn)所用的流動(dòng)相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液，流速為0.4 mL/min， 紫外檢測器波長280 nm，分析時(shí)間40 min，等度洗脫。

2.3.2陰離子交換色譜（IEC）分離人血清由于轉(zhuǎn)鐵蛋白與白蛋白分子量接近，尺寸排阻色譜柱分離人血清時(shí)，兩者的保留時(shí)間重合，不能達(dá)到分離效果，因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相： 0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.6）； B相： A+0.5 mol/L甲酸銨溶液，流速為0.7 mL/min， 時(shí)間程序： 0～30 min， 0～100% B； 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。

2.4HPLCIDICPMS分析

柱后同位素稀釋時(shí)，稀釋劑通過島津液相系統(tǒng)自帶的LC20AD泵加入，與液相色譜的洗脫液經(jīng)過三通混合后在線進(jìn)入ICPMS檢測。液相色譜實(shí)現(xiàn)混合蛋白分離，ICPMS檢測對蛋白定量分析。

質(zhì)譜得到的同位素比值譜圖，根據(jù)同位素稀釋公式（1），轉(zhuǎn)化為元素的質(zhì)量流（Mass flow）譜圖。積分質(zhì)量流譜圖中的峰面積可得到相應(yīng)蛋白中該元素的絕對含量，依據(jù)液相進(jìn)樣體積及蛋白所含元素個(gè)數(shù)，就可計(jì)算出蛋白的絕對濃度。

MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs（Rm-Rsp）（Rs-Rm）（1）

式中， csp， dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（ng/g）、密度（g/mL）和流速（mL/min）； Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量； Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度； Rm， Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。

血清中目標(biāo)蛋白的正常含量范圍不同：轉(zhuǎn)鐵蛋白2.35～3.00 g/L，白蛋白35～50 g/L；導(dǎo)致兩種蛋白中硫含量差別很大，為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相時(shí)間程序的前15 min（轉(zhuǎn)鐵蛋白出峰部分），34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min；之后白蛋白出峰時(shí)間段，流速提高到0.2 mL/min。[TS（][HT5”SS]圖14種混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白的液相色譜圖

Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS）]

3結(jié)果與討論

3.1含硫標(biāo)準(zhǔn)蛋白的絕對定量

尺寸排阻液相色譜分離4種混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Tf， Lacb， Myo和Lys）的譜圖如圖1所示， 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來，Tf， Lacb， Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時(shí)間分別為21.9， 23.9， 26.3和29.9 min。

2.3高效液相色譜分離條件

2.3.1尺寸排阻色譜（SEC）分離混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動(dòng)相中高濃度鹽（如NaCl等）在質(zhì)譜錐上的堆積會(huì)影響ICPMS測量；文獻(xiàn)[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 mol/L乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)既能保證分離效果，又不會(huì)引入高濃度鹽；而且質(zhì)譜連續(xù)工作8 h，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的碳堆積。本實(shí)驗(yàn)所用的流動(dòng)相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液，流速為0.4 mL/min， 紫外檢測器波長280 nm，分析時(shí)間40 min，等度洗脫。

2.3.2陰離子交換色譜（IEC）分離人血清由于轉(zhuǎn)鐵蛋白與白蛋白分子量接近，尺寸排阻色譜柱分離人血清時(shí)，兩者的保留時(shí)間重合，不能達(dá)到分離效果，因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相： 0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.6）； B相： A+0.5 mol/L甲酸銨溶液，流速為0.7 mL/min， 時(shí)間程序： 0～30 min， 0～100% B； 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。

2.4HPLCIDICPMS分析

柱后同位素稀釋時(shí)，稀釋劑通過島津液相系統(tǒng)自帶的LC20AD泵加入，與液相色譜的洗脫液經(jīng)過三通混合后在線進(jìn)入ICPMS檢測。液相色譜實(shí)現(xiàn)混合蛋白分離，ICPMS檢測對蛋白定量分析。

質(zhì)譜得到的同位素比值譜圖，根據(jù)同位素稀釋公式（1），轉(zhuǎn)化為元素的質(zhì)量流（Mass flow）譜圖。積分質(zhì)量流譜圖中的峰面積可得到相應(yīng)蛋白中該元素的絕對含量，依據(jù)液相進(jìn)樣體積及蛋白所含元素個(gè)數(shù)，就可計(jì)算出蛋白的絕對濃度。

MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs（Rm-Rsp）（Rs-Rm）（1）

式中， csp， dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（ng/g）、密度（g/mL）和流速（mL/min）； Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量； Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度； Rm， Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。

血清中目標(biāo)蛋白的正常含量范圍不同：轉(zhuǎn)鐵蛋白2.35～3.00 g/L，白蛋白35～50 g/L；導(dǎo)致兩種蛋白中硫含量差別很大，為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相時(shí)間程序的前15 min（轉(zhuǎn)鐵蛋白出峰部分），34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min；之后白蛋白出峰時(shí)間段，流速提高到0.2 mL/min。[TS（][HT5”SS]圖14種混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白的液相色譜圖

Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS）]

3結(jié)果與討論

3.1含硫標(biāo)準(zhǔn)蛋白的絕對定量

尺寸排阻液相色譜分離4種混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Tf， Lacb， Myo和Lys）的譜圖如圖1所示， 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來，Tf， Lacb， Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時(shí)間分別為21.9， 23.9， 26.3和29.9 min。

2.3高效液相色譜分離條件

2.3.1尺寸排阻色譜（SEC）分離混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白尺寸排阻液相色譜常用的流動(dòng)相中高濃度鹽（如NaCl等）在質(zhì)譜錐上的堆積會(huì)影響ICPMS測量；文獻(xiàn)[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 mol/L乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)既能保證分離效果，又不會(huì)引入高濃度鹽；而且質(zhì)譜連續(xù)工作8 h，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的碳堆積。本實(shí)驗(yàn)所用的流動(dòng)相為0.1 mol/L 乙酸銨溶液，流速為0.4 mL/min， 紫外檢測器波長280 nm，分析時(shí)間40 min，等度洗脫。

2.3.2陰離子交換色譜（IEC）分離人血清由于轉(zhuǎn)鐵蛋白與白蛋白分子量接近，尺寸排阻色譜柱分離人血清時(shí)，兩者的保留時(shí)間重合，不能達(dá)到分離效果，因此采用陰離子交換柱Shodex QA825 IEC分離人血清。液相分離條件為 A相： 0.02 mol/L TrisHCl（pH 8.6）； B相： A+0.5 mol/L甲酸銨溶液，流速為0.7 mL/min， 時(shí)間程序： 0～30 min， 0～100% B； 梯度洗脫。 紫外檢測器波長為280 nm。

2.4HPLCIDICPMS分析

柱后同位素稀釋時(shí)，稀釋劑通過島津液相系統(tǒng)自帶的LC20AD泵加入，與液相色譜的洗脫液經(jīng)過三通混合后在線進(jìn)入ICPMS檢測。液相色譜實(shí)現(xiàn)混合蛋白分離，ICPMS檢測對蛋白定量分析。

質(zhì)譜得到的同位素比值譜圖，根據(jù)同位素稀釋公式（1），轉(zhuǎn)化為元素的質(zhì)量流（Mass flow）譜圖。積分質(zhì)量流譜圖中的峰面積可得到相應(yīng)蛋白中該元素的絕對含量，依據(jù)液相進(jìn)樣體積及蛋白所含元素個(gè)數(shù)，就可計(jì)算出蛋白的絕對濃度。

MFs=cspdspfspMsMspAbspAbs（Rm-Rsp）（Rs-Rm）（1）

式中， csp， dsp和fsp分別代表同位素稀釋劑的濃度（ng/g）、密度（g/mL）和流速（mL/min）； Ms和Msp分別表示樣品和稀釋劑中元素的原子量； Abs和Absp分別表示樣品和稀釋劑中核素b的豐度； Rm， Rsp和Rs分別表示混合樣品、稀釋劑和樣品中核素a與核素b的豐度比。

血清中目標(biāo)蛋白的正常含量范圍不同：轉(zhuǎn)鐵蛋白2.35～3.00 g/L，白蛋白35～50 g/L；導(dǎo)致兩種蛋白中硫含量差別很大，為保證Rm比值合適，采用改變稀釋劑流速的方法，在液相時(shí)間程序的前15 min（轉(zhuǎn)鐵蛋白出峰部分），34S同位素稀釋劑的流速為0.03 mL/min；之后白蛋白出峰時(shí)間段，流速提高到0.2 mL/min。[TS（][HT5”SS]圖14種混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白的液相色譜圖

Fig.1Liquid chromatogram of mixed standard proteins[HT5][TS）]

3結(jié)果與討論

3.1含硫標(biāo)準(zhǔn)蛋白的絕對定量

尺寸排阻液相色譜分離4種混合標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Tf， Lacb， Myo和Lys）的譜圖如圖1所示， 4種蛋白按照分子量大小依次被洗脫出來，Tf， Lacb， Myo和Lys在紫外檢測器檢測的保留時(shí)間分別為21.9， 23.9， 26.3和29.9 min。