高義霞，周向軍，王廷璞，袁毅君

（天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水 741001）

牛血清白蛋白-刺槐豆膠-殼聚糖緩釋納米微球的制備、表征及其體外釋放性能研究

高義霞，周向軍，王廷璞，袁毅君*

（天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅天水 741001）

以刺槐豆膠和殼聚糖為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，牛血清白蛋白（BSA）為模型藥物，采用交聯(lián)法制備BSA-刺槐豆膠-殼聚糖緩釋納米微球。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)探討不同戊二醛濃度、載體與BSA質(zhì)量比、水相：油相體積比及交聯(lián)時(shí)間對(duì)納米微球制備的影響，對(duì)納米微球進(jìn)行紅外光譜、熱重、元素分析、動(dòng)態(tài)光散射及形貌等表征，并測(cè)定體外釋放性能。結(jié)果表明，納米微球最佳制備工藝為：戊二醛濃度1.25%，載體與BSA比為20∶1，水相與油相比6∶1，交聯(lián)時(shí)間60min，在此條件下納米微球包封率為62.32%±0.39%，載藥量3.45%±1.43%。形貌分析表明，納米微球尺寸分布均一，平均粒徑約為80nm。納米微球具有一定的緩釋能力，在模擬小腸中釋放最快，胃中次之，大腸中最慢。

刺槐豆膠，殼聚糖，牛血清白蛋白，緩釋

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，多肽、蛋白質(zhì)類藥物不斷涌現(xiàn)，雖然其常規(guī)制劑療效早已經(jīng)臨床證實(shí)，但由于生物藥物半衰期短，需要長(zhǎng)期頻繁注射給藥，且不穩(wěn)定，從而使患者在心理和經(jīng)濟(jì)上均難以接受[1]。包裹多肽、蛋白質(zhì)藥物制成注射納米微球劑，使其在體內(nèi)達(dá)到緩釋目的，是近10多年來(lái)各國(guó)學(xué)者大力研究的新領(lǐng)域。殼聚糖具有生物組織相容性好、抗原性低、無(wú)毒和良好的生物活性等特性，引起了人們的極大關(guān)注，在過(guò)去的幾十年中，其在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用發(fā)展迅速[2-4]。殼聚糖廣泛應(yīng)用于緩釋、控釋制劑，已有了一定的研究[5]，如利用殼聚糖修飾脂質(zhì)體、納米微球、微囊等遞藥系統(tǒng)[6-7]，可控制藥物的釋放，改善易降解物質(zhì)的生物利用度，增強(qiáng)親水性藥物通過(guò)上皮層的滲透性等[8]。但如果單純利用殼聚糖制備的納米微球包載藥物，其強(qiáng)度差、成球率低，易影響包載量及緩釋能力。刺槐豆膠是一種水溶性高分子多糖類聚合體，其單元以1，4糖苷鍵連接的β-D-甘露糖為主鏈，在某些甘露糖基的6位上連接一個(gè)α-D-半乳糖構(gòu)成半乳甘露聚糖，二者比率約為4∶1，由于甘露糖和半乳糖比率的特殊性，決定了刺槐豆膠聚合體在水中三維立體結(jié)構(gòu)的特殊性，這使其本身能在特殊環(huán)境下形成凝膠且可以和其他親水膠體相互作用 產(chǎn) 生 凝 膠[9-11]，同 時(shí) 暴 露 出 活 性 基 團(tuán) 羥 基 ，更 利于包載藥物。本研究應(yīng)用殼聚糖與刺槐豆膠的協(xié)同作用，以BSA為模擬藥物，采取戊二醛交聯(lián)法以制備納米微球，并進(jìn)而研究其作為蛋白類藥物緩釋載體的緩釋能力。該研究為其應(yīng)用提供了基本實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PLPHR 1-4 LD真空 冷凍 干 燥 機(jī) 德 國(guó) Christ；NOCOLET FT-IR360 紅 外 掃 描 儀 美 國(guó) Nocolet公司 ； 元 素 分 析 儀 德 國(guó) Elementar Analysensysteme GmbH公司；BT-9300Z動(dòng)態(tài)光散射納米粒度分析儀丹東百特；Tecnai G2 20透射電鏡 美國(guó)FEI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 參考文獻(xiàn)[12]的方法，以吸光度為縱坐標(biāo)，BSA濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，制作 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 ：Y=0.02563X-0.00512，R2=0.9992，Y 為吸光度，X為BSA濃度（μg/mL）。

1.2.2 BSA-殼聚糖-刺槐豆膠緩釋納米微球的制備取0.5g殼聚糖溶解在50mL 2%乙酸中，將一定量的BSA分散于此殼聚糖溶膠中，為溶液A；另取0.5g刺槐豆膠分散于50mL熱水中，抽濾，收集上清液，為溶液B；將A、B兩種溶液混合均勻，轉(zhuǎn)入200mL恒壓漏斗中，緩慢滴入一定比例的石蠟油、石油醚、Span-80及吐溫-20混合液，500r/min攪拌30min以形成穩(wěn)定的微乳溶液。再緩慢滴加一定濃度的戊二醛為交聯(lián)劑，500r/min攪拌反應(yīng)一定時(shí)間后，丙酮破乳，沉淀，離心，分別收集沉淀和上清液。蒸餾水洗至茚三酮檢測(cè)[13]為陰性，收集沉淀，冷凍干燥至恒重，即為BSA-殼聚糖-刺槐豆膠緩釋納米微球，作為載藥球[14-15]，收集洗滌液，合并上清液備用。同法制備殼聚糖-刺槐豆膠緩釋納米微球，作為空白球。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以空白球?yàn)閷?duì)照，考察四個(gè)因素對(duì)BSA包封率的影響，優(yōu)選BSA-刺槐豆膠-殼聚糖緩釋納米微球的最佳制備工藝。

a.戊二醛濃度單因素實(shí)驗(yàn)：戊二醛濃度（v/v）0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、2%、3%，載體與BSA比（m/m）為20∶1，油相與水相比（v/v）為6∶1，交聯(lián)時(shí)間為60min；

力學(xué)性能要求：Rp0.2≥300MPa，Rm≥480MPa，A≥20%，AK V≥50J（20℃時(shí)）。超聲波無(wú)損檢測(cè)的檢驗(yàn)等級(jí)按EN12680一級(jí)，質(zhì)量等級(jí)按SN320第10部分進(jìn)行驗(yàn)收。

b.載體與BSA比單因素實(shí)驗(yàn)：載體與BSA比（m/m）為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1，戊二醛濃度（v/v）1.25%，油相與水相比（v/v）為6∶1，交聯(lián)時(shí)間為60min；

c.油相與水相比單因素實(shí)驗(yàn)：油相與水相比（v/v）為5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、10∶1、12∶1，戊二醛濃度（v/v）1.25%，載體與BSA比（m/m）為20∶1，交聯(lián)時(shí)間為60min；

d.交聯(lián)時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)：交聯(lián)時(shí)間為30、60、90、120、150min，戊二醛濃度（v/v）1.25%，載體與BSA比（m/m）為20∶1，油相與水相比（v/v）為6∶1。

1.2.4 包封率與載藥量的計(jì)算 取上述上清液1mL，以1.2.1法測(cè)定BSA含量，計(jì)算納米微球包封率和載藥量[16]。

包封率（%）=（最初加入BSA量-上清BSA量）/最初加入BSA量×100；

載藥量（%）=（總BSA量-游離BSA量）/納米微球質(zhì)量×100。

1.2.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 在最佳工藝條件下，重復(fù)制備載藥球和空白球各3次，以包封率和載藥量為指標(biāo)考察工藝穩(wěn)定性[17]。

1.2.6 緩釋納米微球的表征 利用紅外光譜、熱重分析對(duì)殼聚糖和刺槐豆膠混合物、空白球、載藥球進(jìn)行表征；利用元素分析法研究載藥球和空白球各特征元素的變化；利用動(dòng)態(tài)光散射納米粒度分析儀測(cè)定載藥球平均粒徑和粒徑分布；利用光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察載藥球的形貌[18]。

1.2.7 釋放性能的測(cè)定 分別配制下列溶液：pH2.0酸性緩沖液 （模擬胃液環(huán)境）；pH7.2磷酸鹽緩沖液（模擬小腸環(huán)境）[19]；pH9.0弱堿緩沖液 （模擬大腸環(huán)境），考察載藥球在不同介質(zhì)中的藥物釋放情況。精確稱取50mg載藥球于透析袋中，將透析袋置于錐形瓶中，分別加入100mL上述不同pH緩沖液于37℃搖床溫浴。每隔一定時(shí)間取樣1mL，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量，計(jì)算BSA釋放率，以空白球作對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

圖1 戊二醛濃度對(duì)包封率的影響Fig.1 The influence of glutaraldehyde concentration on encapsulation efficiency

2.1 納米微球制備工藝優(yōu)選

2.1.1 不同戊二醛濃度對(duì)納米微球包封率的影響 由圖1可知，當(dāng)戊二醛濃度小于1.25%（v/v）時(shí)，納米微球?qū)SA的包封率隨濃度升高而增加；當(dāng)戊二醛濃度為1.25%時(shí)，包封率達(dá)到最大值，為62.6%±1.15%（p＞0.05）。當(dāng)戊二醛濃度在1.25%～2%范圍時(shí)，包封率急劇下降；當(dāng)戊二醛濃度大于2%時(shí)，包封率幾乎保持不變?？赡茉蚴俏於┘仁墙宦?lián)劑，又是蛋白質(zhì)變性劑。當(dāng)戊二醛濃度較低時(shí)，形成的微球機(jī)械強(qiáng)度低，BSA在被固定化后仍容易脫落；戊二醛濃度過(guò)高除了自身發(fā)生羥醛縮合，固化成不規(guī)則物附在產(chǎn)物表面，影響微球的表面孔結(jié)構(gòu)，使得BSA不易被固定，此外酶與載體上的過(guò)多的醛基反應(yīng)會(huì)引起B(yǎng)SA發(fā)生變性[20]。因此在本實(shí)驗(yàn)中，最適戊二醛濃度為1.25%。2.1.2 載體與BSA不同比對(duì)包封率的影響 由圖2知，當(dāng)載體與BSA比小于20∶1時(shí)，納米微球?qū)SA的包封率隨比值的升高而增加；當(dāng)載體與BSA比為20∶1時(shí)，包封率達(dá)到最大值，為64.48%±0.35%（p＞0.05）。當(dāng)載體與BSA比大于20∶1時(shí)，包封率隨比值的升高而降低。這是因?yàn)檩d體對(duì)模型藥物有最大的承載量，載體偶聯(lián)的BSA直接影響固定化藥物的包封率，因而載體與BSA不同比將嚴(yán)重影響包封率。當(dāng)負(fù)載的BSA達(dá)到一定量后，再增加給藥量反而會(huì)增加固定化藥物分子之間的擁擠程度，使之與底物結(jié)合時(shí)空間阻礙增大，造成藥物包封率降低[20]。因此實(shí)驗(yàn)中最佳載體與BSA比為20∶1。

圖2 載體與BSA的比對(duì)包封率的影響Fig.2 The influence of carrier/BSA on encapsulation efficiency

2.1.3 不同水相：油相比（W/O）對(duì)包封率的影響 由圖3知，當(dāng)W/O低于5∶1時(shí)，反應(yīng)體系不能形成穩(wěn)定的微乳液，納米微球產(chǎn)率過(guò)低，因此本實(shí)驗(yàn)以W/O=5∶1為初始值。當(dāng)W/O低于6∶1時(shí)，納米微球?qū)SA的包封率隨W/O比的增大而升高；當(dāng)W/O=6∶1時(shí)，包封率達(dá)到最大值，為62.8%±0.54%（p＞0.05）；當(dāng)W/O高于6∶1時(shí)，包封率隨著W/O比的升高而降低。可能原因是W/O低于6∶1時(shí)，油相過(guò)量，水相不足，成球率低；但當(dāng)W/O高于6∶1時(shí)，水相過(guò)量，形成的微乳液較稀，較難成 球 ，造 成 納 米 微 球 包 封 率 下 降[21]。 因 此 在 本 實(shí) 驗(yàn)中，最適W/O=6∶1。

2.1.4 不同交聯(lián)時(shí)間對(duì)包封率的影響 由圖4可見(jiàn)，當(dāng)時(shí)間低于60min時(shí)，納米微球?qū)SA的包封率隨時(shí)間的增加而升高；當(dāng)時(shí)間為60min時(shí)，包封率達(dá)到最大值，為62.8%±0.6%（p＞0.05）。當(dāng)時(shí)間大于60min時(shí)，包封率隨時(shí)間的增加而降低。這是因?yàn)榻宦?lián)時(shí)間太短，交聯(lián)不充分，固定的BSA少；當(dāng)交聯(lián)時(shí)間太長(zhǎng)，載體之間交聯(lián)的納米微球空隙過(guò)于致密使得BSA很難包載[20]。在本實(shí)驗(yàn)中，最適交聯(lián)時(shí)間為60min。

圖3 水相與油相的比對(duì)包封率的影響Fig.3 The influence of water/oil phase on encapsulation efficiency

圖4 時(shí)間對(duì)包封率的影響Fig.4 The influence of time on encapsulation efficiency

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 在戊二醛濃度為1.25%，載體與BSA比20∶1，W/O為6∶1，交聯(lián)時(shí)間60min條件下，重復(fù)制備納米微球及空白球三次，考察制備工藝的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表1。重復(fù)三次得到納米微球包封率61%～63%之間變化，基本穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.24%。納米微球載藥量在3.45%～3.55%之間變化，比較穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.05%。因此，BSA-殼聚糖-刺槐豆膠緩釋納米微球的制備工藝穩(wěn)定性好，重復(fù)率高。

表1 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 1 Stability testing

2.2 BSA-刺槐豆膠-刺槐豆膠緩釋納米微球的表征

2.2.1 納米微球的紅外分析 采用KBr壓片法分別測(cè)定刺槐豆膠和殼聚糖混合物、空白球和載藥球官能團(tuán)的吸收峰，并進(jìn)行比較，見(jiàn)圖5?？芍?，三者均在3400、2920、1080cm-1等處出現(xiàn)較強(qiáng)吸收峰，此為多糖類物質(zhì)特征吸收峰。但與殼聚糖和刺槐豆膠混合物相比，納米微球在3400、1080cm-1處信號(hào)大為減弱，而3400cm-1歸屬為多糖羥基或殼聚糖氨基的伸縮振動(dòng)，1080cm-1歸屬為C-NH2的伸縮振動(dòng)，可能原因?yàn)榱u基和氨基參與反應(yīng)而被保護(hù)。與殼聚糖和刺槐豆膠混合物不同，納米微球在1640cm-1出現(xiàn)吸收峰，歸屬為西佛堿的C=N-C的振動(dòng)，可能是殼聚糖氨基與戊二醛交聯(lián)形成西佛堿官能團(tuán)的信號(hào)峰；在3400、1080cm-1處信號(hào)強(qiáng)度減弱，可能是多糖羥基或殼聚糖氨基被BSA保護(hù)，信號(hào)峰強(qiáng)度降低。

圖5 納米微球的紅外分析Fig.5 Infrared analysis of microspheres

2.2.2 納米微球熱重分析 由圖6a，可知三種物質(zhì)在第一階段的失重率較緩慢，載藥球在26～150℃范圍內(nèi)失重率為7.59%，空白球失重率為7.79%，殼聚糖和刺槐豆膠混合物失重9.65%。第二階段均出現(xiàn)快速失重，載藥球在150～300℃范圍內(nèi)失重率為37.28%，空白球失重率為36.17%，殼聚糖和刺槐豆膠混合物急劇失重，為38.21%。第三階段失重逐漸變緩，載藥球在300～400℃范圍內(nèi)失重率為25.18%，空白球失重率為36.03%，載藥球失重12%。第四階段載藥球在400～800℃范圍內(nèi)失重變緩，載藥球失重為9.87%，失重率為17.67%，殼聚糖和刺槐豆膠混合物失重8.25%。三物質(zhì)相比之下：載藥球與空白球穩(wěn)定性相當(dāng)，殼聚糖和刺槐豆膠混合物的熱穩(wěn)定性最好。即戊二醛的引入使得殼聚糖或刺槐豆膠的分子結(jié)構(gòu)變得松散，熱穩(wěn)定性降低。從圖6b可看出，整個(gè)失重過(guò)程都是放熱反應(yīng)。這表明，在氮?dú)夥諊?，沒(méi)有明顯的氧化過(guò)程，只是熱裂解反應(yīng)。

2.2.3 納米微球的元素分析 由表2知，載藥球的N、C、H三元素的百分含量均升高，且C、N元素升高的最多，這說(shuō)明BSA已被納米微球吸附。

圖6 納米微球熱重分析Fig.6 Thermogravimetric analysis of microspheres

表2 納米微球的元素分析Table 2 Element analysis of microspheres

2.2.4 動(dòng)態(tài)光散射 圖7是通過(guò)動(dòng)態(tài)激光散射儀對(duì)載藥球粒徑大小及分布的檢測(cè)結(jié)果，由圖7可知，納米微球的粒徑約在55～110nm之間，基本符合正態(tài)分布。計(jì)算出平均粒徑為79.3nm。

圖7 納米微球的粒徑分布Fig.7 Size distribution of microspheres

2.2.5 納米微球的形貌觀察 利用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡對(duì)干態(tài)納米微球拍照（圖8），可見(jiàn)納米微球具有了凹凸面和孔穴結(jié)構(gòu)，尺寸分布均勻，粒徑大約為80nm，與動(dòng)態(tài)光散射結(jié)果一致。具有凹凸面和空穴結(jié)構(gòu)，說(shuō)明微球表面某些基團(tuán)易解離，但微球仍具有完整的骨架結(jié)構(gòu)，且分散性好、無(wú)團(tuán)聚現(xiàn)象，適合作為BSA的緩釋的載體。

圖8 納米微球的形貌Fig.8 Morphology of microspheres

2.3 納米微球?qū)SA的緩釋分析

不同pH條件下緩釋率隨時(shí)間的變化（p＜0.01），見(jiàn)圖9，在體外模擬人體消化道環(huán)境（胃、小腸、大腸）制備的三種不同pH緩沖液中，BSA緩釋率表現(xiàn)出相似的藥物釋放動(dòng)力學(xué)模式，即早期快速的釋放和后期的緩慢、持續(xù)釋放。開(kāi)始前5h，三種不同pH緩沖液對(duì)BSA的緩釋率隨時(shí)間的增加而升高，緩釋率變化趨勢(shì)相對(duì)較快；5h后緩釋變化趨勢(shì)隨時(shí)間推移逐漸變慢，當(dāng)達(dá)25h時(shí)，pH2.0、7.2、9.0緩沖液對(duì)BSA緩釋率分別為80.2%±0.99%、88.06%±0.51%和82.84%±0.06%。但三種不同pH的緩沖液對(duì)BSA的緩釋速率不同，pH2.0酸性緩沖液釋放最快，在20h內(nèi)，pH7.2環(huán)境較9.0快，即納米微球在模擬小腸緩沖液中釋放最快，胃中次之，大腸中釋放最慢。

3 結(jié)論

以殼聚糖和刺槐豆膠為載體，戊二醛為交聯(lián)劑，制備BSA-刺槐豆膠-殼聚糖緩釋納米微球，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選出納米微球制備的最佳工藝：戊二醛濃度為1.25%，載體/BSA20∶1，W/O為6∶1，交聯(lián)時(shí)間60min，對(duì)此條件下制備的納米微球進(jìn)行表征，納米微球尺寸分布均一，平均粒徑為80nm左右；與載體相比，納米微球的穩(wěn)定性稍有降低。體外釋放實(shí)驗(yàn)表明納米微球?qū)SA具有一定的緩釋能力。因此BSA-刺槐豆膠-殼聚糖緩釋納米微球可作為蛋白類藥物緩釋載體，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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Preparation，characterization and in vitro releasing property of bovine serum albumin-locust bean gum-chitosan sustained-release microspheres

GAO Yi-xia，ZHOU Xiang-jun，WANG Ting-pu，YUAN Yi-jun*
（College of Life Science and Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China）

Bovine serum albumin（BSA）-locust bean gum-chitosan sustained-release microspheres were prepared by cross-linking method using locust bean gum and chitosan as carrier，glutaraldehyde cross-linking agent and BSA model drug.The effects of different glutaraldehyde concentration ，the ratio of carrier to BSA and water to oil phase，and cross-linking time on microspheres preparation were investigated by single factor experiments. The resulting microspheres were characterized by infrared spectrum，thermogravimetric analysis，element analysis，dynamic light scattering and morphology analysis.At the same time，its releasing property was also determined.The results showed that the optimal preparation technology for microspheres were glutaraldehyde concentration 1.25% ，the ratio of carrier to BSA and water to oil phase 20 ∶1 and 6 ∶1，respectively and crosslinking time 60min.Under these conditions，encapsulation efficiency and drug loading for microspheres were 62.32% ±0.39%and 3.45%±1.43% ，respectively.The morphology of microspheres was in uniform size with the average diameter of 80nm.The microspheres had certain sustained-release capability，and their releasing rate was as follows：small intestine＞stomach＞large intestine.

locust bean gum；chitosan；bovine serum albumin；sustained-release

TS201.1

B

1002-0306（2014）20-0332-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.064

2014－01-06

高義霞（1982-），女，碩士研究生，講師，研究方向：資源植物的開(kāi)發(fā)利用研究。

* 通訊作者：袁毅君（1966-），女，博士，教授，研究方向：中藥活性成分提取分離及藥理研究。

天水師范學(xué)院“青藍(lán)”人才工程基金資助；國(guó)家自然基金（81360619）。