施鵬飛，肖海峻，羅紅霞，孟利前，田 璐，楊新建，王偉青

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 102442）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化紫薯花青素提取工藝

施鵬飛，肖海峻*，羅紅霞，孟利前，田 璐，楊新建，王偉青

（北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院食品與生物工程系，北京 102442）

以紫甘薯花青素為原料，采用檸檬酸水溶液為提取劑，分別研究提取劑濃度、浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比對(duì)花青素提取率的影響。在此基礎(chǔ)上，采用3因素3水平響應(yīng)面分析法，以吸光度為響應(yīng)值，探討浸提溫度、浸提時(shí)間和料液比對(duì)紫薯花青素提取的影響并對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。紫薯花青素在波長(zhǎng)為524nm處有最大吸收峰。單因素實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)檸檬酸濃度為5%、浸提溫度為50℃、浸提時(shí)間為4h、料液比為1∶20g/mL時(shí)花青素提取率達(dá)到最大。響應(yīng)面分析證明對(duì)花青素提取率影響大小的順序?yàn)榱弦罕?、提取溫度和提取時(shí)間。響應(yīng)面分析法確定紫薯花青素最佳提取工藝參數(shù)為：提取溫度46℃，提取時(shí)間6h，料液比1∶23g/mL，在此條件下花青素含量為159mg/100g。

紫甘薯，花青素，響應(yīng)面分析法，最佳提取工藝

花青素主要是一類花色素糖苷類化合物的水溶性色素，在自然狀態(tài)下，與植物體內(nèi)的各種單糖結(jié)合形成糖苷，又稱花色苷[1]?；ㄇ嗨仡伾纳顪\與其含量呈正相關(guān)，由于其優(yōu)越的著色能力，已作為食品添加劑應(yīng)用于果醬、糕點(diǎn)等產(chǎn)品中[2-3]。目前用溶劑提取法提取紫薯花青素的研究主要有：呂躍東等[4]對(duì)紫薯花青素的乙醇浸提工藝進(jìn)行了優(yōu)化；樊婷等[5]采用檸檬 酸 － 乙 醇 法 提 取 花 青 素 ；Gongjian Fan等[6]以HCL －乙醇為提取劑。但是提取花青素的提取劑乙醇、HCL等的殘留對(duì)花青素的應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。然而紫甘薯花青素在酸性條件下可在破壞紫甘薯細(xì)胞膜的同時(shí)溶解水溶性的紫甘薯花色素，而檸檬酸作為食用酸類，在某些食品中添加檸檬酸，不僅可以改善食品的感官性狀、增強(qiáng)食欲，而且還可以促進(jìn)體內(nèi)鈣、磷物質(zhì)的消化吸收，能夠避免其他提取劑帶來(lái)的不良反應(yīng)，因此本研究中以檸檬酸作為提取劑對(duì)紫甘薯花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選出最佳參數(shù)，為紫薯深加工奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫甘薯 大興區(qū)龐各莊鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣站提供；檸檬酸 分析純。

FW80高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；BSA224S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；GL-88B旋渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；Eppendorf離心機(jī)5804R 北京博儀恒業(yè)科技發(fā)展有限公司；SHB-Ⅲ真空循環(huán)水勢(shì)多用泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；UV2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫薯粉的制備 將紫色甘薯洗凈、切成（刀）3mm薄片，在烘箱45℃下烘干至恒重。粉碎后過(guò)60目篩，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 紫薯花青素提取工藝流程 紫薯粉→提取劑懸浮→恒溫水浴提取→離心→抽濾→花青素提取液→定容→測(cè)吸光度。

1.2.3 測(cè)試方法 采用比吸光度法：我國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn) 化 委 員 會(huì) 建 議采用 比 吸 光 度E（λmax）表 示 色 素含量[7]：

E=A/m

式中：A為樣品稀釋至100mL時(shí)，用1cm比色皿測(cè)得最大吸收波長(zhǎng)下的吸光度；m為樣品質(zhì)量g。

由上式可以看出，當(dāng)樣品質(zhì)量相同時(shí)，花青素的比吸光度與吸光度成正比，為方便起見(jiàn)，直接用吸光度值分析比較不同提取條件下花青素的提取率大小。

以紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)得的吸光度值計(jì)算紫薯花青素含量公式[8]：

C=1/958×V/100×1/M×ABS×100000。

其 中 ：C：花 青 素 含 量 ，單 位 為 mg/100g（鮮 薯）；958：ABS轉(zhuǎn)換為質(zhì)量體積比的經(jīng)驗(yàn)系數(shù)；V：定容體積（mL）；M：樣品質(zhì)量（g）；ABS：分光光度計(jì)的吸光度值；100000：?jiǎn)挝晦D(zhuǎn)換系數(shù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 紫甘薯花青素光譜特性研究 準(zhǔn)確稱取已粉碎并過(guò)60目篩的紫薯粉末0.5g，加入提取劑10mL（5%檸檬酸為提取劑），于60℃恒溫水浴下浸提2h，抽濾，將濾液稀釋100倍后，取花青素稀釋液在400～700nm波長(zhǎng)下進(jìn)行波譜掃描，以篩選紫薯花青素的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2 紫甘薯花色苷提取的單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 檸檬酸濃度的篩選 準(zhǔn)確稱取1g紫薯粉各7份，分別加入濃度為0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%的檸檬酸提取劑，料液比為1∶10，于60℃恒溫水浴下浸提6h，提取液3500r/min離心10min，然后將上清液抽濾，濾液用相應(yīng)的提取劑稀釋至100mL，分別于最大吸收峰處測(cè)定其吸光值，重復(fù)3次。

1.3.2.2 提取溫度的篩選 準(zhǔn)確稱取1g紫薯粉各6份，按照料液比為1∶10加入5%檸檬酸，分別于30、40、50、60、70、80、90℃恒溫水浴下浸提6h，提取液3500r/ min離心10min，然后將上清液抽濾，濾液用5%檸檬酸稀釋至100mL，分別于最大吸收峰處測(cè)定其吸光值，重復(fù)3次。

1.3.2.3 提取時(shí)間的篩選 準(zhǔn)確稱取1g紫薯粉各5份，按照料液比為1∶10加入5%檸檬酸，于60℃恒溫水浴下分別浸提2、4、6、8、10h，提取液3500r/min離心10min，然后將上清液抽濾，濾液用5%檸檬酸稀釋至100mL，分別最大吸收峰處測(cè)定其吸光值，重復(fù)3次。1.3.2.4 料液比的篩選 準(zhǔn)確稱取1g紫薯粉各6份，然后分別按照不同的料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入5%檸檬酸提取劑，于60℃恒溫水浴下浸提6h，提取液3500r/min離心10min，將上清液抽濾，濾液用5%檸檬酸提取劑稀釋至100mL，分別于最大吸收峰處測(cè)定其吸光值，重復(fù)3次。

1.3.3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表 應(yīng)用響應(yīng)面法，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，自變量的實(shí)驗(yàn)水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼表，共設(shè)計(jì)17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，其中12個(gè)為析因點(diǎn)，5個(gè)零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差[9-11]。以吸光度為響應(yīng)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因子及水平表Table 1 Factors and levels results of RSD （response surface design）

2 結(jié)果與分析

2.1 紫薯花青素最大吸收峰值的篩選

制得紫薯花青素的粗提液后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在400～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，每隔2nm對(duì)紫薯花青素的吸收光譜進(jìn)行掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1，由圖1可知，紫薯花青素粗提液在524nm處有最大吸收峰。

圖1 紫甘薯花青素在400～700nm可見(jiàn)光下的吸收光譜Fig.1 Visible absorbance spectrum（400～700nm）of the purple sweet potato anthocyanin

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.2.1 檸檬酸水溶液濃度對(duì)吸光度的影響 檸檬酸是一種有機(jī)酸，目前已廣泛的應(yīng)用到食品、醫(yī)藥和日化等行業(yè)，用檸檬酸作為提取劑，可避免其他有機(jī)提取劑帶來(lái)的負(fù)面影響。為進(jìn)一步探索檸檬酸水溶液的最佳提取濃度，本實(shí)驗(yàn)按料液比為1∶10加入不同濃度的檸檬酸提取劑，在60℃恒溫水浴下浸提6h，分別測(cè)定其吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，吸光度隨檸檬酸濃度的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)檸檬酸濃度為5%時(shí)達(dá)到最大值，表明此時(shí)花青素的提取率最大?；ㄇ嗨氐慕Y(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性受不同檸檬酸濃度的影響很大，但是二者間的相互關(guān)系尚不明確。

2.2.2 提取溫度對(duì)吸光度的影響 按照料液比為1∶10加入5%檸檬酸，在不用水浴溫度下浸提6h，然后測(cè)定其吸光度變化，測(cè)定結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，在水浴溫度為30～50℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，比吸光值呈增加趨勢(shì)，表明提取液中花青素的含量在增加，當(dāng)水浴溫度達(dá)到50℃時(shí)花青素提取率達(dá)到最高；當(dāng)水浴溫度超過(guò)50℃之后，花青素的提取率隨溫度的升高而降低，這可能與過(guò)高的溫度破壞花青素的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖3 提取溫度對(duì)吸光度的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on absorbance of anthocyanin

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)吸光度的影響 按照料液比為1∶10加入5%檸檬酸，在水浴溫度為50℃下浸提2、4、6、8、10h，然后測(cè)定其吸光度變化，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，吸光度隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，當(dāng)浸提取時(shí)間為4h時(shí)吸光度達(dá)到最高，表明此時(shí)花青素提取率達(dá)到最大值。出現(xiàn)這種情況的原因是：在剛開(kāi)始時(shí)，花青素隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷被溶解出，在短時(shí)間內(nèi)即可溶解的較為完全，此后，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，由于花青素由于受到溫度的影響，其結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性受到影響，其含量出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖4 提取時(shí)間對(duì)吸光度的影響Fig.4 Effects of extraction time on absorbance of anthocyanin

2.2.4 料液比對(duì)吸光度的影響 分別加入料液比為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的檸檬酸提取劑，于60℃恒溫水浴下浸提6h，分別測(cè)定其吸光度，測(cè)定結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，吸光度隨溶劑量的增加而增加，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)達(dá)到最大值，之后隨溶劑量的增加吸光度有增大的趨勢(shì)，但趨于平緩。為了節(jié)約成本，在實(shí)驗(yàn)中選擇料液比為1∶20。出現(xiàn)這種情況的原因可能是隨著提取劑用量的增加，花青素溶解到溶液中的速度加快，但當(dāng)提取劑的量達(dá)到一定程度時(shí)，花青素溶解趨于完全，這時(shí)即使再增加提取劑的量，花青素可溶解的量不再增多。

圖5 料液比對(duì)吸光度的影響Fig.5 Effects of ratio of material to liquid on absorbance of anthocyanin

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化紫薯花青素提取的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

采用響應(yīng)面法（RSM）優(yōu)化紫薯花青素提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2 。對(duì)表2中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到回歸方程方差分析見(jiàn)表3。

利用Design Expert軟件，通過(guò)對(duì)表2中吸光度實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得紫甘薯花青素吸光度對(duì)編碼自變量提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）和料液比（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=1.55145－0.02709A－0.01228B+0.10481C － 0.02706AB+0.00075BC+ 0.00269BC－0.06798A2－0.05535B2－0.18116C2。

在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，水浴浸提對(duì)紫甘薯花青素吸光度的影響，一次項(xiàng)的偏回歸方程系數(shù)的絕對(duì)值C＞A＞B，說(shuō)明料液比對(duì)紫薯花青素的吸光度影響最大，其次是提取溫度，最小是提取時(shí)間。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design and results of RSD（response surface design）tests

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for items of regression equation

從該模型的方差分析（表3）可以看出，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型極顯著性（p＜0.0001），失擬項(xiàng)不 顯 著（p=0.7973 ＞0.05），回 歸 模 型 的 相 關(guān) 系 數(shù) 為0.97478，說(shuō)明該模型能夠解釋97.478%的響應(yīng)值變化，模型擬合程度較好，對(duì)實(shí)踐具有指導(dǎo)意義，可以用此模型對(duì)紫薯花青素的吸光度進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

一次項(xiàng)中，料液比對(duì)響應(yīng)值影響極顯著，提取溫度對(duì)響應(yīng)值影響顯著，提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值影響不顯著；二次項(xiàng)中，提取溫度、提取時(shí)間和料液比和對(duì)響應(yīng)值影響都極顯著；交互項(xiàng)中，提取溫度和提取時(shí)間，提取溫度和料液比以及提取時(shí)間和料液比對(duì)響應(yīng)值影響都不顯著。

為了觀察某個(gè)因素及其交互作用同時(shí)對(duì)吸光度的影響，將其他因素條件保持不變，獲得每個(gè)因素及其交互作用對(duì)吸光度影響的一組動(dòng)態(tài)響應(yīng)曲面圖（圖6～圖8），從而確定因素的最佳參數(shù)范圍。

圖6 提取溫度和提取時(shí)間對(duì)吸光度交互影響的曲面圖Fig.6 Response surface of extraction temperature and extraction time on absorbance of anthocyanin

從提取溫度和提取時(shí)間對(duì)吸光度的響應(yīng)曲面（圖6）可以看出，當(dāng)料液比在最佳值時(shí)，隨著提取溫度的增加，吸光度先增大后減?。浑S著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度先增大后減小。由圖6可以確定最佳水平范圍即提取溫度為46～49℃，提取時(shí)間為3.5～3.9h。

圖7 提取溫度和料液比對(duì)吸光度交互影響的曲面圖Fig.7 Response surface of extraction temperature and ratio of material to liquid on absorbance of anthocyanin

從提取溫度和料液比對(duì)吸光度的響應(yīng)曲面（圖7）可以看出，當(dāng)提取時(shí)間在最佳值時(shí)，隨著提取溫度的增加，吸光度先增大后減??；隨著料液比的增加，吸光度先增大后減小。由圖7可以確定最佳水平范圍即提取溫度為47～50℃，料液比為1∶21～1∶24。

從提取時(shí)間和料液比對(duì)吸光度的響應(yīng)曲面（圖8）可以看出，當(dāng)提取溫度在最佳值時(shí)，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度先增大后減小，因?yàn)樵趧傞_(kāi)始時(shí)，花青素隨時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷被溶解出，在短時(shí)間內(nèi)即可溶解的較為完全，此后，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，花青素的穩(wěn)定性受到影響，其含量出現(xiàn)下降；隨著料液比的增加，吸光度先增大后減小，由于隨著提取劑用量的增加，花青素溶解到溶液中的速度加快，但當(dāng)提取劑的量達(dá)到一定程度時(shí)，花青素溶解趨于完全，這時(shí)即使再增加提取劑的量，花青素可溶解的量不再增多。由圖8可以確定最佳水平范圍即提取時(shí)間為3.8～4.2h，料液比為1∶22～1∶25。

2.4 最優(yōu)提取工藝參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)Design-Expert軟件進(jìn)行分析，得到回歸方程的最大值點(diǎn)是：提取溫度46.05℃，提取時(shí)間6.00h，料液比1∶22.95，預(yù)期的吸光度為1.51046?？紤]到實(shí)際操作中遇到問(wèn)題，將提取工藝條件修正為：提取溫度46℃，提取時(shí)間6h，料液比1∶23，按此工藝參數(shù)做3次平行實(shí)驗(yàn)，吸光度的平均值為1.52773，與理論預(yù)測(cè)值1.51046相比，相對(duì)誤差為1.143%，證明了方程的可靠性與響應(yīng)面分析法的有效性。此條件下，花青素含量為159mg/100g。

圖8 提取時(shí)間和料液比對(duì)吸光度交互影響的等高線圖和曲面圖Fig.8 Response surface of extraction time and ratio of material to liquid on absorbance of anthocyanin

3 結(jié)論

通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，建立了水浴浸提紫薯花青素的數(shù)學(xué)模型，以比吸光度為響應(yīng)值，各因素影響的主次順序?yàn)椋毫弦罕龋窘釡囟龋咎崛r(shí)間＞。通過(guò)提取工藝響應(yīng)面研究，確定了水浴浸提紫薯花青素的最佳工藝參數(shù)是：提取溫度46℃，提取時(shí)間6h，料液比1∶23，在此條件下紫甘薯花色苷比吸光度達(dá)到1.52773，計(jì)算得花青素含量為159mg/100g。綜上所述，利用響應(yīng)曲面法對(duì)紫甘薯花色苷的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，可獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，可以減少工藝操作的盲目性，為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定一定基礎(chǔ)。

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Optimization of extraction water bath for anthocyanins from purple sweet potato by response surface method

SHI Peng-fei，XIAO Hai-jun*，LUO Hong-xia，MENG Li-Qian，TIAN Lu，YANG Xin-jian，WANG Wei-qing
（Department of Food and Bioengineering，Beijing Vocational College of Agriculture，Beijing 102442，China）

Confirm parameter optimization of extraction process of anthocyanins from purple aweet potato.Some factors affecting the ratio of extraction of proanthocyanidins such as extraction concentration ， extraction temperature，extraction time and ratio of material to liquid were respectively studied used citric acid as extractant，the preparation process of anthocyanins from purple sweet potato was optimized according to Box-Behnken central composition design principle on foundation of single factor experiment，the method of response surface methodology （ RSM ） with 3 factors and 3 levels combined with Design-Expert data analysis software was adopted with the extraction yield of anthocyanins from purple sweet potato as the absorbance.The anthocyanins extraction yield would respectively reach the maximum when some parameters as follows：extraction concentration was 5% ，extraction temperature was 50℃ ，extraction time was 4h，ratio of material to liquid was 1∶20g/mL，and RSM also confirmed that affecting the ratio of extraction of proanthocyanidins in turns as follows：ratio of material to liquid，extraction temperature and extraction time.The optimum preparation conditions were obtained as follows ：extraction temperature 46℃ ， extraction time 6h ，ratio of material to liquid 1 ∶23g/mL.The anthocyanin extraction amount was 159mg/100g under these condition.

purple sweet potato；anthocyanins；response surface methodology（RSM）；optimum extraction process

TS255.1

B

1002-0306（2014）20-0322-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.062

2013－09－27

施鵬飛（1987-），男，大學(xué)本科，助教，研究方向：微生物與食品檢測(cè)。

* 通訊作者：肖海峻（1966-），女，博士，教授，研究方向：植物種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)與利用。

北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院博士基金項(xiàng)目——紫甘薯花青素提取工藝研究；北京市職業(yè)院校教師素質(zhì)提高工程。