任 萌，高國富，咸 漠，楊建明，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.中國科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東青島 266101）

α-蒎烯的發(fā)酵動力學(xué)模型

任 萌1，2，高國富1，*，咸 漠2，楊建明2，*

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江蘇南京 210095；2.中國科學(xué)院生物基材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，山東青島 266101）

以α-蒎烯生產(chǎn)菌株YJM28為供試菌株，對其發(fā)酵動力學(xué)特征進(jìn)行了研究。通過對Logistic等方程進(jìn)行了最優(yōu)參數(shù)估計(jì)和非線性擬合，得出了α-蒎烯的發(fā)酵動力學(xué)模型及相關(guān)參數(shù)。并且對動力學(xué)模型的擬合曲線分析可知，發(fā)酵實(shí)驗(yàn)值與模型預(yù)測值能夠較好的吻合，說明所建立的發(fā)酵動力學(xué)模型能夠較好的反應(yīng)α-蒎烯的發(fā)酵過程。

α-蒎烯，發(fā)酵動力學(xué)模型，擬合

α-蒎烯是一種重要的天然產(chǎn)物，主要存在于松節(jié)油當(dāng)中，廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥、香料、醫(yī)藥以及精細(xì)有機(jī)合成工業(yè)[1-2]。利用微生物法生產(chǎn)α-蒎烯具有原料來源廣泛，生產(chǎn)不受季節(jié)限制，生產(chǎn)周期短以及易擴(kuò)大生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。由于遺傳背景清楚，基因操作簡單，大腸桿菌被廣泛應(yīng)用于微生物發(fā)酵領(lǐng)域中[3-4]，利用重組后的大腸桿菌進(jìn)行α-蒎烯的生產(chǎn)研究報(bào)告較少，而有關(guān)其發(fā)酵過程中的生長特性、發(fā)酵動力學(xué)分析方面研究未見文獻(xiàn)報(bào)道。

本文以重組大腸桿菌YJM28作為實(shí)驗(yàn)菌株，研究 了 該 菌 株 的 發(fā) 酵 動 力 學(xué) 性 質(zhì) 。 利 用 Logistic 及Luedeking-Piret方程建立了該菌的菌體生長、產(chǎn)物合成以及底物消耗的動力學(xué)模型。通過Matlab 2012軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，擬合出所有的模型參數(shù)，建立發(fā)酵動力模型[6]。最后對模型預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)真實(shí)值之間進(jìn)行比較，驗(yàn)證所得模型的可靠性。本文目的是初步確定YJM28的發(fā)酵動力學(xué)模型，為進(jìn)一步優(yōu)化及放大提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

重組大腸桿菌YJM28（recombination Escherichia coli YJM28） 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建及保存；氨芐青霉素 北京索來寶公司；氯霉素 購自北京東勝泰博科技有限公司；誘導(dǎo)劑IPTG 購自合肥BIOSHARP公司；蛋白胨 天津大茂試劑有限公司；其余試劑 均為國藥公司分析純試劑。

種子培養(yǎng)基 蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min，冷卻后使用；發(fā)酵培養(yǎng)基（1L） 檸檬酸鐵銨0.15g，K2HPO4·3H2O 4.9g，C6H8O7·H2O 0.525g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min，冷卻后使用；葡萄糖（20g/L）、MgSO4（1mol/L） 115℃滅菌30min，冷卻后4℃保存；氨芐青霉素（100mg/L）、氯 霉 素（34mg/L）、IPTG溶 液（20mg/mL） 過 濾 滅 菌后-20℃保存；微量元素溶液（0.37g（NH4）6Mo7O24·4H2O，0.29g ZnSO4·7H2O，2.47g H3BO4，0.25g CuSO4·5H2O，1.58g MnCl2·4H2O，用 蒸 餾 水 定 容 至 100mL）過 濾 滅菌后4℃保存。

Cary-50紫外-可見分光光度計(jì) 美國瓦里安技術(shù)有限公司；SP-6890氣相色譜儀 山東魯南瑞紅化學(xué)分析儀器有限公司；IS-RDS3恒溫振蕩器 美國CRYSTAL公司；1-14臺式高速離心機(jī) 美國Sigma公司；SBA-40C生物傳感器 山東省微生物研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 用無菌牙簽挑取單克隆于3mL LB培養(yǎng)液中活化，再以5%接種量接入40mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，180r/min培養(yǎng)4h后準(zhǔn)備轉(zhuǎn)接。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 按1%接種量轉(zhuǎn)接上一步活化好的種子至590mL厭氧培養(yǎng)瓶中，37℃，180r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6～0.9，接著，以終濃度為0.04mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后加瓶塞并將培養(yǎng)溫度調(diào)至30℃，轉(zhuǎn)速不變，連續(xù)發(fā)酵48h[5]。

1.2.3 α-蒎烯發(fā)酵液的檢測 發(fā)酵液在10000r/min下離心1min，取上清液稀釋，采用SBA-40C生物傳感器分析儀分析葡萄糖濃度；細(xì)胞密度用紫外-可見風(fēng)光光度計(jì)測定OD600，1個OD600菌體密度相當(dāng)于0.2g/L菌體干重；發(fā)酵產(chǎn)物采用SP-6890氣相色譜儀進(jìn)行檢測（柱型號HP-INNOWAX；檢測器FID，200℃；進(jìn)樣量1mL搖瓶上空氣體；柱溫升溫程序50℃保溫0.5min，然后4℃/min升溫至70℃，再以20℃/min升溫至250℃，保溫10min；氣化室200℃；Rt≈3.75min）。

1.2.4 數(shù) 據(jù) 處 理 所 得 實(shí) 驗(yàn) 結(jié) 果 在 Logistic 以 及Luedeking-Piret方 程 基 礎(chǔ) 上 ，建 立 α - 蒎 烯 產(chǎn) 生 菌YJM28發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物形成、底物消耗的動力學(xué)模型[6]。應(yīng)用Matlab 8.0軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，擬合模型及其相關(guān)參數(shù)，建立發(fā)酵動力學(xué)模型。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-蒎烯發(fā)酵過程代謝變化特征

圖1 YJM28生產(chǎn)α-蒎烯發(fā)酵過程曲線Fig.1 Fermentation curve of YJM for fermentation α-pinene

YJM28生產(chǎn)α-蒎烯整個發(fā)酵過程代謝變化如圖1所示。從圖1中可以看出，菌體的生長曲線呈現(xiàn)出典型的S型曲線，供試菌株的延滯期較短，菌體生長較為迅速，0～4h為菌株的延遲期，菌體生長較為緩慢，4～16h為對數(shù)生長期，菌體生長迅速，20h達(dá)到穩(wěn)定期，菌體生長趨于穩(wěn)定，菌濃增加變小，在發(fā)酵24h時菌體干重達(dá)到0.43g；發(fā)酵產(chǎn)物α-蒎烯濃度變化過程與細(xì)胞生物量變化趨勢稍有不同，α-蒎烯濃度在20h達(dá)到最大，產(chǎn)物濃度達(dá)到32.8mg/L，此后稍有下降，但是較為緩慢，仍可在較高水平維持一段時間。從菌株生長和產(chǎn)物合成曲線可以看出，細(xì)胞生長伴隨著產(chǎn)物的合成，待菌體生長達(dá)到穩(wěn)定后，產(chǎn)物合成也趨于穩(wěn)定。因此可以推測YJM28菌株生產(chǎn)α-蒎烯的發(fā)酵類型為生長部分偶聯(lián)。從限制性底物消耗曲線可知葡萄糖利用與細(xì)胞生長基本成對稱關(guān)系[7]。

2.2 動力學(xué)模型的建立

發(fā)酵動力學(xué)模型一般由3部分組成：菌體生長動力學(xué)模型、產(chǎn)物形成動力學(xué)模型、底物消耗動力學(xué)模型。按照建模方法來分，可以將動力學(xué)模型分為三類：結(jié)構(gòu)模型、半經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵约敖?jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｄ壳?，國?nèi)學(xué)者所構(gòu)建的多屬于經(jīng)驗(yàn)或者半經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。其中，半?jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒７绞捷^為簡單，易于分析，故此應(yīng)用范圍較廣。建模目的是為了實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程控制的最優(yōu)化[8]。

2.2.1 菌體生長動力學(xué)模型 描述微生物生長動力學(xué)的模型很多，以Monod方程和Logistic方程最為簡單常用[7]。前者是一種近乎理想的模型，它不考慮菌體濃度的增加對菌體生長的抑制作用，主要用來描述非抑制性單一底物限制下的細(xì)胞生長。后者作為典型的S型曲線，能夠較好地反應(yīng)發(fā)酵過程中因菌體濃度增加對自身生長造成的影響，能夠較好地?cái)M合發(fā)酵過程中的菌體生長規(guī)律。Logistic方程形式如下：

其中：μmax是最大生長速率（h-1）；X表示菌體干重（g/L）；t是發(fā)酵時間（h）。在發(fā)酵初始，當(dāng)t=0時，此時菌濃X遠(yuǎn)小于Xm，因此X/Xm項(xiàng)可以忽略不計(jì)，方程表示菌體呈指數(shù)形式生長；當(dāng)處于穩(wěn)定期，X=Xm，方程表示菌體停止生長。對式1進(jìn)行積分，可得

式（1）是YJM28菌體發(fā)酵過程中的菌體生長動力學(xué)模型表達(dá)方程，式（2）是其積分形式。

2.2.2 產(chǎn)物形成動力學(xué)模型 由于發(fā)酵產(chǎn)物形成復(fù)雜，Gaden[9]將產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長之間的關(guān)系分為3類：I類發(fā)酵，產(chǎn)物形成于細(xì)胞生長相偶聯(lián)；II類發(fā)酵，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長部分偶聯(lián)；III類發(fā)酵，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長不偶聯(lián)。為此，Luedeking和Piret[10]總結(jié)了下述公式來描述產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長的關(guān)系：

其中，α表示與菌體生長相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)，β表示與菌體量相關(guān)的產(chǎn)物生成系數(shù)。當(dāng)α≠0，β=0時表示產(chǎn)物形成與生長偶聯(lián)；當(dāng)α，β≠0時，產(chǎn)物與生長部分偶聯(lián)；α=0，β≠0時，產(chǎn)物與生長不偶聯(lián)。根據(jù)圖1可以看出，YJM28應(yīng)該屬于II類發(fā)酵，是菌體生長與產(chǎn)物合成部分偶聯(lián)，可以用Luedeking-Piret方程表示[11]。聯(lián)合式（1），（2），（3）并積分得到如下公式：

其中，P：產(chǎn)物α-蒎烯濃度（mg/L）；Po：產(chǎn)物的初始濃度（mg/L）；α：生長偶聯(lián)系數(shù)（mg·L-1）；β：生長偶聯(lián)系數(shù)（L·mg-1）。

當(dāng)Po=0，Xo對產(chǎn)物的影響忽略不計(jì)，式4可簡化為：

2.2.3 底物消耗動力學(xué)模型 根據(jù)物料守恒原理，限制性底物消耗主要用于三部分，即：菌體的生長、產(chǎn)物的合成以及維持細(xì)胞自身的代謝。由于α-蒎烯發(fā)酵過程中只有底物葡萄糖作為主要能量來源在隨著發(fā)酵時間延長被不斷消耗，因此，選擇建立在單一限制性底物基礎(chǔ)上的底物消耗動力學(xué)方程進(jìn)行底物消耗動力學(xué)模型的建立，該方程可用Luedeking-Piret-Like方程[9]定量表示：

2.3 模型參數(shù)求解

采用麥夸特算法，以誤差平方和最小為目標(biāo)，通過Matlab軟件中cftool工具箱進(jìn)行非線性擬合，獲得參數(shù)值[12]。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果獲得模型參數(shù)的初步估計(jì)值，不斷擬合，直至得到全局收斂的最優(yōu)化參數(shù)估計(jì)[13]。結(jié)果見表1。

根據(jù)表1結(jié)果，可得α-蒎烯發(fā)酵動力學(xué)模型為：

菌體生長動力學(xué)模型：

產(chǎn)物合成動力學(xué)模型：

底物消耗動力學(xué)模型：

2.4 擬合曲線分析

為進(jìn)一步分析模型可靠性，運(yùn)用軟件得到的α-蒎烯發(fā)酵過程擬合曲線如圖2～圖4所示。圖中實(shí)線代表模型預(yù)測值，虛線則表示實(shí)驗(yàn)測試值。

由圖2～圖4可以看出，曲線擬合結(jié)果較為理想，并且從菌體生長、產(chǎn)物合成、底物消耗的實(shí)驗(yàn)測試值與模型預(yù)測值隨時間變化曲線上看，兩者比較接近，經(jīng)過計(jì)算，誤差都在5%之內(nèi)，表明動力學(xué)模型選擇正確，模型擬合良好，能夠真實(shí)的反映α-蒎烯的發(fā)酵過程。

圖2 α-蒎烯分批發(fā)酵細(xì)胞生長實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值的比較Fig.2 Comparison of the predicted data with experimental data on biomass growth

圖3 產(chǎn)物形成模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值比較Fig.3 Comparison of the predicted data with experimental data on alpha-pinene yield

圖4 底物消耗模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值比較Fig.4 Comparison of the predicted data with experimental data on substrate consumption

表1 發(fā)酵動力學(xué)模型估計(jì)值Table 1 Estimated values of kinetics model of fermentation

3 結(jié)論與討論

由于微生物發(fā)酵整個過程包含有許多因素，例如生長、繁殖、維持、死亡、溶胞等，因此工程上的理論在應(yīng)用之前要進(jìn)行合理的簡化，也就是說需要采用特定的模型來描述[14]。在分批發(fā)酵過程當(dāng)中，一般采用均衡生長的非結(jié)構(gòu)模型，即菌體細(xì)胞隨著生長時間的延長，胞內(nèi)各組分以相同比例增加，不考慮外界環(huán)境對菌體組成的影響[15]。本實(shí)驗(yàn)建立的各種模型就是基于以上假設(shè)而定。

本實(shí)驗(yàn)對重組大腸桿菌YJM28的菌體生長、α-蒎烯合成以及基質(zhì)消耗的動力學(xué)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，構(gòu)建的模型基本真實(shí)的反映了菌體發(fā)酵的過程變化，尤其是菌體生長的模型擬合較好。在發(fā)酵前期，產(chǎn)物合成以及底物消耗的模擬值與實(shí)驗(yàn)值有較小的偏差。推測可能是實(shí)驗(yàn)條件所限，由于產(chǎn)物是氣體形式存在于厭氧搖瓶發(fā)酵尾氣當(dāng)中，發(fā)酵過程中不追加葡萄糖，初始葡萄糖濃度較低以保持菌體在生長的初期生長速率不能過快，造成后期在誘導(dǎo)階段菌體產(chǎn)物合成能力下降[16]。因此，在描述α-蒎烯產(chǎn)生時不能單純的只考慮細(xì)胞生物量，還必須考慮以上諸因素的影響，才能不斷的修正所建立的動力學(xué)模型使之能更真實(shí)的描述發(fā)酵過程。

利用麥夸特算法，以誤差平方最小為目標(biāo)，通過Matlab軟件中cftool工具箱進(jìn)行非線性擬合，可以獲得待解參數(shù)。根據(jù)發(fā)酵結(jié)果獲得模型參數(shù)的初步估計(jì)值，經(jīng)過不斷擬合直至得到全局收斂的最優(yōu)化參數(shù)估計(jì)，通過非線性擬合求解得到參數(shù)數(shù)值。而且從菌體生長、產(chǎn)物合成以及底物消耗與時間關(guān)系曲線上看，動力學(xué)模型選擇正確，擬合效果良好，較真實(shí)的反映了α-蒎烯的發(fā)酵全過程。

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Kinetic models for alpha-pinene fermentation

REN Meng1，2，GAO Guo-fu1，*，XIAN Mo2，YANG Jian-ming2，*
（1.School of Life and Sciences，Nan Jing Agricultural University，Nanjing 210095，China；2.CAS Key Laboratory of Bio-based Material，Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology，Chinese Academy of Sciences，Qingdao 266101，China）

The dynamic models for alpha-pinene fermentation by Escherichia coli were studied.The kinetic models for cell growth ， alpha-pinene production and substrate consumption were proposed with Logistic equation ， Luedeking-Piret equation and Luedeking-Piret-Like equation though the optimal parameters estimation and nonlinear least-squares fitting method.The observed and estimated values of the models were in a good agreement， the result showed that the models could provide a reasonable description for the fermentation process of alpha-pinene.

α-pinene；fermentation kinetic model；fit.

Q851

A

1002-0306（2014）20-0196-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.034

2014－01－15

任萌（1988-），男，碩士研究生，研究方向：生物活性物質(zhì)資源。

* 通訊作者：高國富（1963-），男，副教授，研究方向：生物活性物質(zhì)資源。楊建明（1977-），男，副研究員，研究方向：生物催化。

國家自然科學(xué)基金（21206185，21376255）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（SS2013AA050703-2）；國家科技支撐計(jì)劃重大項(xiàng)目（2012BAD32B06-2）。