丁志剛，高紅梅，潘冬梅

（安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100）

復(fù)合酶法水解小麥面筋蛋白的研究

丁志剛，高紅梅，潘冬梅

（安徽科技學(xué)院，安徽鳳陽(yáng) 233100）

小麥面筋蛋白由于其溶解性較差，限制了其應(yīng)用，實(shí)驗(yàn)利用酶法水解能有效提高小麥面筋蛋白的溶解度。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了堿性蛋白酶與中性蛋白酶復(fù)合水解小麥面筋蛋白的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：復(fù)合酶配比（堿性蛋白酶∶中性蛋白酶）為5∶5，水解溫度為55℃，復(fù)合酶濃度為1.0%，底物濃度為5%，水解初始pH為8.0，水解時(shí)間為3.5h時(shí)面筋蛋白的水解度最高，水解度可達(dá)14.6%。

面筋蛋白，復(fù)合酶，水解，水解度

小麥面筋蛋白又稱谷朊粉，含有75%以上的蛋白質(zhì)，其蛋白構(gòu)成主要為谷蛋白和醇溶蛋白[1]。谷蛋白富含谷氨酰胺（Gln）和胱氨酸（Cys），是由多肽鏈通過(guò)分子間二硫鍵連接而成的蛋白；麥醇溶蛋白只含有分子內(nèi)二硫鍵。谷朊粉吸水后所形成的濕面筋具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而使其具有優(yōu)良的延伸性、成膜性、黏彈性、熱凝固性等，在食品工業(yè)中具有廣泛用途。谷朊粉蛋白質(zhì)含量非常高，氨基酸也較為均衡，但因缺乏賴氨酸而使其生物價(jià)較低?？赏ㄟ^(guò)與富含賴氨酸的動(dòng)物性蛋白混合食用，從而使各必需氨基酸構(gòu)成均衡，以達(dá)到蛋白互補(bǔ)的目的。谷朊粉中還含有較高的鈣、磷、鐵等礦物質(zhì)，特別是鈣含量遠(yuǎn)高于雞蛋、牛肉等動(dòng)物性食品，能夠很好地滿足人們對(duì)健康飲食的需求。隨著對(duì)小麥面筋蛋白功能特性等應(yīng)用的拓展，小麥面筋蛋白的低溶解性，一直是科學(xué)家們亟待解決的難題。據(jù)研究，小麥面筋蛋白的發(fā)泡性、凝膠形成性、水合性、分散性和乳化性等各種功能性質(zhì)的發(fā)揮都與其溶解性密切相關(guān)[2-4]。我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，小麥資源豐富，但是對(duì)小麥面筋蛋白產(chǎn)品的開發(fā)利用率卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于西方發(fā)達(dá)國(guó)家。因此，對(duì)小麥面筋蛋白溶解性進(jìn)行深入的研究，找出能高效增加面筋蛋白溶解度的方法是很有必要的。

本文采用復(fù)合酶水解法，即利用堿性蛋白酶和中性蛋白酶按照一定的比例，在適宜水解條件下進(jìn)行面筋蛋白的水解，旨在探究復(fù)合酶法水解小麥面筋蛋白對(duì)其溶解度的影響，為研究面筋蛋白的溶解性、拓展其應(yīng)用范圍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

谷朊粉 徐州得隆生物科技有限公司提供；中性蛋白酶 BR，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司（酶活60000U/g）；堿性蛋白酶 BR，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司（酶活200000U/g）；其他分析類試劑 均為分析純。

pHS-3D精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；79-1磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司。

1.2 水解方法研究

1.2.1 谷朊粉的預(yù)處理 堿處理法[5]：預(yù)先配制好濃度為0.01mol/L的NaOH溶液，按照一定的量，將谷朊粉分散在配制好的NaOH溶液中，配制成蛋白質(zhì)濃度為5%的懸濁液，然后，調(diào)整懸濁液溫度為60℃，并采用磁力攪拌的方法，持續(xù)攪拌30min，備用。

1.2.2 谷朊粉酶法水解工藝 將經(jīng)預(yù)處理后的小麥面筋蛋白用1mol/L NaOH溶液（或HCl溶液）調(diào)節(jié)pH至所需值，然后加入一定量的酶進(jìn)行水解反應(yīng)，在反應(yīng)過(guò)程中連續(xù)測(cè)定反應(yīng)液的pH，并以0.1mol/L NaOH溶液維持反應(yīng)液的pH恒定，采用pH-Stat法測(cè)定水解度變化。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液在100℃水浴條件下滅酶活5min，對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

1.2.3 復(fù)合酶水解效果 在進(jìn)行復(fù)合酶水解面筋蛋白實(shí)驗(yàn)之前，查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料得堿性蛋白酶和中性蛋白酶的最佳水解工藝條件[6-8]。實(shí)驗(yàn)條件為底物濃度5%，酶濃度（E/S）1%，初始pH、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度，依據(jù)兩種酶的最優(yōu)作用條件設(shè)置。測(cè)定堿性蛋白酶和中性蛋白酶單獨(dú)水解小麥面筋蛋白時(shí)的水解度，為使用復(fù)合酶水解提供有利數(shù)據(jù)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 依據(jù)酶學(xué)原理及相關(guān)資料選擇復(fù)合酶使用配比（5∶1、5∶2、5∶3、5∶4、5∶5）、水解反應(yīng)進(jìn)行時(shí)間（2.5、3.0、3.5、4.0、4.5h）、反應(yīng)溫度（40、45、50、55、60℃）、復(fù)合酶的濃度（0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%）、面筋蛋白底物液濃度（3%、4%、5%、6%、7%）、反應(yīng)初始pH（7.5、8.0、8.5、9.0）6個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，找出各因素的最佳作用范圍。進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)擬定基礎(chǔ)條件：復(fù)合酶配比為5∶4、酶濃度為1.0%、反應(yīng)時(shí)間為3.5h、反應(yīng)溫度為55℃、底物濃度為5%、反應(yīng)初始pH為8.0，在研究相關(guān)單因素時(shí)只改變此因素水平值，其他因素按基礎(chǔ)條件值固定不變，在研究下一單因素時(shí)，已研究的單因素取最優(yōu)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析總結(jié)的基礎(chǔ)上，選擇在復(fù)合酶水解面筋蛋白過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大的四個(gè)因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，對(duì)實(shí)驗(yàn)工藝條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，使復(fù)合酶水解面筋蛋白能得到較好的結(jié)果。正交設(shè)計(jì)因素水平如表1所示。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.6 指標(biāo)測(cè)定 水解度的測(cè)定：采用pH-Stat法測(cè)定試樣水解度[9]。水解開始時(shí)，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系到蛋白酶最適pH，反應(yīng)過(guò)程中用濃度為0.1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH并使其保持恒定，記錄所使用的堿液量，計(jì)算水解度DH：

式中：V—NaOH的體積，mL；C—NaOH的濃度，mol/L；α—水解系數(shù)，表示α氨基的平均解離度；M—蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；8.38—每1g原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)；本實(shí)驗(yàn)中pKa=7，C=0.1mol/L；α=10pH-pKa/（1+10pH-pKa）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用 SPSS13軟件進(jìn)行顯著性分析（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 兩種蛋白酶各自最佳水解條件 實(shí)驗(yàn)前采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法分別測(cè)定選用堿性蛋白酶及中性蛋白酶的酶活。堿性蛋白酶活力為182000U/g；中性蛋白酶活力為63000U/g。

依據(jù)所用蛋白酶試劑說(shuō)明分別選取其最適作用條件，測(cè)定在此條件下各種酶單獨(dú)作用對(duì)小麥面筋蛋白的水解程度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄見表2。由表2中數(shù)據(jù)可知，堿性蛋白酶在水解面筋蛋白時(shí)，當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件采用1.0%的酶濃度、5%的面筋蛋白底物濃度、初始pH為9.0，溫度為60℃時(shí)，所測(cè)得的水解度為13.5%左右；中性蛋白酶的水解度則相對(duì)較低，為7.3%。

由于面筋蛋白的低溶解性，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，增大反應(yīng)前面筋蛋白的溶解度對(duì)酶解反應(yīng)有很大影響。為后續(xù)操作實(shí)驗(yàn)方便，本實(shí)驗(yàn)中蛋白酶的添加量在測(cè)定了酶活的基礎(chǔ)上按酶與底物質(zhì)量百分比進(jìn)行添加（后續(xù)不再說(shuō)明）。

圖1 復(fù)合酶配比對(duì)水解度的影響Fig.1 Composite enzyme proportion on the influence of the degree of hydrolysis

表2 兩種蛋白酶單獨(dú)水解面筋蛋白的條件及結(jié)果Table 2 Two protease hydrolysis wheat gluten protein alone the condition and result

2.1.2 復(fù)合酶配比對(duì)面筋蛋白水解度的影響 依據(jù)方法1.2.4條件進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，研究中性蛋白酶與堿性蛋白酶質(zhì)量比對(duì)面筋蛋白水解度的影響，其結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，復(fù)合酶法水解小麥面筋蛋白的水解度隨著復(fù)合酶的配比的變小而逐漸增大，當(dāng)復(fù)合酶配比為5∶4時(shí)，水解度達(dá)到最大。由此可得，在水解過(guò)程中，堿性蛋白酶起主要作用，堿性蛋白酶的使用量的大小對(duì)水解過(guò)程影響較大。依據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定復(fù)合酶的最佳配比為5∶4。

2.1.3 溫度對(duì)面筋蛋白水解度的影響 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酶解條件參照方法1.2.4，以水解度為指標(biāo)，反應(yīng)溫度分別取40、45、50、55、60℃，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對(duì)水解度的影響Fig.2 Temperature on the influence of the degree of hydrolysis

由圖2可知，隨反應(yīng)溫度的增加，面筋蛋白的水解度也隨之增加，當(dāng)溫度達(dá)到55℃時(shí)，水解度達(dá)到最大值，之后，隨著溫度繼續(xù)上升，水解度反而有所減小。出現(xiàn)這樣結(jié)果的原因?yàn)樵谑褂脧?fù)合酶法水解小麥面筋蛋白時(shí)，堿性蛋白酶和中性蛋白酶都有其最適宜的酶活溫度范圍。其中，堿性蛋白酶的最適溫度為60℃左右[13]，中性蛋白酶的最適水解溫度為50℃左右[11]。當(dāng)溫度高過(guò)一定范圍時(shí)，酶分子的空間結(jié)構(gòu)會(huì)因?yàn)榉肿幽芰康脑龃蠖l(fā)生變化，酶的活性會(huì)減弱甚至喪失。因此，確定復(fù)合酶的最佳水解溫度為55℃。

2.1.4 復(fù)合酶濃度對(duì)面筋蛋白水解度的影響 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酶解條件參照方法1.2.4，以水解度為指標(biāo)，復(fù)合酶濃度分別取0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著復(fù)合酶濃度的增大，面筋蛋白的水解度先呈上升狀態(tài)，復(fù)合酶用量的增加可以提高反應(yīng)過(guò)程中酶與底物接合的幾率，從而能有效增加面筋蛋白的水解度。當(dāng)復(fù)合酶濃度為1%（E/S）時(shí)，再繼續(xù)增大濃度，水解度上升趨勢(shì)基本保持穩(wěn)定，數(shù)據(jù)變化很小。這是因?yàn)楫?dāng)復(fù)合酶的用量過(guò)大時(shí)，會(huì)在一定程度上干擾酶解物的組成[10]，而且，酶用量的增大會(huì)大大增加成本。另外，由于蛋白酶自身特殊的感官性狀，帶有很強(qiáng)的臭味。所以，在水解小麥面筋蛋白時(shí)，在保證一定水解度的情況下，蛋白酶的使用量也應(yīng)該盡量少一點(diǎn)，防止水解后的多肽物質(zhì)帶有不良?xì)馕?，影響產(chǎn)品的感官評(píng)價(jià)。因此，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定復(fù)合酶的使用1%（E/S）量時(shí)效果最佳。

2.1.5 底物濃度對(duì)面筋蛋白水解度的影響 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酶解條件參照方法1.2.4，以水解度為指標(biāo)，底物濃度為變量，結(jié)果如圖4所示。

圖3 復(fù)合酶濃度對(duì)水解度的影響Fig.3 Composite enzyme concentration on the influence of the degree of hydrolysis

圖4 底物濃度對(duì)水解度的影響Fig.4 Substrate concentration on the influence of the degree of hydrolysis

由圖4可知，在底物濃度小于5%時(shí)，面筋蛋白的水解度隨著底物濃度的增加而逐漸增大；當(dāng)?shù)孜餄舛壤^續(xù)增加時(shí)，水解度變化范圍較小。這是由于當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)，限制反應(yīng)的因素是底物濃度，此時(shí)酶是充足的；當(dāng)?shù)孜餄舛炔粩嘣龃蟮揭欢ㄖ禃r(shí)，加入到反應(yīng)液中的復(fù)合酶分子已全部與底物結(jié)合，因此，再增大底物濃度也無(wú)法提高面筋蛋白的水解度。而且，由于面筋蛋白難溶于水，當(dāng)濃度過(guò)大時(shí)會(huì)造成面筋蛋白分散困難[11-12]，甚至集結(jié)成團(tuán)。故確定最佳底物濃度為5%。

2.1.6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)面筋蛋白水解度的影響 參照方法1.2.4條件，以水解度為指標(biāo)，不同時(shí)間的結(jié)果如圖5所示。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)水解度的影響Fig.5 Reaction time on the influence of the degree of hydrolysis

由圖5可得，在反應(yīng)時(shí)間小于3.5h時(shí)，面筋蛋白的水解度是一直處于上升狀態(tài)的，當(dāng)達(dá)到3.5h時(shí)水解度達(dá)到最大。故確定最佳水解時(shí)間為3.5h。

2.1.7 反應(yīng)初始pH對(duì)面筋蛋白水解度的影響 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中酶解條件參照方法1.2.4，以水解度為指標(biāo)，反應(yīng)初始pH分別設(shè)計(jì)為7.5、8.0、8.5、9.0，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6 反應(yīng)初始pH 對(duì)水解度的影響Fig.6 Reaction initial pH of the influence of the degree of hydrolysis

由圖6可知，面筋蛋白水解度的隨反應(yīng)液初始pH的變化趨勢(shì)是先增大后減小。當(dāng)pH在8.0附近時(shí)水解度達(dá)到最大值。隨反應(yīng)液初始pH繼續(xù)增大時(shí)，水解度降低。這是因?yàn)?，蛋白酶有其最適的pH范圍，當(dāng)pH過(guò)大時(shí)已有部分中性蛋白酶發(fā)生變性，從而降低了復(fù)合酶的活性，影響水解度的大小。故確定最佳水解液初始pH為8.0。

2.2 復(fù)合酶法水解小麥面筋蛋白正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)面筋蛋白水解度影響較大的4個(gè)因素，設(shè)計(jì)4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)，依據(jù)正交實(shí)驗(yàn)組合進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表3所示，分析結(jié)果如表4所示。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析表Table 3 Orthogonal test results and analysis table

表4 正交實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷娘@著性分析表Table 4 Orthogonal experimental model significance analysis sheet

由表4可知，模型的F值為78.16，p值為0.0127，大于在0.05水平上的F值，由此可知，模型有效，此次評(píng)定的結(jié)果是可靠的。比較F值大?。篎A＞FB＞FC，F(xiàn)值越大，影響作用越大，各因素對(duì)結(jié)果的影響程度大小的次序?yàn)锳＞B＞C＞D。由表3極差分析結(jié)果可得面筋蛋白水解度最高的最優(yōu)組合是A2B2C3D2，由于該組合實(shí)驗(yàn)在正交表中并未出現(xiàn)，因此進(jìn)行了相應(yīng)的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表5所示。

表5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of verification test

由表5可知，理論最優(yōu)組合條件下，面筋蛋白的水解度最高為14.6%，故A2B2C3D2為最優(yōu)組合條件。

3 結(jié)論

以水解度為指標(biāo)，通過(guò)研究復(fù)合酶法水解谷朊粉的工藝，經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究得在采用酶配比（堿性蛋白酶∶中性蛋白酶）為5∶5，水解溫度為55℃，復(fù)合酶濃度（E/S）為1.0%，底物濃度為5%，水解初始pH為8.0，水解時(shí)間為3.5h時(shí)面筋蛋白的水解度最高，可達(dá)14.6%。

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表6 長(zhǎng)江刀鱭、黃河刀鱭與東海刀鱭肉核苷酸及味精當(dāng)量TAVsTable 6 Comparison of TAVs of nucleotides and EUC in Yangtze River，Yellow River and Seawater Coilia ectenes Jordan cooked meat

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)比長(zhǎng)江刀鱭和黃河刀鱭這兩種洄游刀鱭與海水刀鱭的滋味成分差異，我們發(fā)現(xiàn)刀鱭的洄游使得其體內(nèi)的無(wú)機(jī)離子含量下降，同時(shí)ATP分解產(chǎn)物的不斷積累，這些呈味核苷酸使刀鱭的滋味更為鮮美，導(dǎo)致了兩種洄游刀鱭與東海刀鱭的滋味產(chǎn)生差異。三種刀鱭的味精當(dāng)量值均遠(yuǎn)高于閾值，這可能是刀鱭味道鮮美的原因之一，長(zhǎng)江刀鱭和黃河刀鱭味精當(dāng)量的滋味強(qiáng)度值均高于東海刀鱭，表明洄游的刀鱭更為鮮美。

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Study on hydrolyze wheat gluten protein by methods of composite enzymatic

DING Zhi-gang，GAO Hong-mei，PAN Dong-mei
（Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang 233100，China）

Wheat gluten protein had a poor solubility that limited its application.Using enzyme could improve the solubility of wheat gluten protein effectively.The optimal technological conditions of hydrolysate which mixed by alkaline protease and neutral protease via were optimized single factor test and orthogonal test.The results showed that the wheat gluten protein could got the hightest degree of hydrolysis 14.6%when it undere the follow conditions ： the ratio of composite enzyme （ alkaline protease ∶neutral protease ） was 5 ∶5 ， hydrolysis temperature was 55℃ ，the concentration of compound enzyme was 1.0% ，the concentration of substrate was 5%，the initial pH of hydrolysis was 8.0，the time of hydrolysis was 3.5h.

gluten protein；composite enzyme；hydrolysis；degree of hydrolysis

TS211.2

A

1002-0306（2014）20-0191-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.033

2014－04－28

丁志剛（1978-），男，碩士研究生，副教授，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全。

安徽省教育廳科研課題（KJ2013Z043，KJ2012B060）