楊 麗，袁春龍，馬 婧，楊曉雁，張世杰

（西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100）

不同粉碎條件的葡萄籽超微粉功能性成分及抗氧化性研究

楊 麗，袁春龍*，馬 婧，楊曉雁，張世杰

（西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100）

以葡萄籽為原料，在不同的時間和溫度下對其進行超微粉碎，研究粉碎溫度和時間對葡萄籽超微粉的功能性成分含量及其抗氧化活性的影響。結(jié)果表明：粉碎時間對葡萄籽超微粉的粒徑及超微粉中的單寧、總酚含量有極顯著影響，粉碎溫度與其并無顯著相關(guān)性。在-30℃粉碎75min后，粒徑具有最小值42.916μm。單寧和總酚含量在-30℃粉碎45min時分別達到最大值0.1074g/g和0.1415g/g。超微粉碎時間對葡萄籽超微粉的DPPH自由基清除能力有顯著影響，粉碎溫度與其并無顯著相關(guān)性。在-30℃粉碎45min后，DPPH自由基清除能力達到了最大值105.715mg。ABTS方法測定的自由基清除能力與粉碎時間和溫度無顯著相關(guān)性。雖然溫度對粒徑、單寧、總酚及抗氧化性均無顯著性影響，但綜合實驗結(jié)果可知，低溫能夠有效保護葡萄籽超微粉中的多酚類物質(zhì)，增大其抗氧化能力。研究結(jié)果可為選擇合適的粉碎條件提供理論依據(jù)。

葡萄籽，超微粉，單寧，總酚，抗氧化

葡萄籽含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、氨基酸以及多酚類物質(zhì)如原花青素、白藜蘆醇等[1-2]。其中，葡萄籽多酚類物質(zhì)含量占葡萄果實總多酚的60%～70%，比葡萄皮和葡萄果肉豐富得多[3]。葡萄籽中的這些多酚類物質(zhì)表現(xiàn)出了極強的抗氧化能力，具有清除自由基、抗氧化等作用，在釀酒過程中能夠溶入酒體，影響葡萄酒的外觀顏色、口感風味，并且還能響其營養(yǎng)保健功能[4]。原花青素是葡萄籽多酚中含量最多的一種，其含量可高達95%，被證明具有較高的抗氧化活性，是提取天然抗氧化劑的優(yōu)勢資源[5-7]。超微粉碎技術(shù)是近幾年來發(fā)展非常迅速的一項高新技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于礦業(yè)、醫(yī)藥、食品等許多領(lǐng)域[8-10]。物料經(jīng)超微粉碎后，細胞破壁率高，具有良好的溶解性，分散性、吸附性及化學活性等[11-13]。有研究發(fā)現(xiàn)，將葡萄皮進行超微粉碎過后再提取，其營養(yǎng)成分和多酚的溶 出 量 能 夠 得 到 顯 著 提 高[14]，而 且 超 微 粉 處 理 也 有利于葡萄籽中原花青素的釋放和不飽和脂肪酸的保留[15]。葡萄籽經(jīng)過超微粉碎后，其破壁率一般能達到99%以上，各種營養(yǎng)成分和功能性物質(zhì)的利用率顯著提高。但是，由于超微粉碎條件不同，葡萄籽細胞破 壁 率 也 會 有 所 差 異[16]，也 會 使 超 微 粉 的 功 能 性 成分及抗氧化性活性受到影響。本文分別在不同的粉碎時間和溫度下對葡萄籽進行超微粉碎，并對超微粉中的總酚、單寧及抗氧化性進行分析，研究不同溫度、時間對其的影響，對于確定最佳的處理工藝有指導意義。此外，超微粉碎保證葡萄籽中有效成分充分釋放的同時提高粉碎效率，降低能源消耗，增加企業(yè)生產(chǎn)效益。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

赤霞珠葡萄籽 Cabernet Sauvignon，2010年：中信國安酒業(yè)新疆石河子西域酒業(yè)分公司，自然風干，保存貯藏良好。

6B-I 型貝利超微粉碎機 濟南倍力粉體技術(shù)有限公司；Mastersizer 2000E型激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；SP-2102UV型紫外-可見光分光光度計 上海光譜儀器有限公司生產(chǎn)；101型干燥箱 上海醫(yī)用儀表廠等。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄籽超微粉的制備 赤霞珠葡萄籽挑選除雜后，用15%的NaCl溶液清洗，然后放入101型干燥箱，于45～55℃，干燥72h；取350g葡萄籽與5%的微晶纖維素鈉混勻物，然后進行冷凍粉碎；按照表1設(shè)定粉碎溫度和時間進行粉碎。

表1 粉碎時間、粉碎溫度分組命名Table 1 Named group of milling time and temperature

1.2.2 粒徑分布的測量方法 利用馬爾文MasterSizer 2000E激光粒度分析儀對每組樣品進行粒徑測定，導出數(shù)據(jù)。本實驗中，MasterSizer 2000E預先設(shè)置成三組平行樣品粒徑測試，每組樣品在三組平行實驗后自動得出平均值，處理數(shù)據(jù)以此平均值為主。

1.2.3 各處理功能性成分的提取和測定

1.2.3.1 功能性成分的提取 將0.4g的葡萄籽超微粉倒入50mL的離心管中，加入20mL 70%丙酮，旋緊蓋子，在100r/min、20℃條件下過夜浸提，12h后，在8000r/min、4℃條件下離心15min，收集提取液，然后再向離心管中加入20mL 70%丙酮二次浸提，重復上述過程。合并兩次的提取液，在38℃水浴、120r/min條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去丙酮，大約旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)25min，到負壓穩(wěn)定在0.9MPa時，說明丙酮已經(jīng)全部蒸出，然后將提取物轉(zhuǎn)移到試管中，用去離子水定容到20mL， -20℃冷凍保存直到用作分析。

1.2.3.2 葡 萄 籽 超 微 粉 總 酚 的 測 定 根 據(jù) James Harbertson 等[17]的 方 法 進 行 適 當 的 調(diào) 整 ，用 875μL Buffer C（50g十二烷基硫酸鈉和50mL三乙醇胺定容于1000mL）作為空白對照，分別用Buffer C將樣品稀釋1.94、2.19、2.50、2.92、3.50、4.38、5.83、8.75、17.50倍，在510nm條件下用分光光度計測定多酚背景值，接著加 入 125μL 的 三 氯 化 鐵 溶 液 室 溫 靜 止 10min，在510nm條件下讀取總多酚值。結(jié)果以（+）-兒茶素等價值表示（g/g）。

標準曲線的繪制：6.0mg兒茶素于10mL的離心管中，加入600μL無水乙醇，然后加入5.4mL的去離子水，搖勻即配成1.0mg/mL的酚母液。用2625μL Buffer C作為空白對照，分別用Buffer C將母液稀釋4.3750、5.250、6.5625、8.7500、13.1250、26.2500 倍 ，在 510nm下測定吸光值，記為A1；然后各加入375μL的FeCl3溶液（含有0.01mol/L HCl），混合均勻，室溫反應(yīng)10min，在510nm測吸光值，記為A2，單寧最終的吸光值A(chǔ)= A2-A1。標準曲線方程為：y=0.002x-0.0307（y為吸光值；x為兒茶素含量，mg/L；R2=0.9982）。

1.2.3.3 葡 萄 籽 超 微 粉 單 寧 的 測 定 根 據(jù) James Harbertson 等[17]的 方 法 進 行 適 當 的 調(diào) 整 ，用 500μL Buffer B作為第一組，其余分別用Buffer B將樣品稀釋1.11、1.25、1.43、1.67、2.00、2.50、3.33、5.00、10.00倍 ，加 入3mL的 蛋 白 緩 沖 液 ，室 溫 反 應(yīng) 15min，在13500r/min條件下離心5min，結(jié)束之后去掉所有上清液。然后加入875μL Buffer C室溫反應(yīng)10min，接著渦旋振蕩10min。把樣品倒入比色皿，在510nm條件下讀數(shù)，用875μL Buffer C作為空白對照，標定單寧背景值。加入125μL的三氯化鐵后室溫反應(yīng)10min，在510nm下讀取單寧值。結(jié)果以（+）-兒茶素等價值表示（g/g）。標準曲線的繪制參照上述1.2.3，標準曲線方程與1.2.1相同。

1.2.4 自由基清除能力的測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除能力 參照Brandwilliams等[18]的方法進行測定，繪制標準曲線。1g葡萄籽超微粉的DPPH自由基清除能力以達到相同自由基清除能力所需Trolox的量TEAC（trolox equivalent antioxidant capacity）表示。利用SAS（Statistical Analysis System）得標準曲線為：y=0.1166x-0.0002（y為DPPH自由基清除率；x為Trolox濃度，mmol/L；R2=0.9983）。

1.2.4.2 ABTS+自由基清除能力 參照Re等[19]的方法進行測定，繪制標準曲線。1g葡萄籽超微粉的ABTS+自由基清除能力以達到相同自由基清除能力所需Trolox的量TEAC表示。標準曲線為：y=0.1382x+0.0004，R2=0.9993。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel2003、SAS V8等數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同粉碎時間、溫度對葡萄籽超微粉粒徑的影響

本實驗中葡萄籽的粉碎效果以平均粒徑D（0.5）（表示粒度累積分布中50%所對應(yīng)的直徑）來進行評價[20]。

圖1 不同處理的D（0.5）變化Fig.1 The changes of D（0.5）of different conditions

由圖1可知，當粉碎溫度為-15℃和-25℃時，葡萄籽超微粉 D（0.5）值呈逐漸降低趨勢，在75min時，有最小D（0.5）值51.5和43.4μm；在-20℃粉碎時，D（0.5）先是逐漸減小，隨后在粉碎60min時有所增大，然后繼續(xù)減小，同-15℃一樣，當粉碎時間達到75min 時 ，有 最 小 D（0.5）值43.4μm；當 粉 碎 溫 度 為-30℃時，D（0.5）先是逐漸減小，在45min時，其D（0.5）顯著大于30min，隨后繼續(xù)減小，在75min時有最小D（0.5）值42.9μm。

粉碎時間為15min和30min時，隨著粉碎溫度的降低，D（0.5）先增大后顯著減小，在-30℃時都有最小的D（0.5）值，分別為58.3μm和50.0μm；粉碎時間為45min和60min時，D（0.5）值逐漸變小，變化顯著，均在-30℃時，達到最小D（0.5）值51.3μm和45.6μm；粉碎時間為75min時，D（0.5）先顯著減小，隨后保持穩(wěn)定，無顯著性差異，在-30℃時有最小值42.9μm。

不同處理條件下，變化過程有所差異，但從總體趨勢來看，當粉碎溫度恒定時，隨著粉碎時間的延長，D（0.5）值呈逐漸降低趨勢，變化顯著。并且，由相關(guān)性分析得出，粉碎時間與粒徑之間的相關(guān)系數(shù)為-0.87191（p＜0.01），達到極顯著水平。因此，粉碎時間越長，葡萄籽超微粉的粒徑越小。當粉碎時間恒定時，隨著粉碎溫度的降低，D（0.5）值呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但粉碎溫度與粒徑之間的相關(guān)系數(shù)為0.3253（p=0.1617＞0.05），未達到顯著水平，說明粉碎溫度與粒徑無顯著性差異。范毅強等[21]研究得出，低溫下進行葡萄皮超微粉碎，粉碎后的產(chǎn)品質(zhì)量更穩(wěn)定，并且有更好的流動性。故而適時的降低溫度，也會有助于粒徑的減小。

2.2 不同粉碎時間、溫度對葡萄籽超微粉單寧含量的影響

葡萄籽中含有大量的多酚類物質(zhì)，能占葡萄果實酚類的50%～70%。其中，單寧（原花青素）是主要多酚類物質(zhì)的一種。單寧是能與蛋白質(zhì)形成復合物的植物多酚類物質(zhì)，因此，充分利用這一化學特性，通過間接方式可以檢測出葡萄籽中單寧的含量[17]。

從圖2可以看出，當粉碎溫度恒定時，隨著粉碎時間的延長，單寧含量逐漸降低，當粉碎溫度為-30℃，粉碎時間達到45min時，單寧含量達到了最大值0.1074g/g；當粉碎時間為15min時，單寧含量呈現(xiàn)降低趨勢，有可能是由于粉碎粒度不均勻，溫度越低，不均衡度越大，從而導致出現(xiàn)相反的趨勢。此外，單寧與蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀反應(yīng)是疏水鍵和氫鍵之間的協(xié)同作用所產(chǎn)生的[22]，這些因素共同作用，導致單寧含量的降低。其他處理條件下，單寧含量均是隨著溫度的降低而逐漸升高，30、45、60min的變化都有顯著性差異，其中45min極為顯著。

圖2 不同處理葡萄籽超微粉中的單寧含量Fig.2 Tannin content of different conditions

由相關(guān)分析可知，粉碎溫度與單寧含量之間的相 關(guān) 系 數(shù) 為-0.15011（p=0.5276＞0.05），未 達 到 顯 著水平，說明粉碎溫度與單寧含量之間的相關(guān)性較差；粉 碎 時 間 與 單 寧 含 量 的 相 關(guān) 系 數(shù) 為-0.7608 （p= 0.0002＜0.01），達到極顯著水平。由此可知，粉碎時間對超微粉中單寧的含量有顯著性影響。

2.3 不同粉碎時間、溫度對葡萄籽超微粉總酚含量的影響

圖3 不同處理葡萄籽超微粉中的總酚含量Fig.3 Total phenolic content of different conditions

圖3所示，當粉碎溫度恒定時，隨著粉碎時間的延長，總酚含量呈下降趨勢；當粉碎時間恒定時，隨著粉碎溫度的降低，總酚含量呈先降低后上升的趨勢。

在-15℃和-20℃時，總酚含量逐漸下降，但是當粉碎時間分別達45min和60min時，總酚含量逐漸趨于穩(wěn)定，最小值為0.0900、0.0844g/g；在-25℃粉碎60min后，總酚含量趨于穩(wěn)定，最小值為0.0856g/g；在-30℃時，總酚含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在45min時有最高含量0.1415g/g，隨后逐漸降低。由圖3可看出，當粉碎溫度為-30℃時，各個粉碎時間下的總酚含量都顯著高于其他溫度。在各個粉碎時間下，總酚含量均是隨著溫度的降低而先下降后顯著上升。說明低溫可以有效的保護葡萄籽中的多酚物質(zhì)。

由相關(guān)分析可知，粉碎溫度與總酚含量之間的相 關(guān) 系 數(shù) 為-0.33964（p=0.1429＞0.05），未 達到 顯 著水平，說明粉碎溫度與總酚含量之間無顯著相關(guān)性；粉碎時間與總酚含量之間的相關(guān)系數(shù)為-0.69622（p=0.0007＜0.01），達到極顯著水平，說明粉碎時間對超微粉中總酚的含量有極顯著性影響。

2.4 不同粉碎時間、溫度對葡萄籽超微粉DPPH自由基清除能力的影響

圖4 不同處理葡萄籽超微粉的DPPH自由基清除能力Fig.4 The DPPH radical scavenging activity of different condition

由圖4可知，粉碎溫度恒定時，隨著粉碎時間的延長，DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，粉碎溫度為-15、-20、-25、-30℃時，DPPH清除能力分別在45、30、30、45min達到最強清除能力88.028、92.183、91.571、105.715mg。由此可知，當粉碎溫度恒定時，粉碎時間為30～45min的自由基清除能力最好。

粉碎時間為15min和30min時，DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)出先上升后下降變化趨勢，分別在-25℃和-20℃達到最大值86.701、92.183mg；粉碎時間為45、60、75min時，DPPH清除能力先降低后升高，均在-30℃時達到最大值105.715、88.698、83.521mg。由此可看出，低溫條件下DPPH自由基清除能力顯著升高，并且在所有處理中，-30℃粉碎45min有最大值105.715mg。

由相關(guān)分析可知，粉碎溫度與DPPH自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為-0.26379（p=0.2611＞0.01），未達到顯著水平，說明粉碎溫度與DPPH自由基清除能力之間無顯著相關(guān)性；粉碎時間與DPPH自由基清除能力之間的相關(guān)系數(shù)為-0.54894（p=0.0122＜0.05），達到顯著水平，說明粉碎時間對超微粉的DPPH自由基清除能力有顯著性影響。

2.5 不同粉碎時間、溫度對葡萄籽超微粉ABTS+自由基清除能力的影響

由圖5可知，粉碎溫度為-15℃時，隨著粉碎時間的延長，ABTS+自由基清除能力逐漸降低，在75min時，達到最小值44.687mg。在-20℃和-25℃時，ABTS+自由基清除能力先升高后降低，分別在30和60min達最大值57.901和62.310mg。當粉碎溫度為-30℃時，ABTS+自由基清除能力呈逐漸上升的趨勢，在75min時有最大值52.376mg。

圖5 不同處理葡萄籽超微粉的ABTS自由基清除能力Fig.5 The ABTS radical scavenging activity of different condition

在粉碎時間為15min時，ABTS+自由基清除能力逐 漸 降 低 ，在 -15℃ 時 有 最 大 值 60.396mg；在30min時，ABTS+自由基清除能力先升高后逐漸降低，在-20℃時有最大值57.901mg；當粉碎時間分別為45、60、75min時，ABTS+自由基清除能力呈現(xiàn)先降低后升高再降低的趨勢，均分別在在-25℃時達最大值55.236、62.310、54.146mg。

由相關(guān)性分析可知，粉碎溫度與ABTS+自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)為-0.09414（p=0.6930＞0.01），未達到顯著水平，說明粉碎溫度與ABTS+自由基清除能力之間無顯著相關(guān)性；粉碎時間與ABTS+自由基清除能力之間的相關(guān)系數(shù)為-0.24641（p=0.2950＞0.01），未達到顯著水平，說明粉碎時間對超微粉的ABTS+自由基清除能力無顯著性影響。由此可知，粉碎時間、溫度對葡萄籽超微粉的ABTS+自由基清除能力無顯著性影響。

3 結(jié)論

3.1 粉碎時間對葡萄籽超微粉粒徑的影響達到了顯著水平。雖然粉碎溫度并未顯著影響粒徑大小，但結(jié)合實驗結(jié)果可知，隨著粉碎溫度的降低，粉碎時間的延長，葡萄籽超微粉粒徑呈下降趨勢，在-30℃粉碎75min時，粒徑有最小值42.9μm。

3.2 粉碎時間對葡萄籽超微粉中的單寧、總酚含量有極顯著性影響，而粉碎溫度與單寧、總酚含量并無顯著相關(guān)性。單寧和總酚含量在-30℃粉碎45min時分別達到最大值0.1074g/g和0.1415g/g。因此，隨著粉碎時間的延長，超微粉的功能性成分含量并不是一直升高，而是先升高后降低，在實際生產(chǎn)中，需要根據(jù)要求，確定合理的粉碎時間。

3.3 粉碎時間顯著影響了葡萄籽超微粉的DPPH自由基清除能力。隨著粉碎時間的延長，DPPH自由基清除能力呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢，雖然粉碎溫度與其并無顯著相關(guān)性，但相比之下，低溫更能增強葡萄籽超微粉的DPPH自由基清除能力，且在-30℃粉碎45min達到了最大值105.715mg。此外，粉碎時間、溫度與葡萄籽超微粉的ABTS+自由基清除能力均無顯著相關(guān)性。

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Study on effect of milling conditions on the functional components and antioxidant capacity of grape seeds superfine powder

YANG Li，YUAN Chun-long*，MA Jing，YANG Xiao-yan，ZHANG Shi-jie
（College of Enology，Northwest A&F University，Yangling 712100，China）

The effects of milling temperature and time on the functional components and antioxidant capacity of grape seed superfine powder was studied.Results showed that milling time had highly significant influence on the granular size，tannin and total phenolic content of grape seed powder，and the milling temperature had no significant correlation with the granular size，tannin and total phenolic content.The particle size had minimum value 42.916μm when the temperature and time was-30℃ and 75min respectively.The tannin and total phenolic contents and achieved the maximum value 0.1074g/g and 0.1415g/g at-30℃ for 45min.The milling time had significant influence on the DPPH radical scavenging capacity，and the milling temperature had no correlation with it.The DPPH radical scavenging capacity reached the maximum value 105.715mg at-30℃ for 45min.The ABTS+· radical scavenging capacity had no significant correlation with milling time and temperature.The temperature had no obviously correlation with particle size，tannin and total phenolic content，and antioxidant capacity，however the experiment result showed that the lower temperature could effectively protect the polyphenols of grape seed ultrafine powder，and increased the antioxidant capacity.

grape seeds；superfine powder；tannin；total phenolic；antioxidant capacity

TS262.6

A

1002-0306（2014）20-0178-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.030

2014－03－11

楊麗（1988-），女，碩士研究生，研究方向：葡萄酒化學。

* 通訊作者：袁春龍（1969-），男，博士，副教授，研究方向：葡萄酒化學及副產(chǎn)物綜合利用。

西北農(nóng)林科技大學科技創(chuàng)新項目（ZD2013017）。