王 溢，盛彩虹，袁宏麗，陳棟梁

（1.武漢天天好生物制品有限公司，湖北武漢 430090；2.湖北省肽類(lèi)物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430090）

微波輔助酶解前處理對(duì)魚(yú)鱗膠原蛋白肽粉品質(zhì)的影響

王 溢，盛彩虹，袁宏麗，陳棟梁

（1.武漢天天好生物制品有限公司，湖北武漢 430090；2.湖北省肽類(lèi)物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430090）

為了在兼顧成本的情況下制取較高品質(zhì)的膠原蛋白肽粉，采用微波輔助水提法作為酶解前處理魚(yú)鱗的方式，并酶解制取魚(yú)鱗膠原蛋白低聚肽粉。經(jīng)對(duì)微波輔助水提法與無(wú)微波輔助水提法制取的膠原蛋白肽粉的得率及品質(zhì)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，魚(yú)鱗在功率為10kW的微波干燥機(jī)中處理15s的條件下，膠原蛋白肽粉收率最高達(dá)57.8%，分子量小于1000u的膠原蛋白肽比例占87.84%，感官值為9，均高于非微波處理?xiàng)l件下制取的膠原蛋白肽；但是在此條件下，澄清度未表現(xiàn)出明顯的差異性。

微波，魚(yú)鱗，膠原蛋白低聚肽粉，得率，品質(zhì)

近年來(lái)，隨著我國(guó)漁業(yè)的生產(chǎn)發(fā)展迅猛，在魚(yú)類(lèi)加工過(guò)程中產(chǎn)生了大量魚(yú)鱗下角料[1-2]。而魚(yú)鱗中含有豐富的膠原蛋白[3]，經(jīng)酶作用后得到由許多分子鏈長(zhǎng)度不等的膠原蛋白低聚肽。膠原蛋白肽因其具有良好的乳化性、膠凝性、成膜性和增稠性等功能特性及特殊的生理活性，已廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)療、保健及美容等行業(yè)[4]，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

自海洋魚(yú)低聚肽粉GB/T 22729-2008及淡水魚(yú)膠原肽行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10634-2011出臺(tái)以來(lái)，魚(yú)膠原肽整個(gè)行業(yè)得到了飛速的發(fā)展，膠原肽的品質(zhì)也成為了行業(yè)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)的法寶，高收率、高品質(zhì)的膠原蛋白肽粉制取工藝成為了人們研究的熱點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上魚(yú)鱗膠原蛋白肽的產(chǎn)業(yè)化基本上都是以酶解法作為主要的制備手段，其中主要的工藝路線：魚(yú)鱗脫灰→酶解前處理→酶解→酶解后處理→膠原蛋白肽粉成品，整個(gè)工藝中魚(yú)鱗脫灰、酶解及酶解后處理等工藝在行業(yè)內(nèi)已基本成為通式；因此，魚(yú)鱗不同的酶解前處理方法將成為整個(gè)工藝中的決定性環(huán)節(jié)，它將對(duì)魚(yú)鱗膠原蛋白肽粉的得率及品質(zhì)產(chǎn)生重要的作用。鑒于微波提取技術(shù)在蛋白質(zhì)提取中已有諸多應(yīng)用，利用微波處理提高蛋白質(zhì)得率的優(yōu)越性已在許多研究結(jié)果中得到支持[5-6]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取羅非魚(yú)魚(yú)鱗為原料，采用微波輔助水提法作為酶解前處理魚(yú)鱗的方式酶解制取膠原蛋白多肽粉，并通過(guò)對(duì)微波輔助水提法與無(wú)微波輔助水提法制取的膠原蛋白低聚肽粉的收率、分子量、透光率、感官品質(zhì)4個(gè)因素進(jìn)行分析，初步為微波輔助水提法規(guī)?；迫「咂焚|(zhì)的魚(yú)鱗膠原蛋白肽奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅非魚(yú)魚(yú)鱗 取自漢南農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；堿性蛋白酶Alcalase 3.0T（酶活：3.0AU/g） 諾維信酶制劑有限公司；三氟乙酸、乙腈 美國(guó)TEDIA公司，色譜純；活性炭 溫縣偉業(yè)活性炭廠；細(xì)胞色素C（MW：1258u）、桿菌肽（1423u）、四肽甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（451u）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（189u） 美國(guó)SIGMA公司；其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；分析天平（感量0.0001g） 沈陽(yáng)龍騰電子有限公司；COWB-SD型微波干燥殺菌設(shè)備 江陰辰歐微波能系統(tǒng)設(shè)備有限公司；LPG型高速離心噴霧干燥機(jī) 常州市博大制粒干燥設(shè)備有限公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 優(yōu)尼科（上海）儀器有限公司；Agilent 1100型液相色譜儀 美國(guó)Agilent公司，配有GPC數(shù)據(jù)處理軟件的色譜工作站、流動(dòng)相真空抽濾脫氣裝置；其他常規(guī)儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)鱗的脫脂脫灰處理 將新鮮的魚(yú)鱗用清水洗凈，0.1mol/L NaOH浸泡24h[7]，用水反復(fù)洗至中性。然后用0.6mol/L HCl浸泡24h，用水反復(fù)洗至中性，36℃干燥后儲(chǔ)存?zhèn)溆肹8]。

1.2.2 脫灰魚(yú)鱗基本組成成分測(cè)定[9]水分含量測(cè)定：直接干燥法，GB/T 26626-2011；蛋白質(zhì)含量測(cè)定：半微量凱式定氮法，GB 5009.5-2010；粗脂肪含量測(cè)定：索氏提取法，GB/T 5009.6-2003；灰分測(cè)定：GB/T 5009.4-2010。

1.2.3 水提法酶解前處理 取一定重量脫脂脫灰魚(yú)鱗置于燒杯中，按照料液比1∶10的比例加入蒸餾水，在100℃下蒸煮2h，得粗提的魚(yú)鱗膠原蛋白粗提液，按1∶10的料液比補(bǔ)足水備用。

1.2.4 微波輔助處理 取一定重量脫脂脫灰魚(yú)鱗，放入COWB-SD型微波干燥機(jī)中，在功率10kW的條件下處理。將微波處理后的魚(yú)鱗置于燒杯中，按照料液比1∶10的比例加入蒸餾水，在100℃下蒸煮2h，得粗提的魚(yú)鱗膠原蛋白粗提液，然后再按1∶10的料液比補(bǔ)足水備用。

1.2.5 魚(yú)鱗膠原蛋白肽粉的制取 工藝流程：脫灰魚(yú)鱗→酶解前處理→酶解→滅酶→脫色脫味→濃縮→噴霧干燥→膠原蛋白低聚肽粉。

1.2.6 魚(yú)鱗膠原蛋白低聚肽粉收率的測(cè)定 測(cè)定公式如下：

式中：M1為酶解處理前稱(chēng)取的脫灰魚(yú)鱗重量，g；M2為相應(yīng)的膠原蛋白肽粉成品的質(zhì)量，g。

2013年1月至2015年12月我院對(duì)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)患者150例開(kāi)展了分析研究,患者臨床中都有典型的冠心病癥狀,使用各種診斷方式均確診為冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病[3-4]。全部患者共有71例女性患者和79例男性患者,患者最小是55歲,最大是86歲,平均(71.87±13.62)歲。此次我們就患者的臨床病例資料開(kāi)展了分析比較,患者對(duì)此次研究知情且同意參與。

1.2.7 魚(yú)鱗膠原蛋白低聚肽粉分子量分布的測(cè)定 選用細(xì)胞色素C（MW：1258u）、桿菌肽（1423u）、四肽甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（451u）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（189u）為標(biāo)準(zhǔn)品，膠原蛋白肽的相對(duì)分子質(zhì)量分布及所占比例采用高效凝膠過(guò)濾色譜法測(cè)定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣品組分分子體積大小的差別進(jìn)行分離，在肽鍵的紫外吸收波長(zhǎng)220nm下進(jìn)行檢測(cè)，使用凝膠色譜測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量分布的專(zhuān)用數(shù)據(jù)處理軟件，對(duì)色譜圖及數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算得到蛋白質(zhì)水解物的相對(duì)分子質(zhì)量大小及分布范圍。檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，流速為0.5mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣體積10μL，流動(dòng)相（乙腈∶水∶三氟乙酸為45∶55∶0.1），色譜柱為T(mén)SKgelG2000 SWXL 300mm× 7.8mm的凝膠柱；具體操作為：先用肽標(biāo)準(zhǔn)品制作相對(duì)分子質(zhì)量校正曲線，得到相對(duì)分子質(zhì)量矯正曲線及方程。然后稱(chēng)取樣品20.0mg于10mL容量瓶中，用流動(dòng)相定容至刻度，10kW超聲振蕩10min，使樣品充分溶解混勻，用孔徑為0.2μm，到0.5μm尼龍過(guò)濾膜過(guò)濾后，上機(jī)進(jìn)樣，在上述色譜條件下分析。然后用GPC數(shù)據(jù)處理軟件，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進(jìn)行計(jì)算，即可得到樣品中肽的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布范圍。用峰面積歸一法計(jì)算各分子量范圍相對(duì)分子質(zhì)量的多肽所占比例。

1.2.8 透射比的測(cè)定 參考QB/2732-2005；將制取的膠原蛋白肽粉按照6.67%配成水溶液，恒溫至48℃，將溶液倒入10mm比色皿，用蒸餾水作基準(zhǔn)。用分光光度法測(cè)定膠原蛋白肽水溶液在波長(zhǎng)450nm和620nm下的透射比。

1.2.9 感官鑒定方法 將噴霧干燥出來(lái)的粉末，按照10%含量進(jìn)行沖水溶解。固定10個(gè)人對(duì)水解液的顏色、氣味、口感進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，并按1～9（9表示最好，1表示最差）等級(jí)進(jìn)行分類(lèi)評(píng)比，感官鑒定值為10人評(píng)定小組的平均得分[10]。

表1 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation judgment

2 結(jié)果與分析

表2 脫灰魚(yú)鱗基本成分Table 2 The basic components of fish seales from removal of ash

2.1 脫灰魚(yú)鱗基本組成成分

將脫灰魚(yú)鱗干燥后進(jìn)行水分、灰分、蛋白含量及脂肪含量的測(cè)定結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)表明，將魚(yú)鱗進(jìn)行脫脂脫灰處理后，蛋白質(zhì)含量豐富、脂肪、灰分含量較低。魚(yú)鱗中主要含有膠原和羥基磷灰石，經(jīng)酸堿處理的魚(yú)鱗灰分含量很低，羥基磷灰石成分已經(jīng)基本被脫除，便于膠原蛋白的提取及膠原蛋白多肽粉的制取。

2.2 微波處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白肽粉得率的影響

將脫灰魚(yú)鱗置于功率為10kW的微波干燥機(jī)中進(jìn)行微波處理，處理的時(shí)間分別為0、5、10、15、20、25s幾個(gè)梯度，然后將微波處理的魚(yú)鱗通過(guò)水提法提取膠原蛋白，并酶解制取膠原蛋白肽粉，經(jīng)對(duì)膠原蛋白肽粉的收率進(jìn)行測(cè)定如圖1所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在功率為10kW的微波干燥機(jī)處理15s的條件下，魚(yú)鱗膠原蛋白低聚肽粉收率最高達(dá)57.8%，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，收率反而逐漸降低，而無(wú)微波處理的方式的制取的膠原蛋白多肽粉收率為54.3%。將微波輔助處理15s條件下的膠原蛋白低聚肽粉收率與無(wú)微波處理方式進(jìn)行對(duì)比，經(jīng)單因素顯著性分析顯示，適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚恚?0kW，15s）對(duì)膠原蛋白多肽粉的收率有提高的作用（p＜0.05）。其原因可能是由于魚(yú)鱗中的膠原蛋白主要是Ⅰ型膠原蛋白，它是由3條左手螺旋結(jié)構(gòu)的肽鏈以共價(jià)鍵、氫鍵、范德華力相互結(jié)合而形 成 右 手 超 螺 旋 結(jié) 構(gòu)[11]，水 提 法 的 熱 水 處 理 并 不 能完全使膠原穩(wěn)固的三維螺旋變得松散，而使膠原不能完全的提取出來(lái)，使得最終的酶解膠原蛋白肽粉得率相對(duì)較低。而微波能夠?qū)︳~(yú)鱗短時(shí)間的高溫處理，可能使膠原三維螺旋結(jié)構(gòu)變得疏散，這樣在水提處理的過(guò)程中膠原更容易溶解出來(lái)，使得最終得率更高，結(jié)果與張聯(lián)英利用微波提取水產(chǎn)膠原蛋白的得率較水提法的高這個(gè)現(xiàn)象相一致[6]。而隨著這種大功率微波干燥設(shè)備對(duì)魚(yú)鱗處理的時(shí)間延長(zhǎng)，高溫使魚(yú)鱗的水分迅速蒸發(fā)，魚(yú)鱗迅速被膨化乃至燒糊，損失了其中的有效蛋白成分，使得最終的膠原蛋白肽粉的得率降低。

圖1 微波處理時(shí)間對(duì)膠原蛋白肽粉得率的影響Fig.1 Effect of microwave treatment time on extraction rate of collagen peptide

以細(xì)胞色素C（MW：1258u）、桿菌肽（1423u）、四肽甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（451u）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（189u）為標(biāo)準(zhǔn)品，分別將兩種不同方式制取的膠原蛋白多肽粉分別采用高效凝膠過(guò)濾色譜法對(duì)其相對(duì)分子質(zhì)量分布及其含量進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)品的凝膠過(guò)濾色譜圖見(jiàn)圖2，兩種膠原蛋白肽凝膠過(guò)濾色譜圖的比較見(jiàn)圖3。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)樣品的凝膠過(guò)濾色譜圖Fig.2 Gel filtration chromatography map of sample

圖2中分子量大的標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間短，出峰早，其 中 出 峰 時(shí) 間 在 11.734min 的 是 桿 菌 肽（1423u）、16.714min的是細(xì)胞色素C（1258u）、18.779min的是四肽甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸（451u）、20.901min的是甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（189u）。

圖3 兩種膠原蛋白肽凝膠過(guò)濾色譜圖的比較Fig.3 Comparion of gel filtration chromatography map of two collagen peptide

圖3是兩種不同提取法制取膠原蛋白多肽粉樣品色譜圖的比較。由圖3可知，兩組樣品的出峰時(shí)間略有差異，各個(gè)組分分子量的含量所占比例也不同。由于膠原肽本身就是混合物，所以出現(xiàn)的峰比較雜，分別選取兩個(gè)樣品中五個(gè)較為突出的峰作為主要產(chǎn)物進(jìn)行研究。

用GPC數(shù)據(jù)處理軟件，將樣品的色譜數(shù)據(jù)代入校正曲線方程中進(jìn)行計(jì)算，得到樣品中肽的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布范圍，用峰面積歸一法計(jì)算各分子量范圍相對(duì)分子質(zhì)量的多肽所占比例。結(jié)果如表3所示，微波輔助粉碎法制取膠原肽的分子量較水提法小，小于1000u的比例占87.84%，在相同酶解的工藝條件下，微波輔助粉碎法制取的魚(yú)鱗膠原蛋白肽粉更易達(dá)到GB/T22729-2008所要求的小于1000u的含量不低于85%的這項(xiàng)指標(biāo)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是由于微波的溫度過(guò)高而導(dǎo)致膠原纖維變性，有的甚至斷裂，從而產(chǎn)生了更多小的肽鏈，這個(gè)和李興武利用微波在豬皮膠原的處理上結(jié)果一致[12]。另外再加上物理粉粹使得魚(yú)鱗在酶解前借助物理的作用，使大分子的膠原蛋白的酶切位點(diǎn)更多的暴露出來(lái)，從而使得在相同的時(shí)間里更容易獲得酶解度更高的小分子魚(yú)鱗膠原蛋白低聚肽。

表3 兩種膠原蛋白肽分子量分布結(jié)果Table 3 The range of molecular weight of two collagen peptide

2.4 兩種不同方式對(duì)制取膠原蛋白肽粉透光率的影響

將兩種不同方式制取的膠原蛋白肽粉按照6.67%溶解，在48℃下，分別測(cè)定在450nm和620nn波長(zhǎng)下的透射比。結(jié)果如表4所示，兩種方式所提取的膠原蛋白肽粉溶液透射比均符合淡水魚(yú)膠原肽行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10634-2011，但經(jīng)單因素顯著性分析顯示，微波輔助水提法和水提法兩種不同方式制取的膠原蛋白肽粉的透射比無(wú)明顯差異（p＞0.05）。

表4 兩種不同的膠原蛋白提取方式制取膠原蛋白肽粉的透射比Table 4 Transmittance of collagen peptide from two different ways of extraction

2.5 兩種不同方式對(duì)制取膠原蛋白肽粉感官的影響

固定10個(gè)人對(duì)兩種不同方式制取的10%膠原蛋白肽粉水溶液進(jìn)行顏色、氣味、口感的感官分析。結(jié)果表明，由水提法制取的膠原蛋白多肽粉的感官值為8，而微波輔助水提法制取的膠原蛋白多肽粉感官值為9，微波輔助水提法制取的膠原蛋白多肽水溶液基本無(wú)味，而水提法制取的則有較小的魚(yú)腥味。大量研究結(jié)果表明，水產(chǎn)品中的揮發(fā)性物質(zhì)主要包括醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、烴類(lèi)、土腥味類(lèi)物質(zhì)（多見(jiàn)于淡水水產(chǎn)品中）及少量的呋喃、硫醚、萘類(lèi)等物質(zhì)，這些化合物一起構(gòu)成了水產(chǎn)品的腥味[13]。而在本實(shí)驗(yàn)中的微波處理環(huán)節(jié)產(chǎn)生瞬間的高溫，對(duì)揮發(fā)性的腥味物質(zhì)有一定的去除的作用，所以使得最終的膠原蛋白低聚肽水溶液氣味比水提法效果好。而這個(gè)原理與Ming Zhu[14]和Steven W Lloyd等[15]用微波蒸餾萃取鯰魚(yú)中腥味物質(zhì)土臭素和二甲基異冰片的原理相一致，從而達(dá)到將腥味物質(zhì)脫離魚(yú)鱗的效果。

3 結(jié)論

微波是一種頻率在3×108～3×1011Hz間的電磁波，它加熱速度快、加熱均勻、節(jié)能高效、安全無(wú)害、易瞬時(shí)控制，而微波法萃取法是近年在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新型提取技術(shù)，具有選擇性高、萃取效率高、節(jié)約能源等優(yōu)點(diǎn)[5，16]。本實(shí)驗(yàn)分別采用微波輔助水提法和無(wú)微波水提法對(duì)脫灰羅非魚(yú)魚(yú)鱗進(jìn)行酶解前處理，并酶解制得魚(yú)鱗膠原蛋白低聚肽粉。通過(guò)對(duì)兩種不同酶解前處理方式制取膠原蛋白多肽粉的比較，結(jié)果表明，在相同酶解及后處理?xiàng)l件下，微波輔助水提法制取的魚(yú)鱗膠原蛋白多肽粉收率更高，在分子量小于1000u的低聚肽含量上更容易達(dá)到海洋魚(yú)低聚肽粉GB/T 22729-2008及淡水魚(yú)膠原肽行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10634-2011的指標(biāo)。同時(shí)，在感官評(píng)價(jià)上，微波輔助水提法制取的魚(yú)鱗膠原蛋白多肽粉在色澤和氣味上更優(yōu)，因此更有利于在工業(yè)化大生產(chǎn)中帶來(lái)良好的經(jīng)濟(jì)效益。在今后的實(shí)驗(yàn)中還可以通過(guò)不同的微波設(shè)備結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)線去作處理?xiàng)l件的優(yōu)化，以便將收率和品質(zhì)達(dá)到最優(yōu)。

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Effect of microwave assisted enzymatic hydrolysis methods on the quality of fish scale collagen peptide

WANG Yi，SHENG Cai-hong，YUAN Hong-li，CHEN Dong-liang
（1.Wuhan Tallyho Biological Products Co.，Ltd.，Wuhan 430090，China；2.Hubei Peptide Material Engineering Technology Research Center，Wuhan 430090，China）

In order to obtain high quality collagen peptide with low cost，collagen was extracted by two different methods that were microwave assisting with water extraction and without microwave water extraction ，and fish scale collagen low poly peptide was obtained by enzymolysis.The rates and qualities of collagen peptide obtained by the two methods were analyzed respectively.The results showed that the rate and quality attained utilizing 10kW microwave assisting with 15s was higher than water extraction method.The highest yield of the collagen peptide up to 57.8% ，the proportion of the collagen peptide which molecular weight were less than 1000u collagen accounted for 87.84% ，and the sensory value was 9.However，the clarity had no significant differents between the treats methods.

microwave；fish scales；collagen low poly peptide powder；yield；quality

TS254

A

1002-0306（2014）20-0170-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.20.028

2013－12－17

王溢（1986-），男，碩士研究生，研究方向：食品原料開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。