葉菡洋，金領(lǐng)微，金建，陳琰，高依依，黃文，李占園，鄭育，周志宏

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

CXC趨化因子配體16在慢性腎臟病中的表達(dá)及其意義

葉菡洋，金領(lǐng)微，金建，陳琰，高依依，黃文，李占園，鄭育，周志宏

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325027）

目的：觀察CXC趨化因子配體16（CXCL16）在慢性腎臟?。–KD）患者和CDK動(dòng)物模型中的表達(dá)情況，研究其與腎功能等因素的相關(guān)性，探討CXCL16在CKD進(jìn)展中的作用。方法：在臨床研究方面，收集200例CKD患者[按腎小球?yàn)V過(guò)率（eGFR）分為CKD 1-2期組、CKD 3-4期組和CKD 5期組]和40例健康對(duì)照組的外周血標(biāo)本，檢測(cè)血清肌酐、尿素氮、血脂、eGFR等各項(xiàng)指標(biāo)，并檢測(cè)血清中CXCL16的含量。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，取雄性C57BL/6小鼠14只，隨機(jī)分為普通對(duì)照組及普通模型組（各7只），雄性CXCL16基因敲除小鼠7只，隨機(jī)分為基因敲除對(duì)照組（3只）及基因敲除模型組（4只）。4周后處死小鼠，檢測(cè)小鼠血清尿素氮、肌酐、CXCL16等指標(biāo)，觀察腎組織病理改變。結(jié)果：健康對(duì)照組和CKD各期組患者之間年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CKD 5期組患者血清CXCL16水平高于健康對(duì)照組和CKD 1-2期組、CKD 3-4期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在校正了CKD患者的年齡、性別、BMI后，eGFR、C-反應(yīng)蛋白（CRP）和脂聯(lián)素與血漿CXCL-16獨(dú)立相關(guān)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，CXCL基因敲除模型組與普通模型組相比，其血清尿素氮、肌酐及尿酸升高幅度偏低；腎臟病理提示基因敲除模型組小鼠腎臟損傷程度輕于普通模型組。結(jié)論：隨著CKD的進(jìn)展，血漿中CXCL-16的水平顯著升高，并與腎功能的變化獨(dú)立相關(guān)。

CXC趨化因子配體16；腎疾病，慢性；腎功能不全

CXC趨化因子配體16（CXCL16）是一個(gè)跨膜分子，因其具有受體的功能而被命名為磷脂酰絲氨酸和氧化脂蛋白（ox-LDL）的清道夫受體，參與炎癥和免疫應(yīng)答過(guò)程。作為清道夫受體，CXCL16可以介導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL，形成泡沫細(xì)胞，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。作為趨化因子，它可以參與炎癥細(xì)胞的趨化及炎癥細(xì)胞間的相互作用。已有研究證實(shí)CXCL16在腎臟組織中有表達(dá)，但迄今為止對(duì)CXCL16的確切生物活性及其作用機(jī)制仍了解甚少。本研究通過(guò)觀察慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患者外周血中CXCL16的表達(dá)差異，并構(gòu)建CKD動(dòng)物模型，觀察在CXCL16基因敲除后其腎臟功能和病理改變，初步探討CXCL16在CKD中的意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 臨床研究部分

1.1.1 對(duì)象：選取2012年1月至2012年12月在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院腎內(nèi)科就診的CKD患者共200例，其中女71例，男129例。腎小球?yàn)V過(guò)率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）根據(jù)簡(jiǎn)化的腎臟病飲食公式（the simplified modification of diet in renal disease formula，MDRD公式）估算，eGFR=175×[肌酐（mg/dL）]-1.234×[年齡（歲）]-0.179×性別（男性=1，女性=0.79）。按照《慢性腎臟病及透析的臨床實(shí)踐指南》（簡(jiǎn)稱為K/DOQI指南）中CKD診斷標(biāo)準(zhǔn)將患者分為CKD 1-2期組、CKD 3-4期組和CKD 5期組。選取我院同期體檢的健康成人40例為對(duì)照組，其中男26例，女14例，其血常規(guī)、尿常規(guī)、肝腎功能、血電解質(zhì)和血脂等均處正常范圍。所有受試對(duì)象均簽署知情同意書。

1.1.2方法：①收集一般資料，如年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）以及既往病史。②空腹至少10 h后，取2.5 mL外周血標(biāo)本分離血清，按0.2 mL等分分裝，-80 ℃低溫保存。取分離的血樣品一份送本院臨床檢驗(yàn)室，日立7600全自動(dòng)儀進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)檢測(cè)，以化學(xué)試劑法測(cè)定。檢測(cè)指標(biāo)包括：白蛋白、空腹血糖、血磷、尿素氮、肌酐、尿酸、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白等。③采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定血清CXCL16、脂聯(lián)素、C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP），檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于美國(guó)R&D公司，操作步驟按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分

1.2.1 動(dòng)物：清潔級(jí)雄性10周齡C57BL/6小鼠14只，體質(zhì)量22～24 g，購(gòu)自北京唯通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（動(dòng)物合格證號(hào)：0300740），適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為普通對(duì)照組和普通模型組，各7只。10周齡雄性CXCL16基因敲除C57BL/6小鼠7只，體質(zhì)量15～17 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院贈(zèng)送，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為基因敲除模型組（n=4）和基因敲除對(duì)照組（n=3）。所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度為（23±2）℃，相對(duì)濕度為（55±2）%，房間保持通風(fēng)、安靜，定期更換墊料，清洗籠具。參考Yokozawa等[1]實(shí)驗(yàn)方法，普通模型組和基因敲除模型組予腺嘌呤混懸液灌胃（第1周和第2～第4周給藥劑量分別為250 mg/kg和125 mg/kg，均為每2 d給藥1次，上午給藥）。普通對(duì)照組、基因敲除對(duì)照組予等量蒸餾水灌胃。

1.2.2 方法：①觀察小鼠給藥期間的身體狀況及活動(dòng)情況，每天記錄攝食量及體質(zhì)量變化。②造模4周后處死小鼠，摘除小鼠眼球取血，血標(biāo)本室溫下2 000 r/min離心10 min，然后取上層血清，用日立7600全自動(dòng)儀以化學(xué)試劑法測(cè)定其中CXCL16、尿素氮、肌酐、尿酸等指標(biāo)的含量。③造模4周后解剖小鼠并取出雙側(cè)腎臟，經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋，切片厚度為3μm，采用HE染色法觀察腎組織病理變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用表示，組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布及各組間是否方差齊性分別選用單因素方差分析和非參數(shù)檢驗(yàn)。率的比較采用卡方檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用pearson相關(guān)和逐步回歸法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床研究結(jié)果

2.1.1 臨床資料比較：對(duì)照組和CKD各期患者之間年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CKD各期甘油三酯和血尿酸水平均高于對(duì)照組（P＜0.05），血漿白蛋白低于對(duì)照組，而CKD各期之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。CKD 1-4期患者與對(duì)照組比較，空腹血糖、脂聯(lián)素差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CKD各期組血CRP、肌酐、尿素氮明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），且CKD各期之間CRP、肌酐、尿素氮差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組患者一般資料和生化指標(biāo)的比較（±s）

2.1.2 各組患者血清CXCL16水平的比較：本研究顯示男性[（2.20±0.41）ng/mL，n=155]與女性[（2.18±0.53）ng/mL，n=85]之間血清CXCL16水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.93）。CKD 5期組患者血清CXCL16水平顯著高于對(duì)照組，并高于CKD 1-2期組及CKD 3-4期組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著CKD進(jìn)展，CXCL16水平逐步增加（見表1）。伴2型糖尿病CKD患者（n=68）的血清CXCL16水平為（2.28±0.63）ng/mL，非糖尿病CKD患者（n=132）的血清CXCL16水平為（2.08±0.58）ng/mL，兩者間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.023）。伴高血壓CKD患者（n=92）的血清CXCL16水平為（2.23±0.66）ng/mL，非高血壓CKD患者（n=108）的血清CXCL16水平為（2.10±0.63）ng/mL，兩者間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.138）。血清CXCL16水平在伴冠心病的CKD患者和非冠心病的CKD患者間差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.396）。但是，同時(shí)有糖尿病、高血壓和冠心病的CKD患者（n=9）血清CXCL16水平為（2.47±0.63）ng/mL，與沒(méi)有這些伴發(fā)病的CKD患者[（2.01±0.36）ng/mL，n=55]相比明顯升高（P=0.005）。

2.1.3 血清CXCL16與各臨床參數(shù)間的相關(guān)性：通過(guò)年齡、性別、BMI、高血壓和糖尿病的校正后，相關(guān)分析顯示血清CXCL16水平與血尿素氮、肌酐、尿酸、脂聯(lián)素、CRP呈正相關(guān)（分別r=0.255、0.288、0.167、0.375、0.149），與eGFR、高密度脂蛋白呈負(fù)相關(guān)（分別r=-0.255、-0.172），詳見表2。

2.1.4 逐步回歸分析 結(jié)果：在校正了CKD患者的年齡、性別、BMI后，eGFR、CRP和脂聯(lián)素與血漿CXCL16獨(dú)立相關(guān)（分別P=0.003，P＜0.001，P=0.033，見表3），而其他參數(shù)在分析后均排除了這種相關(guān)性。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 小鼠體質(zhì)量及血生化指標(biāo)變化：在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到在同一時(shí)間點(diǎn)，相較于普通對(duì)照組和基因敲除對(duì)照組，普通模型組和基因敲除模型組小鼠稍萎靡，體質(zhì)量下降，活動(dòng)量減少；普通模型組及基因敲除模型組小鼠血尿素氮、肌酐及磷較普通對(duì)照組明顯升高，提示本實(shí)驗(yàn)造模成功?；蚯贸Ｐ徒M與普通模型組相比，其血清尿素氮、肌酐及磷升高幅度偏低（見表4）。

2.2.2 各組小鼠CXCL16的表達(dá)：與普通對(duì)照組相比，普通模型組小鼠的血標(biāo)本中CXCL16表達(dá)明顯升高，而在基因敲除模型組及基因敲除對(duì)照組中，CXCL16的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到，見表4。

表2 血漿CXCL16水平與各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性

表3 逐步回歸分析血漿CXCL16水平與各項(xiàng)指標(biāo)的獨(dú)立相關(guān)性

2.2.3 各組小鼠腎臟病理光鏡下改變：HE染色結(jié)果顯示，模型組部分腎小球系膜區(qū)細(xì)胞增生，基質(zhì)增多，部分腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡變性，腎間質(zhì)有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)?；蚯贸Ｐ徒M小鼠腎臟損傷程度比較普通模型組輕（見圖1）。

3 討論

CXCL16是一種表達(dá)于樹枝狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化因子，它對(duì)T細(xì)胞和NK細(xì)胞進(jìn)入各種組織和細(xì)胞間的相互作用（通過(guò)CXCR-6反受體）起著重要的作用[2]。國(guó)內(nèi)外研究提示CXCL16在動(dòng)脈粥樣硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心瓣膜病、炎性肝病、腫瘤等疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用。目前對(duì)CXCL16與腎臟疾病關(guān)系的研究主要集中在動(dòng)物水平，在人體尤其是CKD患者中，有關(guān)CXCL16的研究尚少。國(guó)外學(xué)者通過(guò)雙色免疫熒光法證實(shí)了CXCL16和金屬蛋白酶ADAM10在正常人群和腎炎患者的腎組織中均有表達(dá)，以腎小球、遠(yuǎn)曲小管、連接管、集合管的主細(xì)胞等部位為主[3]。有研究提示血清CXCL16水平在伴腎病活動(dòng)性系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中明顯高于非腎病活動(dòng)性SLE患者，并且在狼瘡鼠模型的受累腎臟中發(fā)現(xiàn)CXCL16的高度表達(dá)[4]。也有研究發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)患者CXCL16的表達(dá)與腎功能密切相關(guān)，在痛風(fēng)合并CKD患者中，其血漿CXCL16水平顯著高于正常對(duì)照人群以及單純CKD患者[5]。

表4 各組小鼠血生化指標(biāo)變化（±s）

表4 各組小鼠血生化指標(biāo)變化（±s）

組別nCXCL16（pg/mL）白蛋白（g/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）磷（mmol/L）普通對(duì)照組7194.42±49.9014.1±0.913.4±0.522.6±3.52.42±0.2普通模型組7362.80±72.23a12.6±0.5a19.4±1.1a39.6±2.4a3.60±1.2a基因敲除模型組418.50±2.38ab14.0±0.8b17.0±0.8ab30.5±0.6ab3.00±0.2ab基因敲除對(duì)照組319.60±1.52ab14.0±1.0b13.0±1.0bc23.6±1.5bc2.30±0.2bcF 50.635.6767.3558.7960.26與普通對(duì)照組比：aP＜0.05；與普通模型組比：bP＜0.05；與基因敲除模型組比：cP＜0.05

本組資料顯示隨著CKD患者的腎功能下降，從早期進(jìn)展到終末期，血漿CXCL16濃度進(jìn)行性增高，且CKD患者的CXCL16濃度明顯高于健康人群，此結(jié)果提示CXCL16在腎病的進(jìn)展中扮演重要的角色。eGFR、血肌酐和血尿素氮是反映腎功能變化的常用指標(biāo)，我們的研究提示在所有的CKD患者中，血漿CXCL16的水平與eGFR、肌酐和尿素氮密切相關(guān)，這也提示CXCL16與CKD患者的腎功能改變密切相關(guān)。但是，目前CXCL16濃度增高與CKD進(jìn)展相關(guān)的具體機(jī)制尚未完全清楚。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示單側(cè)輸尿管梗阻后，高膽固醇血癥和高ox-LDL的產(chǎn)生可引起腎功能損傷，其血漿中CXCL16隨腎功能損傷顯著增高，而且在腎小球疾病尤其膜性腎病的病理中，CXCL16作為ox-LDL的清道夫受體表達(dá)于足細(xì)胞[6-7]。我們推測(cè)CXCL16隨CKD患者疾病進(jìn)展而增高是由于代謝應(yīng)激所致，具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

同時(shí)我們的研究顯示，在合并有糖尿病的CKD患者的血漿CXCL16水平顯著高于非糖尿病CKD患者，血漿CXCL16水平與eGFR、CRP和脂聯(lián)素水平呈獨(dú)立正相關(guān)，證實(shí)了CXCL16在機(jī)體炎癥介導(dǎo)方面起了積極的作用。

目前CXCL16在CKD患者體內(nèi)表達(dá)增加的意義尚未明確。CXCL16的升高是抵抗腎功能惡化的一種適應(yīng)性反應(yīng)，還是在腎功能惡化過(guò)程中起著推動(dòng)作用，是我們接下去要解答的問(wèn)題。所以我們?cè)趯?shí)驗(yàn)研究中建立了CKD動(dòng)物模型，觀察CXCL16基因敲除小鼠與普通小鼠的腎臟損害情況。研究發(fā)現(xiàn)在普通小鼠CKD模型中，其血漿CXCL16的表達(dá)明顯增加，同時(shí)小鼠出現(xiàn)了明顯的腎功能損害及腎臟病理?yè)p傷，而在CXCL16基因敲除小鼠的慢性腎病模型中，血漿中的CXCL16幾乎未檢測(cè)到，且腎功能損害及腎臟病理?yè)p傷輕于小鼠造模組。因此，我們推測(cè)CXCL16在腎臟病變中可能為損傷因子，其高濃度的表達(dá)促進(jìn)腎單位損傷加重。Xia等[8]在CXCL16基因敲除小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，CXCL16的炎癥趨化作用在腎臟損傷和腎臟纖維化中起到了重要作用。

綜上所述，我們的研究結(jié)果顯示隨著腎功能的惡化，CXCL16水平逐漸升高，而CXCL16的高表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)腎單位損傷。對(duì)CXCL16活性和腎功能下降的病因機(jī)制的進(jìn)一步研究可能為治療終末期CKD患者提供新的目標(biāo)。

[1] Yokozawa T, Zheng PD, Oura H, et al. Animal model of adenine-induced chronic renal failure in rats[J]. Nephron, 1986, 44(3): 230-234.

[2] Norlander AE, Saleh MA, Modhur MS, et al. A chemokinecausing chronic kidney disease[J]. Hypertension, 2013, 62: 1008-1010.

[3] Gutwein P, Abdel-Bakky MS, Schramme A, et al. CXCL16 is expressed in podocytes and acts as a scavenger receptor for oxidized low-density lipoprotein[J]. Am J Pathol, 2009, 174(6): 2061-2072.

[4] Wu T, Xie C, Wang HW, et al. Elevated urinary VCAM-1, P-selectin, soluble TNF receptor-1, and CXC chemokine ligand 16 in multiple murine lupus strains and human lupus nephritis[J]. J Immunol, 2007, 179(10): 7166-7175.

[5] 吳帆, 龔琦, 俞佳文, 等. 痛風(fēng)患者CXCL16血清水平的變化及臨床意義[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2011, 27(10): 1977-1981.

[6] Okamura DM, Lopez-Guisa JM, Koelsch K, et al. Atherogenic scavenger receptor modulation in the tubulointerstitium in response to chronic renal injury[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 293(2): F575-F585.

[7] Schramme A, Abdel-Bakky MS, Gutwein P, et al. Characterization of CXCL16 and ADAM10 in the normal and transplanted kidney[J]. Kidney Int, 2008, 74(3): 328-338.

[8] Xia Y, Entman ML, Wang Y, et al. Critical role of CXCL16 in hypertensive kidney injury and fbrosis[J]. Hypertension, 2013, 62(6): 1129-1137.

（本文編輯：丁敏嬌）

Objective:To study the effect of C-X-C chemokine ligand 16 (CXCL16) in patients with chronic kidney disease (CKD) and animal models of nephritic syndrome. To investigate whether elevated CXCL16 concentrations were associated with renal failure in the development of CKD.Methods:Serum samples of 40 healthy people and 200 CKD subjects including our patients and long-term hemodialytic patients were collected. Plasma CXCL16 levels and other clinical and biochemical parameters in all subjects were obtained based on the clinical examinational standard methods. As for experimental animals, 14 male C57BL/6 rats were obtained, which were distributed into common control group and common model group. 7 CXCL16 knockout rats which were randomly distributed into knockout control group and knockout model group were also obtained. Their living conditions were observed for 4 weeks. After that, they were killed and their serum urea nitrogen, creatine, CXCL16 and other indexes were determined; the pathological changes of their kidney tissues were observed.Results:Plasma CXCL16 levels were signifcantly increased with the development of CKD from early-and endstage (P＜0.001 for trend), median circulating CXCL16 level was higher in end-stage CKD patients compared with the early-stage CKD patients and the middle-stage CKD patients. After adjusting for age, gender, and body mass index (BMI), plasma CXCL-16 levels signifcantly associated with renal function and other factors in CKD subjects. Correlative analysis showed the level of CXCL16 was positively associated with serum urea nitrogen, serum creatine, CRP and adiponectin (P＜0.05), and negatively associated with eGFR, HDL-C. In the animal experiments, compared with those in common model group, the increments of serum urea nitrogen, creatine and uric acid in knockout model group were much lower. Renal pathology indicated the level of kidney damage in knockout model group was lower than that in common model group. Conclusion: Plasma CXCL16 levels are signifcantly increased with the development of early-to end-stage CKD and are independently associated withthe loss of renal function. Understanding whether increased CXCL16 is a marker or a potential mechanism of myocardial hypertrophy in CKD requires further study.

CXCL16; kidney disease, chronic; renal failure

R692

A

1000-2138（2014）12-0887-05

2014-04-08

溫州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（Y20100221）。

葉菡洋（1979-），女，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。

周志宏，主任醫(yī)師，Email：markzhou@wzhealth.com。

Expression and signifcance of CXCL-16 in chronic kidney disease

YE Hanyang, JIN Lingwei, JIN Jian, CHEN Yan, GAO Yiyi, HUANG Wen, LI Zhanyuan, ZHENG Yu, ZHOU Zhihong. Department of Nephrology, the Second Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027