徐同毅，韓慶奇，張本，龔德軍，袁揚，蔡成良，丁云，鄒良建

運動預(yù)處理對壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠病理性心肌肥厚的影響*

徐同毅，韓慶奇**，張本，龔德軍，袁揚，蔡成良，丁云，鄒良建

目的：探究運動預(yù)處理（EP）對壓力超負(fù)荷引起的大鼠病理性心肌肥厚和心力衰竭（心衰）的影響。

運動預(yù)處理；壓力超負(fù)荷；病理性心肌肥厚；主動脈縮窄

(Chinese Circulation Journal, 2014,29:728.)

1999年，Yamashita等[1]正式提出了運動預(yù)處理（EP）概念。EP是通過運動誘導(dǎo)機體產(chǎn)生內(nèi)源性的自身保護,從而提高心臟耐受缺血缺氧能力的現(xiàn)象。其本質(zhì)就是通過一定的應(yīng)激手段，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生內(nèi)源性的自身保護，提高機體耐受缺血缺氧的能力，從而更好的適應(yīng)諸如缺血再灌注損傷、壓力超負(fù)荷等不良應(yīng)激的刺激，保護心功能，是缺血預(yù)處理的一種特殊形式。

病理性心肌肥厚早期階段，心肌細(xì)胞體積增大、新肌小節(jié)蛋白形成，心功能代償性增強，但是到了晚期，心臟纖維化程度增加、心肌細(xì)胞壞死或凋亡，心功能將失代償，最終轉(zhuǎn)化為心力衰竭（心衰）。現(xiàn)有研究已經(jīng)公認(rèn)病理性心肌肥厚是心衰的前期病變，是心衰、腦卒中、冠心病、猝死等的獨立危險因素[2]。心肌肥厚發(fā)生機制等相關(guān)研究的正確評價有賴于動物實驗, 壓力超負(fù)荷法建立病理性心肌肥厚的模型是最常見的，而主動脈縮窄（TAC）法是目前應(yīng)用最廣泛的建立壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)病理性心肌肥厚動物模型的方法[3]。

EP是否對壓力超負(fù)荷引起的病理性心肌肥厚有保護作用目前研究尚少，本研究通過EP后進行TAC手術(shù)來建立心肌肥厚的模型，與TAC建立的病理性心肌肥厚模型對比，用組織形態(tài)學(xué)、超聲心動圖、分子標(biāo)志物對模型進行全面評估，確定EP對壓力超負(fù)荷引起的病理性心肌肥厚的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物

2013-02至2013-08在第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院胸心外科實驗中心完成實驗。健康雄性6 周齡SPF級SD大鼠60只，體重120～140 g，購自上海西普爾—必凱實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016。飼養(yǎng)于上海第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，使用許可證號：SYXK（滬）2012-0003，SPF級條件飼養(yǎng)，繁育飼料購于上海仕林生物科技有限公司。本研究全部內(nèi)容通過第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院科學(xué)研究倫理委員會認(rèn)證，所有操作均遵循國家實驗動物管理條例及國家實驗動物管理實施細(xì)則。

1.2實驗動物模型的建立

將實驗動物隨機分為三組，每組20只，分別是假手術(shù)組（Sham組）、主動脈縮窄組（TAC組）和運動預(yù)處理+主動脈縮窄組（EP+TAC組），在完全相同的環(huán)境中飼養(yǎng)，可以自由的獲取水和食物。

建立TAC組誘導(dǎo)病理性心肌肥厚對照模型：將20只10 周齡正常SD大鼠與上述跑臺EP完成后的大鼠同時進行TAC手術(shù)，手術(shù)方法同上。后裝籠飼養(yǎng)。

建立Sham組模型：將20只10 周齡正常SD大鼠按照TAC手術(shù)步驟，但不結(jié)扎胸主動脈。

1.3心功能評價方法及觀察指標(biāo)

上述各實驗?zāi)Ｐ徒M分別在術(shù)后4周（n=10）和8周（n=10）時用戊巴比妥（80 mg/kg）麻醉后行超聲心動圖（加拿大VisualSonics Vevo770超聲及17.5 MHz超聲探頭）檢查。各組動物胸部備皮，獲得M型超聲心動圖像，每只大鼠在每個切面上檢測兩次，每次讀取連續(xù)5個心動周期的數(shù)值，取平均值用于統(tǒng)計。所有測量均由兩位超聲醫(yī)師雙盲法操作，取兩者均值。

1.4標(biāo)本采集與處理

頸椎離斷法處死大鼠，稱量體重，電子天平稱取心臟重量，室間隔、左心室游離壁作為左心室重量,用電子天平稱量左心室重量，并稱取雙肺臟重量以及測量脛骨長度，計算心臟重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)、肺臟重量指數(shù)和左心室重量/脛骨長度。用于心衰標(biāo)志物心鈉肽和腦鈉肽蛋白檢測的心肌組織立即置于液氮中保存。余心肌組織用10%甲醛液固定，制片后用于用蘇木素伊紅（HE）染色。

1.5實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測

2014年，為深化轉(zhuǎn)型升級，公司在東莞橋頭鎮(zhèn)建設(shè)了力嘉環(huán)保包裝印刷產(chǎn)業(yè)園，該項目于2014年被東莞市委、市政府列入重大項目，項目分兩期開發(fā)建設(shè)，一期園區(qū)占地面積160畝，投資規(guī)模達6.8億元，已成功打造10萬平方米的自動化環(huán)保生產(chǎn)基地，目前已吸引超30家印刷包裝上下游企業(yè)入駐。此外，公司還精心打造了包裝印刷博物館、蘋果樹創(chuàng)客空間、包裝設(shè)計展廳、多功能會議廳、嘉湖觀休閑區(qū)等包裝印刷公共配套，并陸續(xù)把園區(qū)的配套設(shè)施共享給行業(yè)協(xié)會，實現(xiàn)資源共享。

取大鼠左心室心肌組織經(jīng)Trizol（Invitrogen）提取總核糖核酸（RNA），取1.0 pg 總 RNA經(jīng)PrimeSeript RT master mix perfect real-time（TaKaRa）逆轉(zhuǎn)錄為互補脫氧核糖核酸（cDNA），根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒操作，在ABI StepOne Real-Time 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) System （Applied Biosystems）進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以GAPDH為內(nèi)參，檢測心肌肥厚相關(guān)分子標(biāo)志物表達。各個基因的引物（上海生工）如下：心鈉肽：上游：5'- AGAGAGTGAGCCGAGACAGC-3'， 下游：5'-TGGACACCGCACTGTATACG-3'； 腦鈉肽：上游：5'-CCGGATCCAGGAGAGACTTC-3'，下游：5'-TCTGCAGCCAGGAGGTCTTC-3'；GAPDH上 游：5'- GCCATCACTGCCACTCAGAA-3'，下游：5'-GGCATGTCAGATCCACAACG-3'。

1.6蛋白質(zhì)印跡法檢測

根據(jù)以前描述的方法進行大鼠左心室總蛋白的提取[7,8]，按100 mg樣品加1 ml組織裂解液的比例加入裂解液提取大鼠左心室心肌組織蛋白。配制12% SDS-PAGE分離膠和5%積層膠，每孔加入40 μg蛋白樣品，置電泳緩沖液中，80 V電泳約30 min，待樣品進入分離膠后，110 V電泳至所需時間。將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h，分別加一抗［ANP抗體（sc-18811，美國Santa Cruz公司）（1:200），腦鈉肽抗體（ab-19645，英國abcam公司）（1:1000）］。4℃孵育過夜，次日TBST清洗液[10×TBS液（Tris：12.1 g，NaCl ：40 g，蒸餾水至500 ml ，濃鹽酸調(diào)pH值至7.6） 100 ml，蒸餾水 900 ml，Tween-20 1 ml]洗膜3次，每次5 min，再加相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，發(fā)光劑孵育6 min，曝光、顯影、定影，結(jié)果用Image J凝膠圖像分析系統(tǒng)對條帶進行分析，實驗重復(fù)6次。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間計量資料采用雙因素方差分析和LSD檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組心臟超聲和病理結(jié)果比較

術(shù)后4 周時，與Sham組相比，TAC組和EP+TAC組的心率和左心室壁厚度已經(jīng)開始升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），但其后兩手術(shù)組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。術(shù)后8 周時，與Sham組相比，TAC組和EP+TAC組的觀察指標(biāo)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。進一步比較發(fā)現(xiàn)， EP+TAC組的心率、左心室前壁收縮末期厚度和左心室后壁收縮末期厚度與TAC組相比分別低17%、12%和12%（P均＜0.05），左心室射血分?jǐn)?shù)增加15%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。圖1

圖1 三組大鼠心肌肥厚模型的超聲心動圖結(jié)果分析

術(shù)后8 周時，與Sham組相比，TAC組和EP+TAC組的心臟重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)、左心室重量/脛骨長度和肺臟重量指數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01），而術(shù)后4周時與Sham組相比，差異不明顯，且TAC組和EP+TAC組兩手術(shù)組間比較無明顯差異。術(shù)后8周時，EP+TAC組與TAC組相比上述指標(biāo)分別低15.7%、20.0%、22.6%和17.8%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。圖2

圖2 三組大鼠心肌肥厚模型的病理結(jié)果分析

2.2病理組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

病理組織切片HE染色觀察發(fā)現(xiàn)：Sham組心肌纖維排列正常，EP+TAC組比TAC組表現(xiàn)為心肌細(xì)胞胞漿變寬，細(xì)胞核變大，在相同倍數(shù)單位面積細(xì)胞數(shù)減少，但心肌細(xì)胞排列整齊、著色均勻，心肌細(xì)胞間連接緊密。圖3

圖3 主動脈縮窄術(shù)后8 周三組大鼠心肌肥厚模型心肌細(xì)胞蘇木素伊紅染色比較 （×400）

2.3實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測結(jié)果

在術(shù)后4 周時，與Sham組比較，TAC組的心鈉肽和腦鈉肽的mRNA表達量分別增加1.07倍和2.75倍（P均＜0.05），而EP+TAC組未見明顯變化，與TAC組相比，EP+TAC組的上述指標(biāo)分別低47%和62%（P＜0.05）。術(shù)后8 周時，與Sham組比較，TAC組和EP+TAC組的指標(biāo)均增加明顯，且比術(shù)后4周時增加明顯，但其后兩手術(shù)組間比較，心鈉肽和腦鈉肽的mRNA表達量變化較術(shù)后4周時減小，EP+TAC組分別低44.0%和28.1%。圖4

圖4 三組大鼠心肌肥厚模型心鈉肽和腦鈉肽mRNA相對表達量分析

2.4心鈉肽和腦鈉肽蛋白的表達量分析

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，與Sham組相比，TAC組在4 周和8周時心鈉肽和腦鈉肽蛋白表達量明顯升高（P＜0.01），EP+TAC組的變化在術(shù)后4周時不明顯，但術(shù)后8周時也明顯升高（P＜0.05）。而且，與TAC組相比，EP+TAC組的蛋白表達量分別低42.3%、48.0%（術(shù)后4周）和21.5%、38.3%（術(shù)后8周），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。圖5

圖5 三組大鼠心肌肥厚模型心鈉肽和腦鈉肽蛋白相對表達量分析

3 討論

我們第一次將EP應(yīng)用于病理性心肌肥厚的保護，而且我們發(fā)現(xiàn)EP能夠延緩病理性心肌肥厚發(fā)展為心衰的進程。目前EP對心肌缺血再灌注損傷的研究較多，其通過縮小心肌梗死面積，降低心律失常的發(fā)生率，減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生和改善心功能而減輕缺血再灌注損傷。中等強度有氧運動的實驗動物模型是了解心肌缺血再灌注損傷心肌保護作用的細(xì)胞機制一個重要途徑[9]。

根據(jù)超聲和病理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Sham組相比，在兩個時間點，所測的指標(biāo)均出現(xiàn)不同程度的變化，特別是在術(shù)后8周時差異比較明顯，說明兩個手術(shù)模型建立成功。在TAC組和EP+TAC組之間比較，在術(shù)后4周時變化不是很明顯，而在術(shù)后8周時差異顯著，考慮原因為在術(shù)后4周時兩組大鼠的心功能均處于代償期，心功能變化不明顯，但是到了術(shù)后8周時，TAC組進入了失代償期，心功能變化明顯，而EP+TAC組在EP的保護下心衰的進程延緩。

利鈉肽家族包括：心鈉肽、腦鈉肽、C型鈉尿肽、腎利鈉肽及樹眼鏡蛇屬利鈉肽[10]。心鈉肽和腦鈉肽作為心衰標(biāo)志物，已經(jīng)越來越多地應(yīng)用于心衰的診斷、鑒別診斷、危險度分層、預(yù)后判定及治療指導(dǎo)[11-13]。利鈉肽家族在血壓調(diào)節(jié)、平衡體液及維護心血管功能等方面起重要作用，心臟負(fù)荷過大、機械牽引、心肌損傷、心室壁張力過大等刺激，均可促使其的合成與釋放[14-18]。本研究中從心鈉肽和腦鈉肽相對mRNA和蛋白表達量檢測來看，與Sham組比較，TAC組在兩個時間點表達量均明顯升高，但是EP+TAC組的變化在術(shù)后4周時不明顯，而且與TAC組相比，兩個時間點相對mRNA和蛋白表達量均出現(xiàn)下降，并且在術(shù)后8周時兩個標(biāo)志物的表達量變化較術(shù)后4周時減小，這提示EP在病理性心肌肥厚早期的保護作用是明顯的，隨著時間的推移，保護作用逐漸減弱，不能最終阻止進入失代償期的結(jié)局。本研究能為進一步研究EP對病理性心肌肥厚的作用機制提供基礎(chǔ)。

本實驗EP是根據(jù)Bedford標(biāo)準(zhǔn)進行中等量負(fù)荷運動，盡量避免出現(xiàn)運動量過大造成心臟一些不可逆的病理變化，加快TAC后心功能的衰竭。曾報道心衰患者運動后出現(xiàn)舒張末期左心室內(nèi)徑擴大，導(dǎo)致病理性擴張型心肌病的發(fā)生可能[19]。因此采用什么樣的運動方式、運動強度和運動時間才能誘發(fā)最佳的預(yù)適應(yīng)效果都是以后研究的方向。

本研究已經(jīng)證實EP對壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠病理性心肌肥厚有保護作用，為進一步研究EP的作用機制提供可靠的動物模型，我們相信隨著對EP的不斷深入研究和認(rèn)識，將更有助于對運動保護心功能的研究，為科學(xué)制定心血管疾病的預(yù)防和康復(fù)提供新的思路。

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Exercise Preconditioning Improving the Pathological Cardiac Hypertrophy in Pressure Over-loaded Rats

XU Tong-yi, HAN Qing-qi, ZHANG Ben, GONG De-jun, YUAN Yang, CAI Cheng-liang, DING Yun, ZOU Liang-jian.
Department of Cardiothoracic Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai (200433), China

ZOU Liang-jian, Email: zouliangjiansh@gmail.com

Objective: To explore the effect of exercise preconditioning (EP) on pathological cardiac hypertrophy and heart failure (HF) in pressure over-loaded experimental rats.Methods: A total of 60 SD rats at the age of 6 weeks were randomly divided into 3 groups, n=20 in each group. Sham-operation group, Transverse aortic constriction (TAC) group and EP + TAC group. The cardiac function and structure were evaluated by echocardiography, patholgical changes and HF biomarkers were examined for EP effect at 4 and 8 weeks after TAC.Results: Compared with Sham-operation group, the cardiac function and structure had obvious changes in the other 2 groups. Compared with TAC group, the ejection fraction in EP + TAC group increased 15%, the heart weight index and left ventricular weight index decrease 15.7% and 20% respectively at 8 weeks after TAC, all P＜0.05. Compared with Sham-operation group, the mRNA and protein expressions of ANP and BNP increased in TAC group at 4 and 8 weeks after TAC, increased in EP + TAC group at 8 week after TAC. Compared with TAC group, the mRNA expressions of ANP and BNP in EP + TAC group decreased 47% and 62% at 4 weeks after TAC, decreased 44% and 28.1% at 8 weeks afterTAC, all P＜0.05; the protein expression of ANP and BNP in EP + TAC group decreased 22.3% and 48% at 4 weeks after TAC, decreased 21.5% and 38.3% at 8 weeks after TAC, all P＜0.01.Conclusion: EP may improve cardiac pathological hypertrophy in pressure over-loaded rats at the early stage, and delay the heart failure process.

Exercise preconditioning; Pressure over-load; Pathological cardiac hypertrophy; Transverse aortic constriction

2014-01-14)

（編輯：漆利萍）

上海市衛(wèi)生局科研基金（20124361）

200433 上海市，第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院 胸心外科（徐同毅、韓慶奇、張本、龔德軍、袁揚、蔡成良、丁云、鄒良建）；解放軍第401醫(yī)院 胸心外科（徐同毅）

徐同毅 主治醫(yī)師 博士研究生 主要從事胸心外科的臨床和基礎(chǔ)研究 Email: tonyi_xu@163.com 通訊作者：鄒良建

Email: zouliangjiansh@gmail.com**為共同第一作者

R541

A

1000-3614（2014）09-0728-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2014.09.018

方法：雄性6周齡SPF級SD大鼠60只分為Sham組、主動脈縮窄（TAC）組和運動預(yù)處理+主動脈縮窄（EP+TAC）組，每組20只。分別在TAC術(shù)后4 周和8周時行超聲心功能評價、病理檢查以及心衰標(biāo)志物檢測來探討EP的作用。

結(jié)果：超聲心動圖和病理檢測提示兩個手術(shù)組的檢測指標(biāo)相比Sham組均有明顯變化，而且兩手術(shù)組間比較，EP+TAC組的各項指標(biāo)均優(yōu)于TAC組，特別是在術(shù)后8周時，左心室射血分?jǐn)?shù)增加15%，心臟重量指數(shù)減少15.7%和左心室重量指數(shù)減少20%（P＜0.05）,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。從心衰標(biāo)志物心鈉肽和腦鈉肽信使核糖核酸（mRNA）和蛋白表達來看，與Sham組比較，TAC組在兩個時間點表達量均明顯升高，EP+TAC組的變化在TAC術(shù)后4 周時不明顯，但在術(shù)后8周時升高明顯。與TAC組相比，EP+TAC組的mRNA表達量在術(shù)后4周時分別下降47%和62%，術(shù)后8周時減少44.0%和28.1%（P＜0.05）；蛋白表達量術(shù)后4周時下降42.3%和48.0%，術(shù)后8周時下降21.5%、38.3%（P＜0.01），在術(shù)后8周時兩手術(shù)組心衰標(biāo)志物表達量差異較術(shù)后4周時減小。

結(jié)論：EP能改善壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)大鼠病理性心肌肥厚，且在早期的保護作用明顯，能夠延緩心衰的進程，為進一步探究作用機制提供模型基礎(chǔ)。