林峰，張晨虹，周志軍，劉芳，魏若菡，陳慧

我國是一個肝癌大國，目前患病人數(shù)約占全球肝癌患者總數(shù)的55%，在腫瘤相關死亡中僅次于肺癌，位居第二[1]。研究表明肝癌的發(fā)生是一個多基因參與，并通過不同基因表達進行調(diào)控的復雜過程，癌細胞的早期侵襲轉(zhuǎn)移是肝癌患者死亡的重要原因之一[2]。深入研究肝癌的發(fā)生機制，評估、篩選肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的核心分子并制定靶向干預措施是目前肝癌基礎與臨床領域的研究重點。肝癌抑制基因1(hepatocellular carcinoma suppressor gene 1，HCCS1)是新近發(fā)現(xiàn)的候選腫瘤抑制基因，位于染色體17p13.3區(qū)，其cDNA全長約2.1×103，共18個外顯子[3]。HCCS1在肝癌組織中存在高頻突變，基因表達水平明顯低于癌旁組織。研究發(fā)現(xiàn)HCCS1高表達能夠促進鈣離子內(nèi)流而誘導細胞凋亡，HCCS1表達缺失則會促進細胞過度增殖[4]。非小細胞肺癌及結(jié)腸癌腫瘤細胞HCCS1較正常組織明顯降低，且HCCS1表達水平越低，腫瘤惡性程度越高，患者更易出現(xiàn)腫瘤復發(fā)及轉(zhuǎn)移[5-6]。目前，HCCS1已經(jīng)成為肝癌及其他惡性腫瘤基因治療的潛在靶點之一[6-7]。本研究探討HCCS1對肝癌細胞干性表型及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，以期為研究肝癌治療的新靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 熒光素PE標記的小鼠抗人CD133單克隆抗體及小鼠抗人CD90流式細胞檢測用單克隆抗體購自德國Miltenyi Biotec公司；小鼠抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、纖連蛋白免疫組化用單克隆抗體，HCCS1、E-cadherin、纖連蛋白、GAPDH蛋白印跡用單克隆抗體購自美國Santa Crutz公司；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)酶聯(lián)免疫吸附實驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自美國eBioscience公司；Matrigel購自美國BD公司。編碼HCCS1基因的重組腺病毒載體(Ad-HCCS1)及對照病毒載體(Ad-LacZ)由本實驗室自行構建。

1.2 細胞培養(yǎng)及分組 人肝癌細胞系細胞株MHCC-97H購自中科院上海細胞庫，細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，37℃、5%CO2密閉傳代培養(yǎng)，每2～3d換液，收集對數(shù)生長期MHCC-97H細胞，配制成密度為1×106/ml細胞懸液。實驗細胞分為正常對照組、HCCS1組及Ad-LacZ組。正常對照組細胞不做特殊處理，HCCS1及Ad-LacZ組細胞按感染復數(shù)(multiple of infection，MOI)100:1分別感染Ad-HCCS1及Ad-LacZ，培養(yǎng)5d后收集各組細胞及培養(yǎng)液上清，用于后續(xù)檢測。

1.3 熒光定量RT-PCR檢測HCCS1mRNA水平 各組細胞內(nèi)HCCS1的mRNA表達水平采用熒光定量RT-PCR方法檢測[8]。建立反轉(zhuǎn)錄PCR反應體系，總量10μl。所用引物序列如下：HCCS1，上游5'-GCAGATCTATGATGGA GGAGGAGGAACT-3'，下游5'-GCCTCGAGC TACGTCCATCTCACCTGTT-3'；GAPDH，上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。PCR反應條件如下：50℃ 2min，95℃ 5min；95℃ 15s，60℃30s，循環(huán)40次。目的基因mRNA表達水平以相應標本內(nèi)GAPDH mRNA為基準采用2-ΔΔCt方法計算，并將正常對照組標本內(nèi)目的基因表達水平設為1，對其他組標本內(nèi)目的基因的表達水平進行標準化計算(所得結(jié)果為1的倍數(shù))[8]。

1.4 Western blotting檢測相關基因蛋白表達水平裂解液裂解3組細胞，提取細胞總蛋白并采用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度。采用12% SDSPAGE電泳分離蛋白質(zhì)(30μg蛋白/泳道)，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，常溫下用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2h；經(jīng)TBST清洗2次后，加入適當稀釋的小鼠抗人HCCS1、E-cadherin、纖連蛋白、GAPDH單克隆抗體(1:200)，4℃孵育過夜；加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的第二抗體孵育1h；加入底物并曝光、顯影。

1.5 流式細胞術檢測CD133+、CD90+細胞比例收集各組細胞，4℃ PBS清洗2次；將細胞沉淀充分混勻，調(diào)整細胞密度至1×106/ml，經(jīng)過濾后，吸取100μl至試管，加入20μl PE標記的小鼠抗人CD133或CD90單克隆抗體，冰上避光作用約15min；每管各加入1×流式細胞檢測用緩沖液380μl。采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，并應用Cellquest軟件對數(shù)據(jù)進行初步分析。

1.6 ELISA檢測VEGF含量 各組細胞培養(yǎng)液上清中VEGF含量采用相應的ELISA試劑盒進行檢測，按說明書進行操作。

1.7 Transwell實驗 收集各組細胞，并用含1%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×105/ml；在小室內(nèi)加入200μl腫瘤細胞懸液，小室外加入800μl含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液；常規(guī)培養(yǎng)48h，取出Transwell小室，HE染色，在顯微鏡下隨機挑取10個200倍視野，計數(shù)穿膜細胞，每組重復4個樣本。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以x±s表示，多組樣本均數(shù)之間的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 HCCS1基因及蛋白表達水平 與正常對照組(0.92±0.10)及Ad-LacZ組(1.10±0.11)比較，HCCS1組細胞HCCS1mRNA表達水平(5.42±0.53)明顯升高(P＜0.01)，但Ad-LacZ組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與正常對照組及Ad-LacZ組比較，HCCS1組HCCS1蛋白表達水平明顯升高(P＜0.01)，而Ad-LacZ組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖1)。

圖1 各組細胞HCCS1蛋白表達水平Fig.1Expression of HCCS1protein in each group

2.2 CD133+、CD90+細胞比例 流式細胞術檢測結(jié)果顯示，與正常對照組及Ad-LacZ組比較，HCCS1組CD133+、CD90+細胞比例明顯降低(P＜0.01)，但Ad-LacZ組與正常對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

2.3 細胞培養(yǎng)液上清中的VEGF含量 ELISA檢測結(jié)果顯示，與正常對照組及Ad-LacZ組相比，HCCS1組細胞培養(yǎng)液上清中的VEGF含量明顯降低(P＜0.01)，而正常對照組與Ad-LacZ組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

圖2 各組細胞E-鈣黏蛋白及纖連蛋白表達水平Fig.2Expression of E-cadherin and fibronectin in each group

表1 各組細胞CD133+、CD90+細胞比例及培養(yǎng)液上清中的VEGF含量(x±s，n=4)Tab.1Proportion of CD133+, CD90+ positive cells and VEGF contents in the supernatant (x±s, n=4)

2.4 E-cadherin及纖連蛋白表達水平 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與正常對照組及Ad-LacZ組相比，HCCS1組細胞E-cadherin及纖連蛋白表達水平均明顯升高(P＜0.01)，而Ad-LacZ組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2)。

2.5 各組細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力 Transwell小室檢測結(jié)果顯示，HCCS1組穿膜細胞數(shù)量為14.2±2.1個，明顯少于正常對照組(34.2±4.5個)及Ad-LacZ組(32.6±4.2個，P＜0.01)。

3 討 論

研究顯示，在乳腺癌、前列腺癌、皮膚癌等腫瘤組織中存在一群數(shù)量較少，但具有較強的自我更新、分化潛能的細胞，稱為腫瘤起始細胞或腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)[9-12]。2006年美國癌癥研究協(xié)會對CSCs作出了如下定義：CSCs是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì)性腫瘤細胞群的細胞；在腫瘤組織中，僅有CSCs具備腫瘤始動能力和轉(zhuǎn)移特性；CSCs是維持腫瘤生長并逃避內(nèi)、外源性調(diào)控的最重要細胞群[13]。進一步研究顯示，肝癌組織內(nèi)也存在CSCs，它們在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著關鍵作用，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、抗藥性的產(chǎn)生及治療后的復發(fā)密切相關[14-15]。因此，研究肝癌組織內(nèi)CSCs干性維持機制將有助于發(fā)展治療腫瘤的新的有效手段[16-17]。

本研究結(jié)果顯示，HCCS1能降低肝癌細胞CD133、CD90的表達。CD133最初作為人類造血干細胞表面的一種跨膜糖蛋白而被發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)已作為肝癌干細胞的重要標志物而受到密切關注。2007年Ma等[18]率先發(fā)現(xiàn)CD133(+)肝癌細胞較CD133(-)肝癌細胞具有更強的體外克隆成瘤能力、更高的增殖性及體內(nèi)成瘤能力，并且有肝祖細胞的重要特征，包括基因的表達、自我更新和分化能力。來源于臨床手術切除肝癌標本的資料顯示，CD133(+)腫瘤細胞頻繁出現(xiàn)在肝癌組織中，且CD133高表達與腫瘤分級升高、疾病的進展階段、較短的總生存期以及較高復發(fā)率相關[19]。同時，CD90作為肝癌干細胞的標志物也受到廣泛重視。體內(nèi)實驗表明，多個小鼠肝癌細胞系及人肝癌細胞系中，CD90(+)腫瘤細胞的成瘤率較CD90(-)腫瘤細胞顯著增強[20]。本研究結(jié)果表明，HCCS1能夠抑制肝癌細胞的干性表型，其確切機制仍需進一步研究。

本研究進一步分析了HCCS1對腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。肝癌的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤血管生成密切相關。VEGF是目前已知的在原發(fā)性肝癌血管生成中作用最強的誘導血管生成因子，通過作用于血管內(nèi)皮細胞、提高血管通透性、促進肝癌細胞的增殖從而促進肝癌的發(fā)生、發(fā)展[21]。研究顯示，肝癌組織中VEGF的表達顯著高于正常肝組織，且隨著肝癌的進展呈上升趨勢，是重要的肝癌預后分子之一[22]。本研究結(jié)果顯示，HCCS1能夠抑制腫瘤細胞合成并分泌VEGF。E-鈣黏蛋白和纖連蛋白是參與細胞間連接的主要分子，發(fā)揮著維持細胞極性和組織結(jié)構完整性的功能，也抑制著腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。腫瘤組織中E-鈣黏蛋白表達降低，細胞間黏附力減弱并導致細胞外基質(zhì)降解和基底膜缺損，進而促進腫瘤細胞突破原來的位置進入血管。有關結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌細胞中E-鈣黏蛋白的表達較未發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的癌細胞明顯降低。同時，采用RNA干擾技術降低腫瘤細胞中E-鈣黏蛋白蛋白水平可明顯促進細胞的侵襲生長能力并提高其耐藥性[23]。研究結(jié)果顯示，HCCS1能夠明顯提高腫瘤細胞內(nèi)E-鈣黏蛋白及纖連蛋白的表達。Transwell實驗進一步證實HCCS1能夠明顯降低肝癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

綜上，本研究表明，HCCS1能降低人肝癌細胞株MHCC-97H的腫瘤干細胞表型并抑制其侵襲轉(zhuǎn)移能力，為研究肝癌治療的新靶點提供了理論依據(jù)。

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