劉一凡,王正冠,唐紅衛(wèi),吳小利,謝尹晶,張洪瑞,李登清,王成彬
吸入性肺損傷是指因吸入熱力或化學(xué)性刺激物而引起的呼吸道以至肺實(shí)質(zhì)的損害,往往也是導(dǎo)致嚴(yán)重全身性病變的重要原因。黑火藥被廣泛應(yīng)用于軍事和民用方面,如戰(zhàn)爭(zhēng)、演習(xí)或煙花爆竹的燃放等,在爆炸、燃燒過(guò)程中所釋放的有毒氣體及粉塵顆粒會(huì)引發(fā)急性吸入性肺損傷,造成肺組織充血、水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等[1-2]。體外研究表明,黑火藥煙霧會(huì)導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-8表達(dá)增加,活性氧相對(duì)含量增高[3],而其體內(nèi)損傷機(jī)制尚未明確。烏司他丁(ulinastatin,UTI)作為一種蛋白酶抑制劑,目前在臨床上主要用于胰腺炎的治療。研究發(fā)現(xiàn),除對(duì)多種蛋白酶、脂水解酶等有抑制作用外,UTI還具有清除氧自由基、抑制炎癥介質(zhì)的過(guò)度釋放等功能[4-6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明UTI對(duì)脂多糖、燒傷及缺血再灌注導(dǎo)致的肺損傷具有保護(hù)作用[7-9],但是否能減輕煙霧吸入所致的肺損傷尚未見報(bào)道。本研究通過(guò)建立黑火藥煙霧所致肺損傷大鼠模型,探討UTI對(duì)煙霧吸入性肺損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Wistar大鼠30只,體重210~230g,由解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào)SCXK(京)2012-0001。大鼠于清潔房中飼養(yǎng),溫度21~24℃,濕度50%~60%,晝夜12h節(jié)律,自由進(jìn)食、飲水。
1.2 主要藥物及試劑 烏司他丁(規(guī)格:10萬(wàn)單位;批號(hào):031301103;廣東天普生化醫(yī)藥公司);硝酸鉀、碳粉、硫黃粉(純度99.9%,200目,北京西四化工原料公司);丙二醛(malondialdehyde,MDA)及髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所);TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒(北京TransGen公司)。實(shí)驗(yàn)所用引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
1.3 實(shí)驗(yàn)分組及動(dòng)物模型制備 30只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組(C組)、吸入性肺損傷組(I組)、烏司他丁高劑量組(UH組)、烏司他丁中劑量組(UM組)、烏司他丁低劑量組(UL組),每組6只。C組大鼠暴露于動(dòng)物煙熏箱的空氣中8min,I組、UH組、UM組、UL組置于動(dòng)物煙熏箱,在10g火藥產(chǎn)生的煙霧中暴露8min,制作黑火藥煙霧吸入性肺損傷模型[1]。UH組、UM組、UL組分別按100000、50000、20000U/(kg.d)計(jì)算出UTI用量,稀釋至3ml,于煙霧吸入后10min經(jīng)腹腔注射,C組、I組注入3ml 0.9% NaCl注射液。所有大鼠均于煙霧暴露后40h經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛(1ml/kg)麻醉,暴露分離腹主動(dòng)脈,取動(dòng)脈血1ml,處死并取材。
1.4 觀察指標(biāo)
1.4.1 動(dòng)脈血?dú)夥治?麻醉大鼠并取腹主動(dòng)脈血1ml,于30min內(nèi)采用羅氏Cobasb血?dú)夥治鰞x進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治觥?/p>
1.4.2 肺濕/干重比(W/D) 處死大鼠后取右肺前葉及中葉,拭干表面血液后稱濕重并記錄,然后放入60℃烘箱烘烤48h至恒重并記錄干重,計(jì)算W/D值。
1.4.3 支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)細(xì)胞計(jì)數(shù)及蛋白含量測(cè)定 處死大鼠后,打開胸腔,分離主支氣管,夾閉右主支氣管,在主支氣管切開處置入自制灌洗針并結(jié)扎固定,用4℃生理鹽水2.5ml行左肺灌洗,重復(fù)3次,記錄回收量。BALF經(jīng)1500r/min離心10min,收集上清液,BCA法測(cè)定總蛋白含量,取沉淀重懸于1ml生理鹽水并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
1.4.4 血清、肺組織MPO活性及肺組織MDA含量測(cè)定 取肺組織100mg,置于液氮中研磨后以1:9比例加入生理鹽水,制成10%的肺組織勻漿,采用MPO及MDA試劑盒測(cè)定肺組織MPO活性及MDA含量,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。大鼠麻醉后取腹主動(dòng)脈血5ml,3000r/min離心5min,測(cè)血清MPO活性,具體操作按照MPO試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。
1.4.5肺組織Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR-4)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用Trizol試劑盒提取肺組織總RNA。取2μl RNA樣本,加入不含RNA酶的雙蒸水198μl,置于核酸分析儀中測(cè)定純度和濃度,取A260/A280值在1.8~2.0的RNA,采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA,實(shí)驗(yàn)所用引物序列見表1。PCR采用20μl反應(yīng)體系,包括上游引物(10μmol/L)0.5μl,下游引物(10μmol/L)0.5μl,2×TransStart Green qPCRSuperMix 10μl,模板2μl,雙蒸水7μl。擴(kuò)增條件:94℃ 180s;94℃ 30s,58℃ 30s,72℃60s,共45個(gè)循環(huán);95℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 30s。擴(kuò)增完成后從50℃升溫繪制熔解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。
表1 PCR引物序列Tab. 1Primer sequence for PCR amplification
1.4.6 肺組織病理學(xué)檢查 觀察肺組織大體病理改變,取右肺后葉浸入4%中性緩沖甲醛溶液中固定24h,石蠟包埋,4μm連續(xù)切片,常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。
1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布及方差齊性的計(jì)量資料以±sx表示,多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 動(dòng)脈血?dú)夥治鼋Y(jié)果 與C組比較,在暴露于黑火藥煙霧40h后,I組PaO2明顯降低,PaCO2明顯升高(P<0.05)。給予不同劑量UTI處理后,UH、UM、UL組PaO2均高于I組(P<0.05),UM與UL組PaCO2水平低于I組(P<0.05),3組PaO2、PaCO2與C組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。
2.2 肺W/D及BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)、蛋白含量測(cè)定結(jié)果 I組肺W/D顯著高于C組和使用UTI治療的三組(P<0.05),而C組與使用UTI治療的3組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。I組大鼠BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于其余4組(P<0.05),BALF蛋白含量明顯高于C組及UM組、UL組(P<0.05),與UH組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,表2)。
2.3 MPO活性及MDA含量測(cè)定結(jié)果 UH組血清、肺組織MPO活性及肺組織MDA含量均低于I組(P<0.05),且與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。UM、UL組血清MPO活性顯著低于I組(P<0.05,表3)。
表2 煙霧吸入后40h各組PaCO2、PaO2、W/D及BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白含量比較(±sx,n=6)Tab. 2Arterial blood gas analysis, WBC count and protein contents in BALF of 5groups at 40h post smog inhalation (±sx, n=6)
表2 煙霧吸入后40h各組PaCO2、PaO2、W/D及BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)和蛋白含量比較(±sx,n=6)Tab. 2Arterial blood gas analysis, WBC count and protein contents in BALF of 5groups at 40h post smog inhalation (±sx, n=6)
(1)P<0.05compared with group C; (2)P<0.05compared with group I
Group PaO2 (mmHg) PaCO2 (mmHg) W/D BALF WBC (×105/ml) Protein (μg/ml)C 83.3±2.0 45.8±2.4 4.51±0.08 3.85±0.72 188.2±11.8I 55.5±10.1(1) 55.0±4.0(1) 5.03±0.06(1) 30.85±2.92(1) 1528.1±413.1(1)UH 71.6±3.3(2) 48.3±1.4 4.72±0.11(2) 9.22±0.86(2) 882.1±152.0UM 74.9±4.2(2) 46.6±2.1(2) 4.69±0.06(2) 9.15±2.41(2) 717.7±89.0(2)UL 74.6±3.4(2) 43.8±1.4(2) 4.63±0.12(2) 11.76±3.58(1)(2) 764.3±38.2(2)
2.4 肺組織TLR-4、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平
各組之間TLR-4mRNA表達(dá)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1)。UH組IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)均低于I組(P<0.05),且與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);UM、UL組IL-1βmRNA表達(dá)顯著低于I組(P<0.05),而TNF-α mRNA表達(dá)與I組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1)。
2.5 病理學(xué)檢查結(jié)果 大體觀察見C組大鼠肺組織呈肉粉色,質(zhì)地柔軟、彈性好。I組大鼠肺表面可見片狀出血壞死灶,彈性較差。UH、UM、UL組肺表面觀無(wú)明顯差異,整體呈肉紅色,彈性尚可,UL組偶見點(diǎn)狀出血梗死灶。光鏡下可見C組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰,肺泡腔干凈,肺泡間隔均勻一致,間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn);煙霧吸入后40h的I組大鼠肺泡腔增大,肺泡間隔增厚,腔內(nèi)可見滲出,肺泡間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤(rùn);UH組、UM組肺泡間質(zhì)炎性浸潤(rùn)均較I組明顯減輕,肺泡腔內(nèi)未見滲出,UL組肺泡腔內(nèi)滲出情況及炎細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象也較I組減輕(圖2)。
表3 煙霧吸入后40h各組血清、肺組織MPO活性及肺組織MDA含量比較(x±sx,n=6)Tab. 3MPO activity in serum and lung tissue and MDA concentration in lung tissue at 40h post smog inhalation (x±sx, n=6)
圖1 煙霧吸入后40h各組TLR-4、IL-1β、TNF-α mRNA表達(dá)水平比較(n=6)Fig. 1Expression levels of TLR-4, IL-1β and TNF-α mRNA in 5groups at 40h post smog inhalation (n=6)
研究認(rèn)為,吸入性肺損傷發(fā)生的主要原因?yàn)楫?dāng)機(jī)體吸入熱力物質(zhì)、有毒氣體或刺激性粉塵后,導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等的活化和積聚,釋放MPO、氧自由基及多種炎性細(xì)胞因子等,同時(shí),因中性粒細(xì)胞與肺組織內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生黏附而阻塞肺組織內(nèi)微血管,加重局部組織缺血缺氧,使血管內(nèi)皮通透性增加,進(jìn)一步加速肺組織水腫的發(fā)生,最終加重肺部炎癥反應(yīng)[11-12]。
目前,以地塞米松為代表的糖皮質(zhì)激素類藥物在抗炎治療中應(yīng)用較為廣泛,該類藥物具有較強(qiáng)的免疫抑制作用,能廣泛調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)多種炎性介質(zhì)的表達(dá),但因其會(huì)產(chǎn)生藥物依賴、激素抵抗等一系列不良反應(yīng),故一直不能作為臨床治療的最佳選擇。UTI是一種由肝臟分泌的具有廣譜蛋白酶抑制作用的糖蛋白,屬于內(nèi)源性抑炎介質(zhì)。在由細(xì)菌內(nèi)毒素所致的急性肺損傷大鼠模型中,UTI能有效抑制TNF-α水平和MPO活性的升高,減輕肺泡間隔炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)、水腫、出血等,也可通過(guò)降低IL-18等炎性因子及NF-κB的表達(dá),減輕肺部炎性反應(yīng)[13-14]。
圖2 肺組織病理學(xué)觀察(HE ×100)Fig. 2Histopathological observation of the lung tissues (HE ×100)
本研究使用自制的發(fā)煙裝置建立了黑火藥煙霧所致大鼠吸入性肺損傷模型,使用高、中、低3個(gè)劑量的UTI進(jìn)行干預(yù)。血?dú)夥治鼋Y(jié)果表明UTI可顯著改善吸入性肺損傷大鼠的PaO2,使之恢復(fù)正常水平,同時(shí)有效降低了UM組、UL組的PaCO2水平(P<0.05)。UH組PaCO2水平略低于I組,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),考慮與大鼠數(shù)量有限或血?dú)鉁y(cè)定時(shí)點(diǎn)差異有關(guān)。肺組織W/D以及BALF中蛋白含量是衡量肺內(nèi)微血管通透性的主要指標(biāo),本研究結(jié)果顯示,與I組相比,UTI能有效降低W/D值,同時(shí)減少蛋白滲出(P<0.05),與Qiu等[11]的研究結(jié)果一致。UH組BALF中蛋白含量雖與I組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但數(shù)值仍低于后者,考慮可能是在收集BALF時(shí)因操作不當(dāng)使標(biāo)本混入了溶血后的血液,從而導(dǎo)致所測(cè)定的蛋白水平假性增高。
MPO活性是組織中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的主要標(biāo)志。本研究結(jié)果顯示高劑量UTI能顯著降低血清及肺組織MPO的活性(P<0.05),且與BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)的變化趨勢(shì)一致,提示UTI能有效抑制中性粒細(xì)胞的滲出以及MPO的釋放,減輕肺組織損傷,從而起到保護(hù)作用。與UH組相比,UM、UL組肺組織MPO活性下降不明顯(P>0.05),考慮與UTI劑量有關(guān)。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物,其含量可反映組織中自由基的多少及脂質(zhì)過(guò)氧化程度。I組MDA含量增加表明黑火藥煙霧吸入可破壞肺組織的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu),而UH組肺組織MDA含量與I組相比顯著下降(P<0.05),表明高劑量UTI具有抗氧化作用。
TLR-4是目前研究較為廣泛的病原微生物模式識(shí)別受體,本研究結(jié)果顯示TLR-4mRNA表達(dá)在各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),提示在黑火藥煙霧吸入引起的無(wú)菌性炎癥中,TLR-4相關(guān)炎性通路可能未被激活。TNF-α是感染、燒傷等炎癥反應(yīng)中最主要的促炎性細(xì)胞因子,主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,可通過(guò)誘導(dǎo)IL-1β等其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)進(jìn)一步啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示,高劑量UTI可顯著抑制TNF-α及IL-1β mRNA的表達(dá)(P<0.05),而中、低劑量UTI則僅可減少IL-1β mRNA的表達(dá)(P<0.05),提示高劑量UTL對(duì)煙霧吸入引起的肺損傷可發(fā)揮有效的保護(hù)作用。上述結(jié)果與病理觀察變化趨勢(shì)一致。
綜述所述,本研究結(jié)果顯示UTI可通過(guò)抗炎、抗氧化對(duì)黑火藥煙霧所致大鼠肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用,且高劑量UTI可通過(guò)有效抑制IL-1β、TNF-α mRNA的表達(dá)起到更為顯著的保護(hù)效果。
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