（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

蓖麻毒蛋白前體基因的時(shí)空表達(dá)模式分析

金璐，邢超，劉陽(yáng)，莫祎，阮穎*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

蓖麻毒蛋白（Ricin）是一類異二聚體復(fù)合物，包括一條具有催化活性的A鏈和具有半乳糖識(shí)別功能的B鏈，具有劇毒性。以RC2蓖麻為材料，利用半定量PCR和定量PCR技術(shù)分析蓖麻毒蛋白前體基因的時(shí)空表達(dá)模式。結(jié)果表明，在苗期蓖麻各組織中蓖麻毒蛋白前體基因不表達(dá)，而在成熟開(kāi)花植株的各組織部位中，只在根和種子中有表達(dá)；而在種子發(fā)育過(guò)程中，授粉后1～2 d內(nèi)，子房中蓖麻毒蛋白前體基因有表達(dá)，之后伴隨種子生長(zhǎng)發(fā)育特異性表達(dá)消失；授粉后24 d，蓖麻毒蛋白前體基因再次表達(dá)，并且表達(dá)量快速增高。這一規(guī)律的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究蓖麻毒蛋白合成積累以及選育低毒蓖麻提供了重要參考。

蓖麻；毒蛋白前體基因；半定量PCR；定量PCR；基因表達(dá)

蓖麻（Riciuns communis L.），屬大戟科（Euphorbiaceae）雙子葉一年或多年生草本植物。蓖麻種子中含60%的蓖麻油，可用作合成數(shù)以百計(jì)的各種化學(xué)衍生物，有“綠色石油”之稱。去油后的蓖麻餅粕富含各種氨基酸，粗蛋白含量約為30%～40%，是普通糧食作物的3倍，但因餅粕中含有蓖麻毒蛋白（Ricin）這種劇毒性物質(zhì)致使蓖麻餅粕不能直接用于配合飼料生產(chǎn)，需經(jīng)脫毒處理［1～3］。

蓖麻毒蛋白是一種天然致命毒素，對(duì)所有哺乳動(dòng)物的有核細(xì)胞都具有毒害作用。蓖麻毒蛋白屬于Ⅱ型核糖體失活蛋白（ribosome inactivating protein，RIP）。蓖麻毒素是從蓖麻籽中提取的植物糖蛋白，分子量64 000［4］。毒素由A和B兩條多肽鏈組成，兩鏈間由一個(gè)二硫鍵連接。目前，A鏈和B鏈的氨基酸序列以及二級(jí)結(jié)構(gòu)已基本清楚。毒素B鏈上含有兩個(gè)半乳糖或半乳糖殘基結(jié)合位點(diǎn)，可和細(xì)胞表面的含半乳糖殘基的受體結(jié)合，通過(guò)內(nèi)陷作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，發(fā)揮毒性作用。蓖麻毒素A、B鏈上還分別含有1和2個(gè)糖支鏈，鏈末端均為甘露糖殘基，可以和網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞特別是巨噬細(xì)胞結(jié)合［5，6］。后者細(xì)胞表面富含甘露糖受體，可優(yōu)先攝取蓖麻毒素，這對(duì)于毒素發(fā)揮生物功能有重要的作用。研究表明，蓖麻毒蛋白由蓖麻毒蛋白前體合成，經(jīng)修飾后主要儲(chǔ)存在種子的胚乳細(xì)胞中［7，8］。從已經(jīng)發(fā)表的資料來(lái)看，現(xiàn)在還缺乏對(duì)蓖麻毒蛋白在蓖麻植株中的系統(tǒng)時(shí)空表達(dá)研究資料。

筆者在蓖麻植株及蓖麻種子生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，通過(guò)對(duì)蓖麻毒蛋白前體基因的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行系統(tǒng)研究，確定其時(shí)空表達(dá)模式，尋找出蓖麻毒蛋白合成積累與蓖麻植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程間的規(guī)律，以為進(jìn)一步研究其規(guī)律以及培育低毒蓖麻新品系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料為蓖麻（Riciuns communis）RC2，由本校植物代謝調(diào)控與代謝工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)條件

將RC2蓖麻種子播種于裝有營(yíng)養(yǎng)土的小缽中，置于生長(zhǎng)室中萌發(fā)生長(zhǎng)，后將萌發(fā)生長(zhǎng)出子葉的幼苗移栽至大缽中，置于溫室內(nèi)生長(zhǎng)，生長(zhǎng)條件是溫度25～35℃，長(zhǎng)日照（14 h光／10 h暗），定期澆水及營(yíng)養(yǎng)液。

1.2.2 取材

蓖麻苗期材料的收集。將蓖麻種子播種于小缽內(nèi)，置于生長(zhǎng)室，生長(zhǎng)到14 d后，取其子葉和根；生長(zhǎng)到20 d后，取其第一片真葉；待其繼續(xù)生長(zhǎng)7 d后，取其莖。

成熟植株和種子不同發(fā)育階段的取材。待蓖麻植株生長(zhǎng)至開(kāi)花期，分別取其根、莖、葉及受精前1 d的雌花。待其開(kāi)花后，采用人工授粉法并記錄授粉時(shí)間（day after pollination，DAP），取1、3、5、7、9、11、13和15 DAP的子房，及18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38和40 DAP的種子。

1.2.3 蓖麻RNA提取及cDNA合成

在無(wú)菌環(huán)境下，采用RNA Extraction Buffer法［9］提取蓖麻不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同器官的RNA，溶于Free-RNase水中，-80℃保存。根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）操作說(shuō)明，合成cDNA，用于半定量和定量PCR檢測(cè)。

1.2.4 序列分析及引物設(shè)計(jì)

在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）中找到蓖麻ACTIN全長(zhǎng)CDS序列，設(shè)計(jì)ACTIN引物。

RC ACTIN F：5′-ATTTCCAAGGGCGAGTATG AC-3′

RC ACTIN R：5′-CCTTTACTGACTCCCACCT CC-3′

在NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／）中找到蓖麻RICIN前體基因完整CDS序列，在基因庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)和運(yùn)用MEGA5.1軟件分析比較，尋找序列中具有高保守性的區(qū)域，設(shè)計(jì)一對(duì)RTPCR引物和一對(duì)RT-qPCR引物。

Ricin F：5′-AATATACGGGAAACAGTTGTCAA GA-3′

Ricin R：5′-GCACAACTATTGTCTTGTGCATT CT-3′

Q-Ricin F：5′-ATAGTGGGTTGGTGTTAGAT GTGAG-3′

Q-Ricin R：5′-GTGCTCTTATTAGATACTGG ACTGC-3′

1.2.5 半定量PCR和定量PCR檢測(cè)

半定量PCR檢測(cè)：測(cè)定并調(diào)節(jié)cDNA濃度至800 ng／μL，用2×Taq MasterMix（康為世紀(jì)生物公司）和半定量引物Ricin F／Ricin R擴(kuò)增目的片段，預(yù)期目的片段354 bp。反應(yīng)體系（15μL）：Ricin F／Ricin R 0.25／0.25μL，2×Taq MasterMix 7.5μL，H2O 6μL，cDNA 1μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性40 s；56℃退火40 s；72℃延伸40 s；72℃終延伸5 min，反應(yīng)從第二步至第四步循環(huán)28次。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

定量PCR檢測(cè)：測(cè)定cDNA濃度并稀釋至5 ng／μL，用2×SYBR Green／Fluorescein qPCR Master Mix（Thermo公司），儀器及分析軟件為iQ5（Bio-Rad），以引物RC ACTIN F／R為內(nèi)參，定量PCR引物Q-Ricin F／Q-Ricin R檢測(cè)目的片段，預(yù)期目的片段189 bp。反應(yīng)體系（20μL）：引物F／R 0.5／0.5 μL，2×SYBR Green Master Mix 10μL，H2O 6μL，cDNA 3μL。反應(yīng)條件：Cycle1 95℃10 min；Cycle2 95℃10 s；60℃1 min，40個(gè)循環(huán)數(shù)；Cycle3 95℃1 min；Cycle4 60℃1 min；Cycle5 60℃10 s，71個(gè)循環(huán)數(shù)。其相對(duì)表達(dá)量以2ΔΔCT法計(jì)算［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻毒蛋白前體基因的序列分析

經(jīng)BLAST比對(duì)后，找到22條高同源性且具有完整表達(dá)框的序列，通過(guò)分析，發(fā)現(xiàn)在序列CDS區(qū)3′端含有一段最為特異的序列（圖1），故選取此段作為目的檢測(cè)區(qū)域。

圖1 蓖麻毒蛋白前體基因高保守序列Fig.1 The conserved sequence ofRICINprecursor gene

2.2 蓖麻毒蛋白前體基因在苗期不同部位的表達(dá)

以蓖麻成熟種子為對(duì)照，對(duì)苗期的根、莖、真葉和子葉定量檢測(cè)，結(jié)果顯示在這些幼嫩的組織中基因的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到，說(shuō)明在蓖麻生長(zhǎng)初期蓖麻毒蛋白前體基因在各組織中并不表達(dá)。

2.3 蓖麻毒蛋白前體基因在開(kāi)花期植株不同部位的表達(dá)

利用半定量PCR，以ACTIN為內(nèi)參，檢測(cè)蓖麻開(kāi)花期成熟根、莖、葉和授粉前1 d的雌花以及成熟的種子中蓖麻毒蛋白前體基因的表達(dá)情況。結(jié)果顯示：蓖麻毒蛋白前體基因在成熟的根及種子內(nèi)有表達(dá)，但在根中的表達(dá)量相比種子明顯較弱，而成熟的莖、葉和未授粉的花中并未檢測(cè)到基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（圖2）。說(shuō)明在開(kāi)花期成熟植株的組織器官中，蓖麻毒蛋白前體基因在種子和根中有表達(dá)，而在其它部位沒(méi)有蓖麻毒蛋白前體基因的表達(dá)。

圖2 蓖麻開(kāi)花期不同成熟組織中蓖麻毒蛋白前體基因的表達(dá)結(jié)果Fig.3 Expression level ofRICINprecursor gene in differentmaturing tissues at floweringstage ofRiciuns communis

2.4 蓖麻毒蛋白前體基因在授粉后15 d內(nèi)子房中的表達(dá)

蓖麻進(jìn)入開(kāi)花期后，采用人工授粉法并記錄授粉時(shí)間，分別取授粉前1 d的雌花和授粉后1、3、5、7、9、11、13和15 d的子房。授粉后5 d，子房明顯膨大，變綠并且表面出現(xiàn)雕紋。取上述材料，分別提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以ACTIN為內(nèi)參，通過(guò)半定量PCR檢測(cè)蓖麻毒蛋白前體基因的表達(dá)情況（圖3）。結(jié)果顯示：蓖麻毒蛋白前體基因在授粉后1 d有表達(dá)，2 d后亦有表達(dá)，但表達(dá)漸弱；而其他發(fā)育時(shí)期都未檢測(cè)到蓖麻毒蛋白前體基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。說(shuō)明在子房授粉后15 d內(nèi)，在前期1～2 d內(nèi)，蓖麻毒蛋白前體基因有表達(dá)，表達(dá)由強(qiáng)變?nèi)?；從?～15 d，前體基因表達(dá)消失。

圖3 蓖麻毒蛋白前體基因在蓖麻子房授粉后15 d內(nèi)的表達(dá)Fig.3 Expression level ofRICINprecursor gene in caster fertilized ovary w ithin 15 DAP

2.5 蓖麻毒蛋白前體基因在種子授粉18 d后的表達(dá)

對(duì)授粉后18～40 d的種子樣品進(jìn)行定量PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示：以蓖麻成熟種子為對(duì)照，18～22 d的蓖麻種子中蓖麻毒蛋白前體基因表達(dá)量極低，24 d之后蓖麻毒蛋白前體基因表達(dá)量急劇增加，40 d的表達(dá)量幾乎達(dá)到了種子中的40倍（圖4）。

圖4 蓖麻毒蛋白前體基因在蓖麻子房授粉18 d后的相對(duì)表達(dá)結(jié)果Fig.4 The relative expression level of RICIN precursor gene in caster fer tilized ovary after 18 DAP

3 討論

蓖麻毒蛋白（Ricin）由蓖麻毒蛋白前體轉(zhuǎn)化而來(lái)，前體基因主要編碼三個(gè)功能區(qū)域，包括一個(gè)含有催化活性的N-端RIP結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)具有糖識(shí)別功能的C -端凝集素結(jié)構(gòu)域［11］。已有報(bào)道顯示，蓖麻毒蛋白家族中可能含有28個(gè)可編碼相似功能區(qū)域的假定家族成員，包括一些假基因和基因片段［12］。而我們從蓖麻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中，提取所有蓖麻毒蛋白前體基因的同源序列，從中選取了22個(gè)具有完整讀碼框序列進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，以高度保守的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了蓖麻毒蛋白前體基因表達(dá)檢測(cè)的引物對(duì)。通過(guò)定量和半定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)苗期的根、莖、真葉和子葉中沒(méi)有表達(dá)；在開(kāi)花期的成熟植株中，只在種子和根中有明顯表達(dá)，這種表達(dá)模式可能有利于降低蓖麻根與種子受到害蟲(chóng)的取食。綜合半定量與定量PCR的結(jié)果，在授粉后，蓖麻種子的不同發(fā)育階段，蓖麻毒蛋白前體基因的表達(dá)具有明顯特征：授粉后第1 d表達(dá)量快速上升，但是第2 d表達(dá)量開(kāi)始下降，第3 d表達(dá)停止，一直到授粉后第22 d，蓖麻毒蛋白前體基因又重新開(kāi)始表達(dá)，并且表達(dá)量急劇上升，這種表達(dá)模式有利于后期蓖麻種子中蓖麻毒蛋白的大量積累。根據(jù)蓖麻毒蛋白前體基因的這種表達(dá)模式，推測(cè)該基因可能主要是在種子的胚乳組織中表達(dá)。因?yàn)樵诔墒斓谋吐榉N子中，主要貯存物的合成積累是在胚乳細(xì)胞中。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)在種子內(nèi)胚乳發(fā)育首先形成無(wú)核胚乳，然后進(jìn)入胚乳游離核細(xì)胞化階段，最后逐漸發(fā)育為成熟的胚乳細(xì)胞，這一過(guò)程中伴隨著油和蛋白的合成代謝［13，14］。在授粉后的前19 d，蓖麻種子迅速生長(zhǎng)，其中含有約占90%的水和少量的淀粉，胚乳處于無(wú)核期，并在10～18 d內(nèi)有一個(gè)重要的轉(zhuǎn)化時(shí)期，主要以淀粉代謝為主轉(zhuǎn)化為以脂肪酸代謝為主的過(guò)程；在授粉后24～40 d，胚珠退化，胚發(fā)育完成，無(wú)核胚乳細(xì)胞化，胚乳占據(jù)了種子的大部分體積，早期在胚珠中儲(chǔ)存的淀粉也逐漸代謝為油脂儲(chǔ)存在胚乳中，同時(shí)蛋白質(zhì)也在逐漸積累增加［14］。在這期間，蓖麻毒蛋白前體基因的表達(dá)量也急劇上升，正好與胚乳的發(fā)育和胚乳中蛋白質(zhì)積累模式相一致，因此蓖麻毒蛋白應(yīng)該主要在胚乳中合成和儲(chǔ)藏。授粉后40～54 d，胚乳細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育，但已無(wú)明顯的變化［15］。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，蓖麻毒蛋白前體基因在授粉后第1 d有明顯表達(dá)，至授粉后第3 d表達(dá)終止。這種授粉受精后的短暫表達(dá)，是什么原因引起的，是在什么部位完成的？都有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

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Analysis on Spatiotem poral Expression Patterns of RICIN Precursor Gene of Ricinus communis

JIN Lu，XING Chao，LIU Yang，MO Yi，RUAN Ying*

（College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

RICIN，a heterodimeric complexwith hypertoxicity，is composed of one bind of A-chain with catalytic activity and one bind of B-chain with recognition function for galactose.In this paper，the temporal and spatial expression patterns of RICIN precursor gene in Ricunus communis was analyzed by semi-quantitative RT-PCR and real-time quantitative PCR with caster RC2 asmaterial.The results showed that the RICIN precursor gene did not express in any tissues at seedling stage，and only in the roots and seeds at the flowering stage.During the seed developing progress，the RICIN precursor gene expressed in ovaries within 1～2 days after pollination（DAP），and then silenced with the development of seeds.While on 24 DAP，the RICIN precursor gene re-expressed and the expression levelwas rapidly increased.This discovery provides important references for further research on synthesis and accumulation of RICIN and breeding of low-toxicity caster strains.

Riciuns communis；RICIN precursor gene；Semi-quantitative RT PCR；Real-time quantitative PCR；Gene expression

Q786

A

1001-5280（2014）03-0254-05 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.06

2014 03 12

金 璐（1989-），女，山西五臺(tái)縣人，碩士研究生，Email：jinlu425＠163.com。*通信作者：阮穎，教授，Email：yingruan＠hotmail.com。

國(guó)家973項(xiàng)目（2011CB111514）。