周璨林，艾薩江·圖合提，阿米拉·阿布來(lái)提，日沙來(lái)提·吐?tīng)柕兀箍枴べI買提，馬合木提·哈力克

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院資源生物研究所，烏魯木齊 830046；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011）

遺傳育種

公路對(duì)天山馬鹿（Cervus elaphus songaricus）種內(nèi)遺傳分化的影響

周璨林1，2，艾薩江·圖合提1，阿米拉·阿布來(lái)提1，日沙來(lái)提·吐?tīng)柕?，艾斯卡爾·買買提1，馬合木提·哈力克1

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院資源生物研究所，烏魯木齊 830046；2.新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011）

為研究公路對(duì)大型哺乳動(dòng)物造成的影響，分別采集新疆省道110、203、303公路兩側(cè)的天山馬鹿糞便樣本，采用5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行個(gè)體識(shí)別后利用Arlequin 3.11進(jìn)行遺傳距離、基因多樣性、雜合度等測(cè)定分析。結(jié)果表明：5個(gè)微衛(wèi)星均具有很好的多態(tài)性，5地區(qū)中松樹(shù)塘與寒氣溝、白石頭馬鹿的遺傳距離最遠(yuǎn)，松樹(shù)塘馬鹿的基因雜合度、基因型數(shù)量均最低；小西溝與白楊溝馬鹿之間遺傳距離為負(fù)值，其基因雜合度、基因型無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。說(shuō)明公路對(duì)棲息地的分割狀態(tài)不同，會(huì)導(dǎo)致種群的遺傳情況改變。當(dāng)公路僅深入棲息地沒(méi)有將棲息地割裂時(shí)，公路兩旁種群無(wú)差異；當(dāng)棲息地被公路完全隔絕，則該棲息地內(nèi)動(dòng)物的基因雜合度、基因型數(shù)量降低；使用中的公路對(duì)臨近種群的隔絕效果強(qiáng)于廢棄舊公路。

公路；天山馬鹿；遺傳分化；棲息地破碎化

道路在現(xiàn)在社會(huì)中發(fā)揮著重要的作用，但是對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)卻起了負(fù)面作用，比如污染、噪音、打攪其生活以及破壞家域。更為嚴(yán)重的是公路存在的潛在效應(yīng)，棲息地破碎會(huì)威脅道路兩旁的動(dòng)物生存，加速其滅絕。棲息地被公路或者其他人工建筑分成了許多破碎的小塊，這些公路會(huì)減少基因流，其結(jié)果將會(huì)使得種群被分割并使其數(shù)量減少。這樣的種群會(huì)進(jìn)一步受到近親交配的威脅，并喪失其遺傳多樣性。

為解決這些問(wèn)題，世界各國(guó)特別是歐洲、北美、澳大利亞等國(guó)紛紛建立了野生動(dòng)物通道。世界上第一條野生動(dòng)物通道建立于上世紀(jì)50年代美國(guó)的佛羅里達(dá)州，中國(guó)的第一條帶有野生動(dòng)物通道的公路是云南的小勐養(yǎng)高速公路［1］。中國(guó)的大多數(shù)公路設(shè)計(jì)沒(méi)有考慮野生動(dòng)物通道的建設(shè)，公路兩旁僅有小型動(dòng)物可以通過(guò)公路的排水溝等渠道穿越公路［2］，大型哺乳動(dòng)物由于需要至少寬7 m高2.4 m以上的專用通道，因而無(wú)法安全通過(guò)公路。這些大型哺乳動(dòng)物由于受到諸如體型龐大、活動(dòng)區(qū)域面積大、低種群密度以及種群增長(zhǎng)緩慢等內(nèi)在的生物屬性影響，因此對(duì)于棲息地的喪失以及破碎化特別敏感［3-4］。

天山馬鹿就是這樣的一種在生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用的大型哺乳動(dòng)物，它是國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，并且被國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟（the international union for the conservation ofnature，IUCN）列為L(zhǎng)C級(jí)。天山馬鹿是馬鹿的一個(gè)亞種，廣泛分布于天山山脈，它不僅受到種群數(shù)量小和捕獵的威脅，近親交配以及棲息地破碎化也是威脅其生存的重要因素。一些研究者已經(jīng)對(duì)于棲息地破碎化的后果進(jìn)行了研究，比如食性選擇、遺傳多樣性喪失等［5］。但是道路對(duì)于家域大小的影響大于其他自然因素。盡管歐洲第一個(gè)研究道路對(duì)大型動(dòng)物遺傳效應(yīng)的文章發(fā)表于2007年［6］，我國(guó)最早的對(duì)動(dòng)物遺傳效應(yīng)的文章發(fā)表于2006［7］，但是至今為止沒(méi)有關(guān)于道路對(duì)大型哺乳動(dòng)物遺傳效應(yīng)的研究。

天山馬鹿的棲息地被許多道路以及其他人造障礙阻隔。已有的證據(jù)表明，道路對(duì)有蹄類動(dòng)物的阻礙作用會(huì)隨著道路等級(jí)的變化而變化，高速公路的阻礙效力為1，也就是完全阻擋有蹄類動(dòng)物的遷徙與基因交流。國(guó)道和省道的阻礙效力分別是0.71～0.79和0.43～0.59［8］。這些數(shù)據(jù)都預(yù)示著在省道兩旁的有蹄類動(dòng)物的基因交流存在著阻隔效應(yīng)。但是所有的研究均沒(méi)有考慮到省道與生境之間的關(guān)系。本研究以天山馬鹿為例（C.elaphus songaricus）研究不同道路對(duì)遺傳效應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)交通情況

天山山脈的哈密地區(qū)部分被省道203、303、302將馬鹿棲息地分割為3個(gè)區(qū)域，從東到西依次為寒氣溝、松樹(shù)塘、白石頭，如圖1所示。3條公路當(dāng)中，省道203為舊公路，在省道303通車后來(lái)往車輛較少，但是野生天山馬鹿天性膽小，一般不會(huì)到公路水泥等人工硬地，且習(xí)慣于與人類保持一定距離，因此依然造成鄰近區(qū)域間馬鹿的遷徙障礙；而省道303為新公路，2003年建成通車后車流量較密集，現(xiàn)已成為哈密向北過(guò)天山的主要通路；省道302是哈密與伊吾縣之間的唯一通路，往來(lái)車輛較多。寒氣溝地區(qū)由于地處天山山脈的東部，受到省道303、302的阻擋遷徙向西遷徙困難；松樹(shù)塘地區(qū)東西兩側(cè)分別是省道203、303；白石頭地區(qū)地處哈密天山山區(qū)西部，與天山山脈主體相連。天山山脈的烏魯木齊地區(qū)被國(guó)道216分割，在國(guó)道的西側(cè)又被省道109、110分為3部分，其中靠近西部的2個(gè)地區(qū)分別是白楊溝（NB）和小西溝（NX），兩個(gè)棲息地被省道109分割，該路主要為旅游及當(dāng)?shù)啬撩窠煌ㄓ?，因此并未將山脈分割，如圖1所示。

1.2 樣品收集與DNA提取

本研究一共有5個(gè)采樣點(diǎn)，小渠子（NX）和白楊溝（NB）之間的省道并沒(méi)有將生境完全分割，在南部仍有林地相連；白石頭（BST）和松樹(shù)塘（SST）之間被舊的廢棄省道完全分割；松樹(shù)塘（SST）和寒氣溝（HQG）之間被正在使用的省道完全分割。

從2010至2011年，分別在天山山脈的哈密、烏魯木齊山區(qū)收集馬鹿糞便樣本，采集地點(diǎn)如圖1所示，每一個(gè)采集地收集的樣品數(shù)量如表1所示。糞便樣品使用純乙醇保存在-80℃冰箱中。使用日沙來(lái)提［9］改進(jìn)過(guò)的CTAB裂解法提取總DNA，提取結(jié)果和純度使用1.2%的凝膠電泳檢測(cè)。

圖1 天山馬鹿樣品采集地點(diǎn)（實(shí)線表示公路S110，S109，G216S203，S303以及S302，虛線表示馬鹿分布區(qū)）

表1 馬鹿糞便樣品來(lái)源

1.3 微衛(wèi)星擴(kuò)增與個(gè)體識(shí)別

選擇馬鹿遺傳多樣性分析中使用的具較高多態(tài)性的5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（BM888，BM4208，BM5004，BM6438，BM6506）［10］如表2所示。PCR擴(kuò)增體系為50 μL，反應(yīng)體系中含50 ngDNA，每條引物終濃度2 pM，25 μL的2× PrimeSTAR MaxPremix（TaKaRa Bio Inc.，Dalian，China）。擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性1min后30個(gè)循環(huán)，98℃解鏈10s，使用表2所示的退火溫度退火10 s，72℃延伸5 s，最后72℃30 s延伸，4℃保存。PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物利用聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)，EB顯色人工辨認(rèn)微衛(wèi)星大小。利用軟件Microsoft Excel，尋找數(shù)據(jù)中相匹配的基因型，進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。

表2 5個(gè)微衛(wèi)星引物序列

1.4 個(gè)體識(shí)別

PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物利用聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)，EB顯色，利用肉眼觀察判斷同一個(gè)體。使用POPgene 3.2軟件計(jì)算2個(gè)馬鹿群體的5個(gè)微衛(wèi)星座位哈代-溫伯格平衡值（HW），通過(guò)EXCEL microsatellite tool kit和cervus 3.0軟件尋找數(shù)據(jù)中相匹配的基因型。判斷不同樣品來(lái)自于同一個(gè)個(gè)體的原則：①所有座位上的基因型都相同；②只有1個(gè)座位上的1個(gè)等位基因存在差異。同時(shí)使用性別鑒定作為個(gè)體識(shí)別的輔助手段。

1.5 通過(guò)SRY基因進(jìn)行性別鑒定

本實(shí)驗(yàn)使用2對(duì)引物對(duì)糞便DNA進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增：引物 SRY12（5'-CTTCATTGTGTGGTCTCGTG-3'與 5'-CGGGTATTTGTCTCGGTGTA-3'）擴(kuò)增Y染色體SRY區(qū)域片段；引物BMC1009作為反應(yīng)陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照擴(kuò)增常染色體微衛(wèi)星位點(diǎn)，以防止由于實(shí)驗(yàn)失敗而錯(cuò)誤判別。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司（Sangon）合成，并用滅菌雙蒸水配制成濃度為100 μmol/L的儲(chǔ)存液備用。反應(yīng)體系：10×PCR buffer 3 μL，dNTP 3 μL，兩對(duì)引物上下游各1 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA酶1 μL，最后加入雙蒸滅菌水12 μL使總體積為25 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，95℃變性30s，61℃退火45s，72℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。

1.6 數(shù)據(jù)分析

將不同個(gè)體的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)電泳后的片段大小輸入Arlequin 3.11軟件，數(shù)據(jù)類型設(shè)為microsat，計(jì)算遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)將Markov的計(jì)算次數(shù)設(shè)為100 000，檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)為10 000，顯著性差異定位0.05；計(jì)算Hard-Weinberg平衡，使用的Markov的計(jì)算次數(shù)設(shè)為100 000，檢驗(yàn)次數(shù)設(shè)為10 000，最后進(jìn)行成對(duì)計(jì)算。使用POPgene 3.2計(jì)算Ne。使用FSTAT2軟件計(jì)算種群之間的Fst值。參照Botstein等的方法計(jì)算多態(tài)性信息（PIC，polymorphism information content）：

式中n代表等位基因數(shù)。Pi和Pj分別表示第i和第j個(gè)等位基因出現(xiàn)的頻率。

使用2種方法來(lái)描述空間的遺傳變異模式。首先，Mantel測(cè)試評(píng)估地理距離對(duì)種群分化的影響。地理距離采樣點(diǎn)的坐標(biāo)計(jì)算基于抽樣的近似中心地區(qū)。使用R-PACKAGE模塊計(jì)算地理距離之間的相關(guān)性和遺傳距離［Fst/（1-Fst）］，使用10 000次隨機(jī)化確定統(tǒng)計(jì)學(xué)差異關(guān)系。

使用Monmonier方法確定遺傳邊界，即該區(qū)域?qū)ΨN群的遺傳差異是最高的，這個(gè)方法適用于檢測(cè)突變遺傳改變。運(yùn)行BARRIER version 2.2程序，應(yīng)用Monmonier的最大差分算法以后，使用Delaunay三角測(cè)量法分別對(duì)哈密以及烏魯木齊的種群進(jìn)行連接。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鹿種群的遺傳多樣性

本研究結(jié)果顯示，449份糞便來(lái)自251個(gè)個(gè)體，其中來(lái)自白楊溝的127份糞便屬于60個(gè)個(gè)體；來(lái)自小渠子的128份糞便屬于51個(gè)個(gè)體；來(lái)自松樹(shù)塘的41份糞便屬于32個(gè)個(gè)體；來(lái)自白石頭的87份糞便屬于66個(gè)個(gè)體；來(lái)自寒氣溝的66份糞便屬于42個(gè)個(gè)體。雌雄比為2.24:1。

使用Arlequin 3.11軟件分析5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在各地天山馬鹿的遺傳距離，兩兩比較獲得Fst結(jié)果如表3所示，各地的遺傳距離的P值除烏魯木齊的白楊溝、小渠子之間以外均小于0.05，差異顯著。使用Markov鏈?zhǔn)綑z驗(yàn)方法，分別計(jì)算白楊溝、小渠子、松樹(shù)塘、白石頭、寒氣溝5地區(qū)5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Hardy-Weinberg平衡，結(jié)果表明5個(gè)位點(diǎn)在馬鹿種群中的期望雜合度（He）的變化范圍為0.69～0.72，平均0.71；雜合度的觀測(cè)值（Ho）變化范圍為0.75～0.91，平均0.83。5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)中多態(tài)信息含量0.47～0.75，其中BM4208位點(diǎn)多態(tài)信息最多，平均值為0.69。有效等位基因數(shù)（Ne）2.23～4.46，Shannon’s系數(shù)（I）0.96～1.55（表4）。

選擇Arlequin3.11軟件計(jì)算等位基因差異數(shù)（Fst）作為衡量遺傳距離的單位，其結(jié)果表明，除了烏魯木齊地區(qū)的白楊溝（NB）與小渠子（NX）種群之間的遺傳差異為負(fù)值外，其余所有的地區(qū)之間Fst差異顯著，最大的Fst來(lái)自于哈密地區(qū)的松樹(shù)塘（SST）和寒氣溝（HQG）之間，如表3和圖2所示。

表3 各天山馬鹿群體間遺傳距離的比較

表4 5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在天山馬鹿兩個(gè)種群中的遺傳參數(shù)

圖2 5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在天山馬鹿兩個(gè)種群中的遺傳參數(shù)

3 討論

傳統(tǒng)的野生動(dòng)物樣品采集方式多為捕捉、獵殺等方式。為減少樣品采集時(shí)對(duì)野生馬鹿的傷害，不打擾其野外生活，本研究采用非損傷性采樣法，利用新鮮糞便提取表面脫落腸道細(xì)胞中的DNA，因此樣品存在多次采樣的情況。為排除重復(fù)取樣對(duì)本研究的干擾，首先使用5個(gè)微衛(wèi)星引物 BM888、BM4208、BM5004、BM6438、BM6506進(jìn)行個(gè)體識(shí)別，判斷不同樣品來(lái)自于同一個(gè)個(gè)體的原則是：①所有座位上的基因型都相同；②只有一個(gè)座位上的一個(gè)等位基因存在差異［11］。

天山山脈是新疆的主要山脈之一，被分為東天山與西天山。東天山山脈僅有的兩條穿山公路均為省道且都在哈密境內(nèi)，二者距離較近；西天山山脈的穿山公路均為國(guó)道，省道均未穿越天山山脈。本研究所選的天山山脈烏魯木齊地區(qū)以及哈密地區(qū)分別屬于東天山與西天山，而所分析的公路依據(jù)對(duì)棲息地的割裂方式以及使用情況，分為如下幾類：省道110屬于對(duì)棲息地的入侵，會(huì)對(duì)馬鹿的生活造成干擾，但不會(huì)完全割裂小渠子與白楊溝之間的基因交流，沒(méi)有將兩地生境分開(kāi)；省道203屬于舊公路，雖然穿過(guò)天山山脈，完全割裂了松樹(shù)塘與白石頭之間的基因交流，曾經(jīng)被人類使用，但現(xiàn)在幾乎不再使用，因此兩地之間的馬鹿曾經(jīng)完全隔離，但是現(xiàn)在兩地之間存在相互交流的可能性；省道303為新建公路，其中的南北段穿過(guò)天山山脈，完全將寒氣溝與松樹(shù)塘分開(kāi)，因此本研究幾乎涉及了各類影響棲息地類型的公路。

松樹(shù)塘地區(qū)東西兩側(cè)分別被兩條省道阻隔，雖然和其余兩地區(qū)緊鄰，地理距離均在5 km以內(nèi)，但是松樹(shù)塘與其他兩地的遺傳距離差異極顯著，是哈密地區(qū)3地間遺傳距離的最大值和最小距離。這是由于松樹(shù)塘地區(qū)與寒氣溝地區(qū)之間是新省道303，該路段地勢(shì)相對(duì)就省道平坦，且海拔低無(wú)盤山路段，一年四季車流不斷，特別秋季是煤炭、牧草等運(yùn)輸?shù)闹饕獣r(shí)段，而馬鹿的發(fā)情期是10月，公路車流使得兩地區(qū)之間難以相互交配，而省道203則車流稀疏，松樹(shù)塘地區(qū)與白石頭地區(qū)間的馬鹿種群基因交流相對(duì)方便。松樹(shù)塘地區(qū)的馬鹿基因型平均值31.6 ，雜合度0.76，均為研究區(qū)域中的最小值，這是由于該地區(qū)難以與鄰近地區(qū)的馬鹿進(jìn)行基因交流，加之地形較小（約43 km2），種群數(shù)量十分有限，因此更易受到遺傳漂變的影響喪失遺傳多樣度，并且由于種群數(shù)量少，近親交配風(fēng)險(xiǎn)增高，導(dǎo)致雜合度降低，基因型丟失。白石頭地區(qū)與松樹(shù)塘地區(qū)緊鄰，與寒氣溝地區(qū)地理距離較遠(yuǎn)，從遺傳距離看，白石頭地區(qū)馬鹿與松樹(shù)塘地區(qū)馬鹿遺傳距離較寒氣溝地區(qū)馬鹿之間近。表面上看似乎是遺傳距離是地理距離的反映，但是考慮到寒氣溝地區(qū)的馬鹿與鄰近的松樹(shù)塘馬鹿遺傳距離遠(yuǎn)，而與地理較遠(yuǎn)的白石頭地區(qū)馬鹿遺傳距離相對(duì)較近，那么白石頭地區(qū)與寒氣溝地區(qū)之間的基因交流就不是通過(guò)松樹(shù)塘地區(qū)作為中轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)的，它們之間還可以通過(guò)省道以西地區(qū)進(jìn)行交流。省道302對(duì)省道303有分流作用，因此馬鹿可能是以302以西地區(qū)為中介，在白石頭地區(qū)與寒氣溝地區(qū)間偶有交流。從基因型數(shù)量來(lái)看，白石頭地區(qū)馬鹿是63.6，為所有研究區(qū)域中最高值，雜合度的觀測(cè)值則低于寒氣溝地區(qū)馬鹿，但是二者沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這種基因型數(shù)量與高雜合度較豐富的原因，是由于白石頭地區(qū)西側(cè)和東天山山脈主體相連，白石頭地區(qū)馬鹿可以在東天山的廣大區(qū)域內(nèi)自由遷徙造成的。寒氣溝地區(qū)位于哈密的最東側(cè)，處于整個(gè)東天山山脈的末端，雖然整個(gè)寒氣溝地區(qū)內(nèi)部再無(wú)公路將其分割，但是由于總面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于白石頭地區(qū)及以西地區(qū)，因此該地區(qū)馬鹿雜合度的觀測(cè)值與白石頭地區(qū)相當(dāng)，但是基因型數(shù)量依然低于白石頭地區(qū)。

對(duì)于天山山脈烏魯木齊山區(qū)的小渠子、白楊溝兩地的遺傳分析顯示，兩者之間的遺傳距離為負(fù)值，說(shuō)明兩地之間的馬鹿實(shí)際為同一種群。小渠子、白楊溝兩地之間是省道110，但是該公路并未穿過(guò)天山山脈，因此兩地之間的天山馬鹿可以自由往來(lái)，遺傳分析結(jié)果也印證了這種地理結(jié)構(gòu)。

4 結(jié)論

如果公路完全分割棲息地，則以馬鹿為代表的大型哺乳動(dòng)物在公路兩側(cè)的相互基因交流就會(huì)受阻，如果其中一部分棲息地較小則更容易失去遺傳多樣性，容易滅絕。因此，在未來(lái)的道路施工中應(yīng)當(dāng)增加對(duì)棲息地保護(hù)，對(duì)已有公路進(jìn)行改造，以方便基因交流，這樣才能更好地保護(hù)其遺傳多樣性，避免種群的滅絕。

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Effects of Road on Genetic Differentiation of Tianshan Red Deer（Cervus elaphus songaricus）

Zhou Canlin1，2，Aysajan Tohti1，Mahmut Halik1，et al
（1.College ofLife Science and Technology，XinjiangUniversity，Urumqi 830046，China；2.Basic Medical College，XinjiangMedical University，Urumqi 830046，China）

To study the effects of highway on large mammals，Tianshan red deer fece samples from the both side of road S110，203，303 were collected.After the individual recognition by5 kinds ofmicrosatellite，the genetic diversity，genetic distance，heterozygositywere determined usingArlequin 3.11.The results showed that the five kinds ofmicrosatellites had good polymorphism，the highwayor road on habitat fragmentation could lead topopulation genetic change.When the road did not isolate the habitat，the populations along highways had no difference；when the habitat was completely isolated by highway，the heterozygosity and the number of genotypes decreased；The isolation effect of highway in use on the population was stronger than that of the road abandoned.

highway；Tianshan red deer；genetic differentiation；habitat fragmentation

S825.2

A

2095-3887（2014）06-0005-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.06.001

2014-08-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060152)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2010211A02）；新疆大學(xué)自治區(qū)重點(diǎn)學(xué)科-動(dòng)物學(xué)科資助

周璨林（1980-），男，副教授，博士。

馬合木提·哈力克（1959-），男，維吾爾族，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事哺乳動(dòng)物的保護(hù)遺傳學(xué)及其分子進(jìn)化研究。