呂春榮，李衛(wèi)娟，權(quán)國波，洪瓊花

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224）

云南半細毛羊毛囊干細胞微生物污染檢測

呂春榮，李衛(wèi)娟，權(quán)國波，洪瓊花

（云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，昆明 650224）

為檢測云南半細毛羊毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）是否受到微生物污染，為后續(xù)的誘導(dǎo)分化等研究奠定基礎(chǔ)。用培養(yǎng)法檢測細菌、真菌污染；利用熒光染色劑Hoechst33342檢測支原體污染。結(jié)果表明：實驗組細胞和陰性對照中均沒有發(fā)現(xiàn)細菌污染，實驗組中有25%的細胞受到霉菌污染；實驗組細胞經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，僅細胞核顯色，細胞表面及細胞周圍干凈、清晰，無熒光小點。說明云南半細毛羊HFSCs沒有細菌、支原體污染，僅有25%細胞受到霉菌污染。霉菌孢子對環(huán)境的耐受力很強，普通的消毒液很難清除，所以對操作環(huán)境帶來嚴重危害。

云南半細毛羊；HFSCs；污染

污染是細胞培養(yǎng)過程中長期面臨的問題。物理、化學(xué)及生物因素都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境對細胞造成污染。造成動物細胞培養(yǎng)體系污染的主要微生物是細菌、真菌、支原體等。入侵的微生物在培養(yǎng)體系中不斷增殖、代謝。微生物代謝消耗大量必需的養(yǎng)分，同時產(chǎn)生多種有毒的代謝產(chǎn)物，進一步對細胞產(chǎn)生毒害作用［1］。

培養(yǎng)細胞作為一個生物體，會對培養(yǎng)環(huán)境以及環(huán)境中的污染物做出相應(yīng)的反應(yīng)，造成培養(yǎng)細胞生物學(xué)特性改變，而對實驗結(jié)果造成潛在威脅，并隨著污染時間的延長而增加，使研究結(jié)果的真實性和可靠性大大下降。American Type Culture Collection（ATCC）和日本理化研究所制訂了標(biāo)準(zhǔn)化細胞系的細胞庫細胞培養(yǎng)物的支原體污染的檢測條例。中國科學(xué)院細胞庫也把對支原體污染的檢測作為最基本的質(zhì)量控制。因此，對所培養(yǎng)細胞進行微生物污染檢測尤為重要。本文對實驗室所分離培養(yǎng)的云南半細毛羊HFSCs進行微生物污染檢測，為以后有關(guān)云南半細毛羊HFSCs進一步的研究奠定堅實的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毛囊干細胞

來自于云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院草食家畜研究所2012年冷凍保存的不同代次的云南半細毛羊HFSCs 16支（第二代至第九代各2支為實驗組）；細菌、真菌陰性對照：DMEM／F12培養(yǎng)基各2支；細菌、真菌陽性對照：將枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌分別接種到DMEM／F12培養(yǎng)基；支原體陽性對照：選取典型的支原體污染檢測照片作為陽性對照。

1.2 方法

1.2.1 細菌、真菌檢測

1）實驗組：將復(fù)蘇后的HFSCs細胞懸液接種到DMEM／F12培養(yǎng)基中，置于37.5℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。

2）陽性對照組：將枯草芽孢桿菌和白假絲酵母菌分別接種到DMEM／F12培養(yǎng)基中，置于37.5℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。

3）陰性對照組：DMEM／F12培養(yǎng)基各2支，置于37.5℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。

1.2.2 支原體檢測

1）陽性對照：選取典型的支原體污染檢測照片作為陽性對照。

2）實驗組：將被檢HFSCs爬片在不含抗生素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2～3 d后，吸去培養(yǎng)液，用PBS漂洗，冷風(fēng)吹干。用固定液固定細胞爬片15 min。然后將配制好的Hoechst33342工作染液滴加到固定好的細胞上，在室溫下染色，30 min后用PBS浸洗染色后的蓋玻片3次，每次3～5 min，冷風(fēng)吹干。最后將含1%甘油的PBS加到染色后的細胞表面，將有細胞的蓋玻片面朝下覆蓋在載玻片上。封片處理完畢后晾干，用熒光顯微鏡觀察細胞核周圍是否有藍色熒光小點或絲狀點的熒光物產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌、真菌污染檢測結(jié)果

HFSCs的培養(yǎng)基和陰性對照一樣，沒有混濁，倒置顯微鏡高倍鏡下也沒有觀察到點狀的細菌；實驗組中有4支細胞在96 h后在細胞瓶壁可以見到明顯的成片或是成塊狀的霉菌菌落，在倒置相差顯微鏡下能見到成樹枝狀生長的菌絲，如圖1E所示。陽性對照均有明顯微生物生長，在倒置鏡下可見視野內(nèi)布滿點狀的細菌顆粒，原來清晰的背景變得模糊，如圖1A所示。成樹枝狀的霉菌如圖1B所示。

2.2 支原體檢測結(jié)果

陰性對照組和實驗組細胞經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，僅細胞核顯色，細胞表面及細胞周圍干凈、清晰，無熒光小點，如圖1F所示。陽性對照組經(jīng)Hoechst33342熒光染色后，可見細胞核與細胞膜及其周圍均可見散在的藍色熒光顆粒，如圖1C所示。

圖1 微生物污染檢測

3 討論

3.1 真菌污染

霉菌孢子對環(huán)境的耐受力很強，普通消毒液很難清除，所以對操作環(huán)境帶來嚴重危害。37℃的培養(yǎng)溫度已經(jīng)超過霉菌最適生長溫度（25℃左右），因而其生長速度更慢，一般培養(yǎng)96 h時肉眼才能觀察到棉絮狀的菌絲團等漂浮在培養(yǎng)液中［3］。霉菌污染后在低倍鏡下可見乳白色的團狀漂浮物，培養(yǎng)液無變化；高倍鏡下可見明顯的菌絲，細胞活力變差，生長速度明顯變慢，甚至死亡［4］。

本實驗對16支云南半細毛羊HFSCs進行真菌污染檢測，有25%的細胞受到霉菌污染。霉菌污染率偏高，污染細胞集中在第四、五代細胞。這主要是受實驗室培養(yǎng)環(huán)境及今年6、7月份云南降雨量較大、環(huán)境潮濕易發(fā)生霉菌污染所致。

3.2 支原體污染

細胞培養(yǎng)體系造成污染的微生物主要是細菌、真菌、支原體等，細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是很普遍的問題，做好支原體污染的防治工作，是保證實驗順利進行的重要一環(huán)。支原體污染，對體外培養(yǎng)的細胞幾乎所有的指標(biāo)及產(chǎn)物均有影響，而且可以不被察覺地隨著細胞的傳代而傳代［5-9］。

支原體污染的來源包括：所使用動物來源的一些產(chǎn)品如血清或已被支原體污染的細胞株系。細胞培養(yǎng)上清液中支原體的濃度可達107個/mL，而培養(yǎng)的細胞看起來很正常，在肉眼觀察或普通光學(xué)顯微鏡下觀察，受污染的細胞可無明顯變化［2］。體外培養(yǎng)的細胞被支原體污染后，幾乎所有的指標(biāo)及產(chǎn)物均受其影響，故有效地檢測支原體污染是細胞實驗成功的關(guān)鍵所在［10］。Chen［11］率先使用非特異性的DNA熒光染料Hoeehst33255，直接對可貼壁生長細胞培養(yǎng)物作DNA熒光染色，檢測支原體污染，擴大了可被檢出的支原體種類，縮短和簡化了檢測過程。其原理為：染色劑能透過胞膜完整的細胞，嵌入細胞核DNA中，結(jié)合到DNAA-T富含區(qū)域。而支原體A-T含量較高（55%～80%），亦能著色，在熒光顯微鏡下觀察可看到藍色熒光。因此，污染了支原體的細胞表面會有藍色點狀或絲狀熒光［12］。所以可將其染色、檢測。用熒光染色劑染色的細胞在熒光顯微鏡下觀察，無支原體污染的細胞只有細胞核顯色。而有支原體污染的細胞，在細胞核外與細胞核表面會出現(xiàn)藍色熒光小點或絲狀點，其形狀一致，這與細胞殘片染成不規(guī)則點狀物不同。Hoechst作為熒光染色劑，從原理上來說都可以用于DNA熒光染色檢測支原體污染，大多數(shù)學(xué)者用Hoechst33258來檢測細胞支原體污染［13-15］。也有學(xué)者用Hoechst33342對細胞進行支原體檢測［16］。這兩種染色劑的不同點在于：后者對細胞的毒性作用更小一些，可以對活細胞直接進行染色。本實驗通過Hoechst33342熒光染色檢測支原體污染，僅細胞核顯色，細胞表面及細胞周圍干凈、清晰，無熒光小點。說明所培養(yǎng)的云南半細毛羊HFSCs并未受到支原體污染。

除了用熒光染色法檢測支原體以外，現(xiàn)在用得比較多的方法還有PCR法檢測支原體：先采用酚氯仿法提取標(biāo)本DNA，再從6種常見污染細胞的支原體16sRNA中選擇2段高度保守的核酸序列作為引物，總長度為472 bp，引物A：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，引物B：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。利用建立的PCR反應(yīng)體系和條件，對細胞進行擴增。瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測儀觀察并用凝膠成像系統(tǒng)照相。此方法與DNA熒光染色法相比：敏感、特異性強，但價格比較昂貴。

微生物污染控制在一定程度上直接影響和反映一個國家的生物技術(shù)發(fā)展水平。所以，如何有效控制及預(yù)防微生物污染是廣大科研工作者長期面臨的巨大挑戰(zhàn)和重要研究課題。

［1］李穎健，劉志紅.細胞培養(yǎng)污染的途徑、危害及預(yù)防措施［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，1999，8（3）：245-249.

［2］劉玉琴.體外培養(yǎng)細胞工作中支原體污染及對策［J］.中華病理學(xué)雜志，2004，33（6）：571-572.

［3］曾衛(wèi)東，董青.動物細胞培養(yǎng)中微生物污染的檢測［J］.浙江畜牧獸醫(yī)，2003（2）：12.

［4］田啟超，張濤，田麗芳，等.細胞體外培養(yǎng)過程中霉菌污染的預(yù)防［J］.動物醫(yī)學(xué)進展，2007，28（8）：115-116.

［5］Wirth M，Berthold E，Grashoff M，et al.Detection of mycoplasma contaminations by the polymerase chain reaction［J］.Cytotechnology，1994，16（2）：67-77.

［6］王正森，吳建新，趙小元，等.用PCR檢測細胞培養(yǎng)中支原體污染［J］.生物化學(xué)與生物物理進展，1994，21（6）：553-556.

［7］Uphoff C C，Drexler H G.Detection of mycoplasma contaminations in cell cultures byPCR analysis［J］.HumCell，1999，12（4）：229-236.

［8］Uphoff C C，Drexler H G.Detecting mycoplasma contamination in cell cultures by polymerase chain reaction［J］.Methods Mol Med，2004，88：319-326.

［9］Wang H，Kong F，Jelfs P，et al.Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization［J］.Appl Environ Microbiol，2004，70（3）：1483-1486.

［10］Zinzendorf N Y，Kouassi-Agbessi B T，Lathro J S，et al.Ureaplasma urealyticum or mycoplasma hominis infections and semen quality of infertile men in Abidjan［J］.J ofReprod Contracept，2008，19（2）：65.

［11］Chen T R.In situ detection of mycoplasma contamination in cell culture by fluorescent Hoeschst-33258 stain［J］.Exp Cell Res，1977，104：255-262.

［12］Barile M E，Rottem S.Mycoplasmas in cell culture//I Kahane and A［M］.Adoni（ed.）.Rapid diagnosis of mycoplasmas.NewYork：Plenum Press，1993：155-193.

［13］劉謀淵，劉嵐，趙嬌，等.動物細胞培養(yǎng)中支原體污染的檢測方法比較研究［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2011，27（5）：682-683.

［14］FreshneyR I.Culture ofanimal cells：A manual of basic technique［M］. 4th edn.NewYork：Wiley-Liss，2000：149-175.

［15］劉嵐，陳紹坤，余紅.貼壁細胞培養(yǎng)過程中支原體污染的幾種救治方案療效比較研究［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2008，24（8）：1221-1222.

［16］Wu S S，Li D J，Lv C R，et al.Establishment and cryopreservation of a skin fibroblast cell line derived from Yunnan semi-fine wool sheep in the presence of synthetic ICE Blocker［J］.Cryoletters，2013，34（5）：497-507.

Q813.1+1

A

2095-3887（2014）06-0046-03

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.06.013

2014-09-16

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)（CARS-40-06）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項目（2012FD083）

呂春榮（1982-），女，助理研究員，碩士。

洪瓊花（1968-），女，白族，研究員，碩士，主要從事綿羊、山羊的育種和高效繁殖新技術(shù)研究。