孫雪婧，高雪晉，李積友，杜曉華，劉 霞，楊孝樸

（1．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3.甘肅省畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)管理局；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

遺傳育種

甘肅武威西門塔爾牛MSTN基因外顯子遺傳變異的研究

孫雪婧1，高雪晉2，李積友3，杜曉華1，劉 霞4，楊孝樸5

（1．甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院；3.甘肅省畜牧業(yè)產(chǎn)業(yè)管理局；4.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；5.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

為分析肉牛MSTN基因的遺傳多態(tài)性及變異特征，采用PCR-SSCP方法檢測了60頭甘肅武威西門塔爾牛MSTN基因的多態(tài)性，對群體內(nèi)各等位基因進(jìn)行了克隆測序。結(jié)果顯示：武威西門塔爾牛MSTN基因第1外顯子存在A、B兩個(gè)等位基因以及AA、AB兩種基因型，基因型頻率分別為0.916 7、0.083 3；第2外顯子存在A、B兩個(gè)等位基因以及AA、BB、AB三種基因型，基因型頻率分別為0.5、0.25、0.25。序列分析表明，武威西門塔爾牛MSTN第1外顯子在269 bp發(fā)生了A→G的突變，第2外顯子在41 bp發(fā)生了C→T的突變，二者均屬于同義突變。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，武威西門塔爾牛MSTN基因第1外顯子呈低度多態(tài)，第2外顯子呈中度多態(tài)，外顯子3沒有發(fā)生突變。

MSTN基因；遺傳多態(tài)性；西門塔爾牛

肌肉生成抑制素（myostatin,MSTN）又稱生長分化因 子8（growth differentiation factor 8,GDF-8），是轉(zhuǎn)化生長因子超家族中的一員，對肌肉的分化和生長有負(fù)調(diào)控功能［1］。研究發(fā)現(xiàn)該基因的缺失、插入或突變會(huì)引起肌細(xì)胞增生與肌纖維肥大，從而提高產(chǎn)肉力，表現(xiàn)出“雙肌”性狀［2］，在肉用家畜的品種選育上有重要作用。

近幾年來對MSTN基因的研究一直十分活躍，對牛、綿羊、山羊、豬、馬等家畜MSTN基因的多態(tài)性也都有相關(guān)的研究報(bào)道［3-5］。但有關(guān)西門塔爾牛MSTN基因的研究鮮見報(bào)道。甘肅省武威市為改良本地河西黃牛產(chǎn)肉產(chǎn)奶性能，從1980年開始引用乳肉兼用型西門塔爾牛凍精與本地牛雜交［6］，為觀察其后代的遺傳穩(wěn)定性，本研究采用PCR-SSCP方法對60頭甘肅武威西門塔爾牛MSTN基因進(jìn)行多態(tài)性分析，探討武威西門塔爾牛群體MSTN基因的分子遺傳特性，為武威西門塔爾牛MSTN基因的分子生物學(xué)研究及其分子育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 血樣采集

隨機(jī)選取甘肅省武威市60頭西門塔爾牛，每頭牛頸靜脈采血10 mL，ACD（酸性檸檬酸葡萄糖）抗凝，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器

蛋白酶K、Tris平衡酚購自大連寶生物工程有限公司；丙烯酰胺、硼酸、乙二胺四乙酸（EDTA）購自Amersco公司；過硫酸銨購自煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；去離子甲酰胺、TEMED購自Sigma公司；甲叉購自上海生工生物工程股份有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix購自北京百泰克生物技術(shù)公司；DNAmarker購自上海捷瑞生物工程有限公司；其他常規(guī)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純級產(chǎn)品。梯度PCR儀為美國ABI公司生產(chǎn)；PROTEANⅡxi Cell雙垂直電泳槽、Powerpac Universal電泳儀：美國BIO-RAD公司生產(chǎn)；F32加熱／制冷循環(huán)儀：德國Julabo公司生產(chǎn)。

1.3 基因組DNA的提取

用酚-氯仿法從血樣中提取甘肅武威西門塔爾?；蚪MDNA，-20℃凍存。

1.4 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

參考GenBank中的牛（AC_000159）MSTN基因序列，用在線設(shè)計(jì)引物軟件Primer3.0設(shè)計(jì)3對引物，由北京六合華大基因有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 武威西門塔爾牛MSTN基因3個(gè)外顯子的引物序列及預(yù)擴(kuò)增片段長度

PCR反應(yīng)體系為20 μL：7.4 μL ddH2O，引物F和R各0.4 μL，2×Power Taq PCR MasterMix 11 μL，0.8 μL模板。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，外顯子1、2、3的退火溫度分別為57℃、56℃、58℃，退火時(shí)間為30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 SSCP檢測

取2 μL的PCR產(chǎn)物加入8 μL的變性上樣緩沖液（980 mL/L去離子甲酰胺，0.25 g/L溴酚藍(lán)，0.25 g/L二甲苯青，pH值8.0，0.01 mol/LEDTA），105℃變性10 min，立即冰浴10 min。3個(gè)片段均用100 g/L的非變性聚丙烯酰胺凝膠（Acr:Bis的質(zhì)量比39:1），膠濃度均為14%，電壓分別為150、180和180 V，電泳時(shí)間為24、22和22 h，溫度條件分別為4℃、10℃和10℃，銀染法顯色后拍照。將PCR產(chǎn)物送北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測序。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用DNAStar軟件包中的EditSeq和MegAlign程序進(jìn)行DNA序列的剪切校對、比對和翻譯，堿基組成一致的序列判定為同種等位基因?；蛐皖l率、基因頻率統(tǒng)計(jì)和X2檢驗(yàn)、基因雜合度（heterozygosity,He）及有效等位基因數(shù)（effective number of alleles,Ne）檢測利用POPGENE（版本1.32）軟件完成，多態(tài)信息含量（polymorphism information content,PIC）利用PIC_Calc（版本0.6）軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

甘肅武威西門塔爾牛MSTN基因3個(gè)外顯子擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，與預(yù)期擴(kuò)增片段的長度相符，且條帶清晰明亮無雜帶，可直接用于SSCP分析（圖1）。

圖1 武威西門塔爾牛MSTN基因3個(gè)外顯子的PCR擴(kuò)增

2.2 SSCP檢測

SSCP分析結(jié)果顯示，所檢測的60頭武威西門塔爾牛中發(fā)現(xiàn)第1外顯子受A、B兩個(gè)等位基因控制，存在AA、AB兩種基因型；第2外顯子受A、B兩個(gè)等位基因

控制，存在AA、BB、AB三種基因型；第3外顯子只有AA 一種基因型，無多態(tài)（圖2、圖3）。

圖2 武威西門塔爾牛MSTN基因外顯子1 SSCP檢測

圖3 武威西門塔爾牛MSTN基因外顯子2 SSCP檢測

2.3 序列分析

對具有多態(tài)性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，得到甘肅武威西門塔爾牛MSTN基因第1外顯子396 bp的核苷酸序列、第2外顯子382bp的核苷酸序列和第3外顯子404bp的核苷酸序列。外顯子1中的AB型與AA型相比，AB型的核苷酸序列在第269 bp處發(fā)生A→G突變（圖4），密碼子由GAA變?yōu)镚AG，突變前后所編碼的氨基酸均為谷氨酸，為同義突變。外顯子2中的AB（BB）型與AA型相比，AB（BB）型的核苷酸序列在第41 bp處發(fā)生C→T突變（圖5），密碼子由UGC變?yōu)閁GU，突變前后所編碼的氨基酸均為半胱氨酸，也為同義突變；第3外顯子核苷酸序列沒有突變。

圖4 外顯子1 AA，AB基因型位于269 bp處突變的測序峰圖

圖5 外顯子2 AA,AB和BB基因型位于41 bp處突變的測序峰圖

2.4 遺傳多態(tài)性分析

對60頭武威西門塔爾牛MSTN基因3個(gè)外顯子的等位基因的基因型頻率、基因頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，并計(jì)算了其純合度、雜合度和多態(tài)信息含量值，結(jié)果見表2。

由上表2可以看出，武威西門塔爾牛MSTN基因第1外顯子和第2外顯子中A等位基因是群體中的優(yōu)勢等位基因，并且由表中He、Ne及PIC值也可得出第1外顯子表現(xiàn)為低度多態(tài)，第2外顯子表現(xiàn)為中度多態(tài)。第3外顯子沒有突變位點(diǎn)。

X2檢測結(jié)果顯示，第1外顯子2個(gè)基因型、第2外顯子3個(gè)基因型均在武威西門塔爾牛群體中處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

表2 武威西門塔爾牛MSTN基因3個(gè)外顯子的等位基因頻率、基因型頻率及一些相關(guān)的多態(tài)性指標(biāo)

3 討論與結(jié)論

MSTN基因作為肌肉生長的負(fù)調(diào)控因子，它的缺失會(huì)使一些動(dòng)物表現(xiàn)出“雙肌”性狀，雙肌牛具有較多的白色肌纖維和分枝軸突末梢，肌肉中的膠原蛋白含量少，故雙肌牛肉肉質(zhì)較嫩。此外，雙肌牛肉中白纖維比例高而肌紅蛋白含量降低而造成肌肉顏色較淺，故對MSTN基因突變的研究是提高牛肉品質(zhì)性狀的主要途徑。目前，關(guān)于牛MSTN基因的研究多，該基因雖然在進(jìn)化過程中很保守，但也存在一定的多態(tài)性［4］。Kambadur等［7］和Miranda等［8］在研究比利時(shí)藍(lán)牛“雙肌”性狀時(shí)發(fā)現(xiàn)，MSTN基因第3外顯子存在一個(gè)11 bp的缺失，使得在缺失位點(diǎn)下游形成一個(gè)終止密碼子，導(dǎo)致MSTN基因C-末端僅7個(gè)氨基酸得到翻譯，翻譯出一個(gè)截?cái)嗟牡鞍?，從而失去了原來抑制肌肉生長的特性，使肌肉過度發(fā)育增大。造成比利時(shí)藍(lán)牛產(chǎn)生“雙肌”性狀。Lee等［9］在皮埃蒙特牛MSTN基因中發(fā)現(xiàn)某些單核苷酸替換也導(dǎo)致了MSTN蛋白質(zhì)功能的喪失。Grobet等［10］檢測了分布于歐洲的10種牛種中32個(gè)雙肌牛個(gè)體的MSTN基因編碼序列，發(fā)現(xiàn)7個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，其中5個(gè)導(dǎo)致該基因功能蛋白突變，在內(nèi)含子區(qū)有4個(gè)DNA序列的多態(tài)性。

本研究利用PCR-SSCP方法分析了武威西門塔爾牛MSTN基因3個(gè)外顯子的多態(tài)性，結(jié)果表明，武威西門塔爾牛MSTN基因第1外顯子在269 bp發(fā)生了A→G的突變，存在AA、AB兩種基因型；第2外顯子在41 bp發(fā)生了C→T的突變，存在AA、BB、AB三種基因型，而且這兩處突變均未導(dǎo)致氨基酸的改變。在對60頭武威西門塔爾牛群體基因型的檢測中，外顯子1只發(fā)現(xiàn)5例AB型突變雜合體，未檢測到BB型，其基因型頻率遠(yuǎn)低于AA型，表明等位基因B在進(jìn)化及群體遺傳過程中受到一定的選擇壓力，其純合個(gè)體可能由于某種原因被自然選擇或人工選擇所淘汰，導(dǎo)致BB型在群體遺傳過程中被稀釋或消失，推測該過程可能是一種完全淘汰隱性基因的選擇效應(yīng)，而A等位基因在人工選育過程中則受到正向選擇，處于優(yōu)勢地位。Wheeler等［12］發(fā)現(xiàn)不同MSTN突變的基因型對皮埃蒙特牛的各部位肌肉嫩度等指標(biāo)存在顯著影響。武威西門塔爾牛第1外顯子和第2外顯子的突變是否會(huì)對整個(gè)MSTN蛋白表達(dá)及其在群體中的遺傳效應(yīng)產(chǎn)生影響，還有待更進(jìn)一步的研究證實(shí)。

多態(tài)信息含量（PIC）和雜合度（He）都是群體內(nèi)遺傳變異的測度，其值的高低反映了群體內(nèi)個(gè)體的均質(zhì)度，遺傳變異大，數(shù)值就高。Botstein D等提出了確定位點(diǎn)多態(tài)性的標(biāo)準(zhǔn)：PIC＞0.5為高度多態(tài)，PIC＜0.25為低度多態(tài)，0.25＜PIC＜0.5則為中度多態(tài)。本研究中，武威西門塔爾牛MSTN基因第1外顯子基因座的多態(tài)信息含量是0.076 7，表現(xiàn)為低度多態(tài)；第2外顯子基因座的多態(tài)信息含量是0.358 9，表現(xiàn)為中度多態(tài)；第3外顯子為單態(tài)位點(diǎn)。說明武威西門塔爾牛遺傳多樣性偏低，這可能是育種選擇所致。此外，本研究證實(shí)武威西門塔爾牛群體處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，這說明對武威西門塔爾牛的選擇壓力可能仍然不夠強(qiáng)。因此，在武威西門塔爾牛群體的改良過程中，可以加大人工選育力度，以便選育出肉品質(zhì)更高的優(yōu)良品種。

［1］Mcpherron AC，Lawler AM，Lee SJ.Regulation ofskeletal muscle mass in mice by a new TGF-β super family member［J］.Nature，1997，387（6628）：83-90.

［2］Mcpherron A C，Lee S J.Double muscling in cattle due to mutations in the myostatin gene［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94（23）：12457-12461.

［3］李帥，楊舒黎，茍瀟，等.肌肉生成抑制素（MSTN）基因研究進(jìn)展［J］.中國畜牧獸醫(yī)，2011，38（2）：60-63.

［4］梁春年，閻萍，邢成峰，等.西門塔爾牛MSTN基因內(nèi)含子2多態(tài)性及與生產(chǎn)性狀的相關(guān)性［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，30（3）：285-289.

［5］劉曉琴，馬喜山，唐中林，等.豬MSTN基因的多態(tài)性和生長性狀關(guān)聯(lián)分析［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，44（7）：1063-1069.

［6］張忠，張生魁，李學(xué)標(biāo).應(yīng)用西門塔爾牛凍精改良河西黃牛的效果［J］.中國畜牧雜志，1990，26（4）：51-52.

［7］KambadurR，SharmaM，SmithTP，etal.Mutationsinmyostatin（GDF-8）in double-muscled Belgian Blue and Piedmontese cattle［J］.Genome Res，1997，7（9）：910-916.

［8］Miranda ME，Amigues Y，Boscher MY，et al.Simultaneous genotyping todetect myostatin gene polymorphismin beefcattle breeds［J］.J Anim Breed Genet，2002，119（6）：361-366.

［9］Lee S J，Mcpherron A C.Regulation of myostatin activity and muscle growth［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2001，98（16）：9306-9311.

［10］Grobet L，Poncelet D，Royo L J，et al.Molecular definition of an allelic series of mutations disrupting the myostatin function and causing double-muscling in cattle［J］.Mammalian Genome，1998，9（3）：210-213.

［11］Wiener P，Smith J A，Lewis A M，et al.Muscle-related traits in cattle，the role of the myostatin gene in the South Devon breed［J］.Genetics Selection Evolution，2002，34（2）：221-321.

［12］Wheeler TL，Shackelford SD，Casas E，et al.The effects ofPiedmontese inheritance and myostatin genotype on the palatability of longissimus thoracic，guteus medius，semimembranosus and biceps femoris［J］. Animal Science，2001，79（12）：3069-3074.

Polymorphism in Exons of MSTN Gene in Wuwei Simmental

Sun Xue-jing1，GaoXue-jin2，YangXiao-pu1，et al
（1.Animal Medical College ofGansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.College ofLife Science and Technology，Gansu Agricultural University）

In order to study the polymorphism and variation in exons of MSTN gene in 60 Wuwei Simmental.DNA fragment containing the exons of MSTN gene was amplified and genotyped using PCR single-strand conformational polymorphism（SSCP）method.Representative alleles were sequenced bycloningfor verification oftheir variations in DNA sequences.The results showed that the polymorphism in the exon 1 was controlled by A and B alleles which formed two genotypes namely AA and AB with frequencies at 0.916 7 and 0.083 3 respectively;that the polymorphism in the exon 2 was controlled by A and B alleles which formed three genotypes namely AA，BB and AB with frequencies at 0.5，0.25 and 0.25 respectively;that the polymorphism in the exon 3 was onlycontrolled byAallele which formed one genotypes namelyAA.Sequence analysis indicated that there was a single nucleotide mutation including A to G at 269th nucleotide in the exon land a single nucleotide mutation including C to T at 41th nucleotide in the exon 2，but noaminoacid change；that there was nonucleotide mutation in the exon 3.The overall results showed that exon 1 ofMSTN gene had a lowlevel ofgenetic diversityin Wuwei Simmental;that exon 2 of MSTN gene had a middle level of genetic diversityin Wuwei Simmental.

MSTN gene；genetic polymorphism；Simmental

S823.2

A

2095-3887（2014）05-0005-05

10.3969/j.issn.2095-3887.2014.05.001

2014-07-07

孫雪婧（1970-），男，副教授，博士。

楊孝樸（1962-），男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究。