任桂玲，郭艷玲，董曉強(qiáng)，李沈明△

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000;2.頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司)

金蓮花口服液HPLC指紋圖譜及有效成分含量測(cè)定

任桂玲1、2，郭艷玲2，董曉強(qiáng)2，李沈明2△

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000;2.頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司)

目的:建立金蓮花口服液有效的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法。方法:通過建立HPLC指紋圖譜和檢測(cè)金蓮花口服液中有效成分葒草苷、牡荊素的含量，對(duì)市售金蓮花口服液的質(zhì)量進(jìn)行分析。采用Phenomenex C18(4.6×250mm,5μ m)色譜柱;乙腈-0.1%磷酸-0.1%四氫呋喃溶劑系統(tǒng)梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)230nm;流速1.0ml/min。結(jié)果:確定了20個(gè)共有峰，市售金蓮花口服液指紋圖譜峰相似度均＞0.94;葒草苷的線性范圍:10.00-392.80μ g/ml(r=0.9999)，牡荊苷的線性范圍:2.40-94.90 μ g/ml(r=0.9999);葒草苷平均回收率為101.85%，RSD為1.61%(n=6)，牡荊苷平均回收率為102.53%，RSD為1.45%(n=6)。結(jié)論:本研究建立的金蓮花口服液指紋圖譜，以及葒草苷和牡荊素含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、靈敏度高，穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，可為金蓮花口服液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

金蓮花口服液;質(zhì)量控制;指紋圖譜;葒草苷;牡荊素

金蓮花口服液是由金蓮花單味藥材組成的制劑，用于風(fēng)熱邪毒襲肺，熱毒內(nèi)盛引起的上呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎[1]。研究表明，其抗菌主要有效成分是黃酮類化合物，含有葒草苷、牡荊苷、槲皮素等成分[2-3]。金蓮花口服液的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為高效液相色譜法檢測(cè)葒草苷的含量，難以有效綜合地評(píng)價(jià)金蓮花口服液的內(nèi)在質(zhì)量[1]。本研究采用HPLC法建立了金蓮花口服液的指紋圖譜，對(duì)市售金蓮花口服液進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，同時(shí)對(duì)葒草苷、牡荊素兩個(gè)有效成分進(jìn)行含量測(cè)定，以期為金蓮花口服液的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司;AE 240十萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒;KQ-500DE型數(shù)控超聲儀，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試藥 金蓮花口服液，頸復(fù)康藥業(yè)(A廠)12批、吉林敖東延邊藥業(yè)(B廠)1批、武漢第六制藥(C廠)1批、牙克石森健藥業(yè)(D廠)1批、石家莊四藥(E廠)1批，批號(hào)分別為:293013、393012、293003、293002、293014、293011、293001、293004、293012、293014、293023、393013、1209001、20130701、20130102、130401。葒草苷對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111777-200801;牡荊苷對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):111687-200602。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 采用Phenomenex C18色譜柱(4.6×250mm，5μm);A(乙腈)-B(含0.1%磷酸及1%四氫呋喃的溶液)為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫，0-20min-38min-55min-70min，A相為3%-16%-16%-30%-50%，流速:1.0ml/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)230nm，進(jìn)樣量10μl，記錄70min。結(jié)果顯示，葒草苷峰和牡荊素峰與其相鄰峰的分離度均＞1.5。

2.2 供試品溶液的制備 精密量取金蓮花口服液1ml，置25ml容量瓶中，加入適量80%甲醇，超聲10min，取出，放冷，80%甲醇定容，過濾，精密量取續(xù)濾液5ml置10ml容量瓶中，80%甲醇定容至刻度，過0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液即得。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葒草苷和牡荊苷對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成含葒草苷(0.3928mg/ml)和牡荊苷(0.0949mg/ml)的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察:混合對(duì)照品儲(chǔ)備液作為1號(hào)溶液，采用倍比稀釋法制成系列濃度溶液，得2-5號(hào)混合對(duì)照品溶液，葒草苷濃度分別為0.1571、0.0628、0.0251、0.0100mg/ml，牡荊苷濃度分別為0.0380、0.0152、0.0061、0.0024mg/ml，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸。回歸方程:葒草苷:Y=18253X-19.422(r=0.9999)，牡荊苷:Y=19350X+ 4.6767(r=0.9999)。結(jié)果顯示葒草苷在0.0100-0.3928mg/ ml、牡荊苷在0.0024-0.0949mg/ml呈良好線性關(guān)系。

2.4.2 精密度試驗(yàn):取同一份供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄指紋圖譜，20個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.96%、相對(duì)峰面積RSD＜2.68%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn):取同一批號(hào)的樣品5份，記錄指紋圖譜，20個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.94%、相對(duì)峰面積RSD＜2.82%，同時(shí)計(jì)算葒草苷和牡荊素的含量，平均含量分別為2.28mg/ml和0.57mg/ml，RSD分別為1.93%和1.58%，結(jié)果顯示重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份供試品溶液，分別在0、2、4、8、10h進(jìn)行指紋圖譜測(cè)定，20個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1.96%、相對(duì)峰面積RSD＜2.68%，表明供試品溶液在10h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn):精密量取已知葒草苷和牡荊苷含量的同一批號(hào)樣品，分別加入2種對(duì)照品適量，以樣品溶液中絕對(duì)含量計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1:葒草苷平均回收率為101.85%、RSD為1.61%，牡荊苷平均回收率為102.53%、RSD為1.45%。

表1 葒草苷和牡荊素加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品含量測(cè)定 取1.2中市售不同廠家的金蓮花口服液，每份樣品檢測(cè)3次，計(jì)算葒草苷和牡荊素的總量，結(jié)果見表2:市售金蓮花口服液的質(zhì)量存在一定差異(總量=葒草苷均值+牡荊素均值)。

表2 不同廠家金蓮花口服液中葒草苷和牡荊素含量測(cè)定結(jié)果

2.6 指紋圖譜 采用國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版》進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，以中位數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜，建立金蓮花口服液指紋圖譜色譜疊加圖，并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，A廠12批次市售產(chǎn)品指紋圖譜相似度為0.971-0.988(表3);5個(gè)廠家市售產(chǎn)品的指紋圖譜與其所生成的對(duì)照指紋圖譜(附圖)比較，相似度為0.948-0.984(表4)?？梢?，市售金蓮花口服液指紋圖譜差異性不大。

附圖 5個(gè)廠家金蓮花口服液的指紋圖譜

表3 A廠金蓮花口服液的相似度

表4 5個(gè)廠家金蓮花口服液的相似度

3 討論

3.1 指紋圖譜分析 本研究顯示，各廠家產(chǎn)品指紋圖譜與共有模式相似度較高，但各峰相對(duì)比例大小有差別，并且有個(gè)別色譜峰數(shù)目不同，說明市售金蓮花口服液化學(xué)成分基本一致，但各廠家選取藥材的質(zhì)量、成分有差異性。

3.2 共有峰和參照峰 選擇穩(wěn)定性好、吸收峰強(qiáng)、特征明顯的色譜峰為共有峰，選擇峰面積較大、出峰時(shí)間適中且穩(wěn)定的7號(hào)葒草苷峰作為參照峰。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 參照文獻(xiàn)[4-8]中檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均不太理想。對(duì)供試品溶液及對(duì)照品溶液在190-400nm進(jìn)行全波段掃描，選擇色譜峰數(shù)目較多、基線平穩(wěn)，能對(duì)葒草苷和牡荊素進(jìn)行定量分析、能避開溶劑吸收的波段，檢測(cè)波長(zhǎng)確定為230nm。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.第二增補(bǔ)本[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2013.48-49.

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STUDY ON FINGERPRINT AND DETERMINATION OF ACTIVE INGREDIENTS IN TROLLII FLOS ORAL LIQUID BY HPLC

REN Gui-ling, GUO Yan-ling, DONG Xiao-qiang, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective:To establish effective quality evaluation methods of Trollii Flos Oral Liquid (TFOL).Methods:The quality of commercially available TFOL was analyzed by establishing fi ngerprint by HPLC and determining the content of active ingredients, orientin and vitexin. Phenomenex C18column (4.6×250mm, 5μm) was used with mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid-0.1% tetrahydrofuran, determine wavelength was 230nm, fl ow velocity was 1.0ml/min.Results:This study determined 20 common peaks, and the similarity fi ngerprint peaks of commercially available TFOL were all greater than 0.94. The linear range of orientin and vitexin were 10.00-392.80(r = 0.9999) and 2.40-94.90 μg/ml (r = 0.9999); the average recovery rate were 101.85% and 102.53%; the RSD were 1.61% (n=6) and 1.45% (n=6).Conclusions:The method in this study that establishing TFOL fi nger print and determination of orientin and vitexin is simple, accurate, high sensitive, and also with better stability and reproducibility. So this method can provide basis for quality control of TFOL.

Trollii Flos Oral Liquid (TFOL); Quality control; Fingerprint; Orientin; Vitexin

R286

A

1004-6879(2014)06-0463-03

△ 通訊作者

2014-05-15)