金輝，周子曄，張秀華，胡國新

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院　藥學(xué)部，浙江　溫州　325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)　藥學(xué)院，浙江　溫州　325035）

·技術(shù)與方法·

ICU患者萬古霉素血藥濃度的監(jiān)測

金輝1，周子曄1，張秀華1，胡國新2

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，浙江溫州325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州325035）

目的：建立高效液相色譜（HPLC）法快速測定人血漿中萬古霉素濃度的方法，監(jiān)測ICU患者治療藥物的濃度。方法：色譜柱為Waters的Xbridge柱（4．6 mm×150 mm，5μm）；流動相為25 mmol·L-1磷酸二氫鉀-甲醇（86:14，pH=2.4），流速為1.0 mL·min-1，紫外檢測波長為236 nm，進(jìn)樣量為20μL，柱溫為40 ℃。結(jié)果：萬古霉素濃度在1～100 mg·L-1內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9992），定量下限為1.0 mg·L-1，日內(nèi)、日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為5.83%和6.06%，提取回收率為79.71%。所監(jiān)測的28例患者血樣中，有12例患者首次萬古霉素谷濃度在10～20 mg·L-1之間，有17例治療結(jié)果為有效，總有效率為60.7%。結(jié)論：HPLC法簡便、靈敏、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，可用于ICU患者萬古霉素的血藥濃度監(jiān)測。萬古霉素用藥后血藥濃度個(gè)體差異較大，臨床需要監(jiān)測結(jié)果，為ICU患者制定合理的個(gè)體化給藥方案。

高效液相色譜；血藥濃度；監(jiān)測；萬古霉素

萬古霉素是三環(huán)糖肽類抗生素，能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，有效地對抗革蘭氏陽性菌，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant stphylococcus aureus，MRSA）感染有效，對青霉素、頭孢菌素類過敏或使用后無效的葡萄球菌和腸球菌感染尤其有效，臨床主要用于嚴(yán)重肺部感染和腎盂腎炎的治療[1]。由于萬古霉素的治療指數(shù)窄，個(gè)體差異較大，濃度太低則達(dá)不到有效血藥濃度，影響治療效果且易產(chǎn)生耐藥性；濃度太高則腎、耳毒性明顯[2]，因此臨床上常需對萬古霉素的血藥濃度和患者的腎功能進(jìn)行監(jiān)測，以便及時(shí)調(diào)整劑量，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化給藥，避免不良反應(yīng)的發(fā)生。入住重癥監(jiān)護(hù)室（intensive care unit，ICU）的患者病情重，住院時(shí)間長，免疫力低下，容易反復(fù)感染MRSA，其血藥濃度監(jiān)測具有重要意義[3]。本研究旨在建立一種高效液相色譜（high performance liquidchromatography，HPLC）法來快速測定萬古霉素的血藥濃度，為臨床醫(yī)師調(diào)整萬古霉素治療劑量提供參考依據(jù)。

1　材料和方法

1.1藥品和儀器萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號130360-200302）、去甲萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)品（批號130360-200301）均由中國藥品生物制品檢定所提供。注射用鹽酸萬古霉素（規(guī)格：500 mg，批號C133207）由日本禮來制藥廠生產(chǎn)。甲醇、乙腈均為色譜純，磷酸二氫鉀為分析純。

1.2受試者選擇和血樣采集選取自2013年1月1日至2013年12月31日間在我院ICU住院患者28例，男20例，女8例，年齡31～91歲，平均（63±12）歲。原發(fā)疾病包括高血壓、糖尿病、感染性心內(nèi)膜炎、重癥肺炎、腦外傷出血、白血病、外傷骨折等，臨床均有體溫升高、白細(xì)胞升高等感染癥狀，所有患者均經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)確診為耐藥革蘭陽性菌感染。所有患者均使用注射用鹽酸萬古霉素治療，首次給藥方案為每次l g，每天2次，至少治療3 d以上，第3天萬古霉素給藥前30 min采集血樣，進(jìn)行首次谷濃度監(jiān)測。

1.3測定條件和血漿樣品處理

1.3.1色譜條件：色譜柱為Waters的Xbridge柱（4．6 mm×150 mm，5μm）；流動相為25 mmol·L-1磷酸二氫鉀-甲醇（86∶14，pH=2.4），流速為1.0 mL· min-1，紫外檢測波長為236 nm，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為20μL。

1.3.2空白血漿處理：吸取空白血漿180μL，加入萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，加入500 mg·L-1去甲萬古霉素內(nèi)標(biāo)溶液10μL，加入10%高氯酸甲醇溶液100μL，渦旋振蕩2 min，13 000 r·min-1離心10 min，取上清液20μL進(jìn)樣。

1.4方法學(xué)考察

1.4.1專屬性：色譜條件下，空白血漿、空白血漿加內(nèi)標(biāo)、血漿樣品加內(nèi)標(biāo)色譜圖進(jìn)行比較。

1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限：在空白血漿中加入不同體積的萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入500 mg·L-1去甲萬古霉素內(nèi)標(biāo)溶液10μL，得到萬古霉素濃度分別為1、5、10、25、50、75、100 mg·L-1，按“空白血漿處理”操作，進(jìn)樣測定萬古霉素和去甲萬古霉素峰面積，平行操作3次取均值。以萬古霉素峰面積與內(nèi)標(biāo)去甲萬古霉素峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，萬古霉素的濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3精密度和提取回收率：在空白血漿中加入濃度為5、50、75 mg·L-1的萬古霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“空白血漿處理”操作，同一日內(nèi)取各濃度樣品5份，測定日內(nèi)精密度；連續(xù)不同日測定各濃度樣品5份，測定日間精密度；用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算血漿標(biāo)準(zhǔn)的峰面積與純標(biāo)峰面積的比值，來測定提取回收率。

1.4.4穩(wěn)定性：考察5、50、75 mg·L-13種濃度的萬古霉素血漿樣品處理后室溫放置24 h、-40 ℃冰箱冷凍1周、反復(fù)凍融2次樣品的穩(wěn)定性。

2　結(jié)果

2.1方法學(xué)評價(jià)

2.1.1專屬性：在該色譜條件下，萬古霉素與去甲萬古霉素分離完全，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾，各組分與內(nèi)標(biāo)基線分離且峰形良好，萬古霉素和去甲萬古霉素的保留時(shí)間分別為12.2和8.8 min（見圖1）。

圖1　色譜圖

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限：萬古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=0.021X-0.0004，r=0.9992。萬古霉素濃度在1～100 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為1.0 mg·L-1。

2.1.3精密度和提取回收率：不同濃度萬古霉素日內(nèi)、日間精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均＜7%，平均提取回收率為（79.71±3.41）%，見表1。

2.1.4穩(wěn)定性：由表2可見，血漿樣品在室溫放置和凍融狀態(tài)下較穩(wěn)定。結(jié)果以RSD表示。

表1　萬古霉素精密度和提取回收率（n=5）

表2　萬古霉素穩(wěn)定性（n=5，%）

2.2方法學(xué)應(yīng)用對28例確診的耐藥革蘭陽性菌感染患者給予萬古霉素針治療，用HPLC法監(jiān)測谷濃度。將血藥谷濃度10～20 mg·L-1定為有效濃度[4]，不在有效濃度范圍內(nèi)的調(diào)整給藥劑量，3 d后重新監(jiān)測。用藥后臨床癥狀有改進(jìn)或緩解的判定為有效，癥狀持續(xù)存在或有新癥狀出現(xiàn)的則為無效。28例患者中，20例患者谷濃度在有效濃度范圍，其中12例患者血樣首次谷濃度即在10～20 mg·L-1，8例患者在調(diào)整用藥方案后能達(dá)到有效谷濃度；8例患者萬古霉素濃度＞20 mg·L-1，其中有7例調(diào)整用藥方案后仍較高，1例患者調(diào)整后谷濃度＜10 mg·L-1。28例患者中共有17例治療結(jié)果為有效，總有效率為60.7%。有20例患者谷濃度在有效濃度范圍內(nèi)，其中14例治療結(jié)果為有效，有效率為70.0%。28例患者平均首次谷濃度為（26.01±16.61）mg·L-1。見表3。

表3　萬古霉素血藥濃度監(jiān)測結(jié)果

3　討論

目前國內(nèi)萬古霉素的血藥濃度監(jiān)測主要方法有HPLC法、熒光偏振免疫（FPIA）法、酶免疫（EMIT）法[5]。采用EMIT和FPIA法測定時(shí)測定值受萬古霉素的代謝降解產(chǎn)物的干擾而偏高，而HPLC法受干擾少，因此臨床用HPLC法測定更可靠[6]。目前，國內(nèi)外關(guān)于HPLC測定萬古霉素的血藥濃度方法已有報(bào)道[7-10]，但是提取過程較復(fù)雜，操作繁瑣，定量下限較高，不適用于臨床血藥濃度較低患者的應(yīng)用。本研究在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上經(jīng)過優(yōu)化，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)25 mmol·L-1磷酸二氫鉀-甲醇（86∶14，pH調(diào)至2.4）條件下，萬古霉素和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間合適，峰型好，各峰能充分分離，且分離度和對稱性較好。本法定量下限為1 mg·L-1，能夠滿足臨床應(yīng)用。在本研究的條件下，內(nèi)標(biāo)選擇去甲萬古霉素，出峰時(shí)間在8 min以后，可較好地避免血樣中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

萬古霉素的抗感染作用與血藥濃度有一定的相關(guān)性，有效血藥濃度是血藥濃度監(jiān)測的重要指標(biāo)。臨床醫(yī)師按常規(guī)給患者使用萬古霉素，說明書推薦日劑量為每次1 g，每天2次，但在本組28例監(jiān)測患者中，僅有12例患者血樣首次萬古霉素谷濃度在有效范圍濃度，占42.9%，說明按常規(guī)給藥，有接近60%的患者不能達(dá)到治療目的。濃度高于安全范圍的有8例，占28.5%，患者已經(jīng)達(dá)到了中毒的水平。同時(shí)，在及時(shí)調(diào)整劑量后，有8例患者（占50.0%）能夠達(dá)到有效濃度?；颊叩难帩舛仍谟行Х秶鷥?nèi)的治療結(jié)果中，有效的占比為70.0%，高于整體有效率（為60.7%）。由此可見，在對使用萬古霉素的患者進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測時(shí)，應(yīng)根據(jù)患者的具體情況，分析原因，調(diào)整給藥劑量或給藥間隔，使血藥濃度維持在一個(gè)安全、有效的范圍。此次監(jiān)測的28例患者總治療有效率僅為60.7%，這可能跟ICU患者總體年齡偏大、病情危重、住院時(shí)間較長、反復(fù)感染等情況有關(guān)，這也是ICU患者的典型特征。因此在給ICU患者用萬古霉素時(shí)，進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測，提高治療有效率十分必要。

萬古霉素在體內(nèi)主要經(jīng)腎臟清除，腎功能對萬古霉素的體內(nèi)代謝影響十分顯著。腎功能不全時(shí)，萬古霉素清除率下降，半衰期延長，血藥濃度升高[11]。典型病例：患者男，70歲，由于心功能不全合并重癥肺炎住ICU治療，查血肌酐94μmol·mL-1，血尿素氮5μmol·mL-1，最初予萬古霉素每次1 g，每天2次，靜脈滴注，48 h后監(jiān)測谷濃度達(dá)76.2μg·mL-1，查血肌酐257μmol·mL-1，血尿素氮11.7μmol·mL-1；后調(diào)整至每次0.5 g，每天3次，靜脈滴注，監(jiān)測谷濃度為31.5μg·mL-1，此時(shí)查血肌酐130μmol·mL-1，血尿素氮8.9μmol·mL-1；后又調(diào)整至每次0.5 g，每天2次，靜脈滴注，監(jiān)測谷濃度為19.8μg·mL-1，此時(shí)查血肌酐103μmol·mL-1，血尿素氮6.6μmol·mL-1。通過監(jiān)測血藥濃度，患者經(jīng)過多次調(diào)整給藥后，避免了藥物在腎臟的蓄積而導(dǎo)致的進(jìn)一步損傷，感染得到有效控制并康復(fù)出院。

本研究建立的萬古霉素血樣HPLC法，簡便、靈敏、準(zhǔn)確、快速、重復(fù)性好，可用于ICU患者血藥濃度的監(jiān)測。ICU患者住院時(shí)間長，病情復(fù)雜，反復(fù)感染且長期用藥，只有臨床藥師與臨床醫(yī)師緊密配合，根據(jù)患者具體臨床癥狀及血藥濃度監(jiān)測結(jié)果，適當(dāng)調(diào)整給藥方案，才能讓患者得到有效的治療。

[1] 張弋, 吳瑛, 沈中陽. 萬古霉素在我院肝移植患者中的治療藥物監(jiān)測及臨床應(yīng)用分析[J]. 中國藥房, 2011, 22(26): 2451-2453.

[2] 徐曉衛(wèi), 潘柔和, 胡盧豐. 肺部感染患者血清中萬古霉素濃度的監(jiān)測[J]. 中國臨床藥理學(xué)雜志, 2013, 29(6): 466-468.

[3] 周秀萍, 楊長順, 李爭鳴, 等. 重癥監(jiān)護(hù)室MRSA耐藥性及RAPD分析[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2012, 22(3): 509-511.

[4] 黃仲義, 肖永紅, 張菁. 萬古霉素臨床應(yīng)用中國專家共識(2011版)[J]. 中國新藥與臨床雜志, 2011, 30(8): 561-573.

[5] 祝文兵, 陽利龍, 何周康, 等. 高效液相色譜法測定血漿中萬古霉素的濃度[J]. 藥物分析雜志, 2006, 26(8): 1106-1108.

[6] 林秀麗, 朱金平, 費(fèi)燕. HPLC法快速測定萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度[J]. 中國臨床藥學(xué)雜志, 2011, 20(4): 231-234.

[7] Diana J, Visky D, Roets E, et a1. Development and validation of an improved method for the analysis of vancomycin by liquid chromatography selectivity of reversed-phase columns towards vancomycin components[J]. J Chromatogr A, 2003, 996(1-2): 115-131.

[8] 范捷, 郭志磊, 于洋, 等. 高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度[J]. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2012, 32(19): 1590-1592.

[9] Cheng C, Liu S, Xiao D, et a1. LCMS/MS method development and validation for the determination of polymyxins and vancomycin in rat plsama[J]. J Chromatogr B, 2010, 878(10): 2831-2838.

[10] 房德敏, 馮鑫, 陳迪, 等. 高效液相色譜法測定人血漿中萬古霉素濃度[J]. 中國新藥雜志, 2005, 14(5): 596-598.

[11] 盧巖, 孫健, 張靜, 等. 血清萬古霉素濃度監(jiān)測與個(gè)體化給藥[J]. 醫(yī)藥導(dǎo)報(bào), 2007, 26(3): 380-309.

（本文編輯：丁敏嬌）

Application of therapeutic drug monitoring of vancomycin in ICU patients

JIN Hui1, ZHOU Ziye1, ZHANG Xiuhua1, HU Guoxin2.
1.Department of Pharmacy, the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.School of Pharmacy, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

Objective:To establish a HPLC method for fast determination of vancomycin in serum and using the method for monitoring ICU patients’ therapeutic drug concentration.Methods:HPLC analysis was performed using a Water’ Xbridge column (4.6 mm×150 mm, 5 μm). The mobile phase was KH2PO4(25 mmol· L-1)-methanol (86:14, pH=2.4). The fow-rate was 1.0 mL·min-1and the detection wave length was 236 nm by UV. The injection volume was 20 μL and the temperature of column was 40 ℃.Results:The concentration range of vancomycin was 1～100 mg·L-1while the calibration curve showed good linearity (r=0.9992), and the minimum limit of quantitation was 1.0 mg·L-1. The relative standard deviations (RSD) of intra-day and inter-day were 5.83% and 6.06%, the extraction recovery was 79.71%. Twelve patients frst blood valley concentration of vancomycin was between 10 and 20 mg·L-1. There were 17 cases of the treatment for effective, total effective rate was 60.71%.Conclusion:The method is simple, sensitive, exact, rapid and good repeatability. It can be used for detecting the concentration of vancomycin in ICU patients. There is bigger individual difference in blood concentration after giving Vancomycin. Clinical need monitoring results formulate reasonable individualized dosage regimen for ICU patients.

HPLC; therapeutic drug; monitoring; vancomycin

R969.1

B

1000-2138（2014）10-0748-04

2014-04-08

金輝（1984-），男，浙江溫州人，藥師。

胡國新，教授，碩士生導(dǎo)師，Email：hgx@wzmc.edu. cn。