金緯緯，蔡平生，趙小迎，鄭飛云

（1.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325015）

WT1在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

金緯緯1，蔡平生1，趙小迎1，鄭飛云2

（1.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325000；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 溫州 325015）

目的：探討Wilms腫瘤基因（WT1）在子宮內(nèi)膜腺癌組織、子宮內(nèi)膜不典型增生組織以及正常內(nèi)膜組織中的蛋白和基因表達(dá)水平及其臨床意義。方法：采用實(shí)時熒光定量PCR及2-ΔΔCt法定量分析WT1 mRNA的相對表達(dá)量，應(yīng)用蛋白印跡（Western blot）法檢測子宮內(nèi)膜組織中WT1蛋白的表達(dá)。結(jié)果：WT1在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的基因和蛋白表達(dá)均明顯高于子宮內(nèi)膜不典型組織和正常內(nèi)膜組織（均P＜0.01）；WT1 mRNA與子宮內(nèi)膜腺癌患者年齡、絕經(jīng)情況、臨床分期、淋巴結(jié)浸潤情況、雌激素受體（ER）和體質(zhì)量指數(shù)（BMI）無顯著相關(guān)性，與病理分級、肌層浸潤情況和孕激素受體（PR）相關(guān)（P＜0.05）；WT1蛋白的表達(dá)與患者年齡、絕經(jīng)情況、臨床分期、肌層浸潤、ER、PR和BMI無顯著相關(guān)性，與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P＜0.05）。結(jié)論：子宮內(nèi)膜腺癌中存在WT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平上調(diào)，可能與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)。

Wilms腫瘤基因；子宮內(nèi)膜腺癌；實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)； 蛋白印跡

Wilms腫瘤基因（Wilms tumor gene，WT1）最初被認(rèn)為是腫瘤抑制因子[1]，但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，WT1基因在多數(shù)成人白血病、淋巴瘤[2]及多種實(shí)體腫瘤[3]中存在過表達(dá)現(xiàn)象。研究顯示其通過多種途徑促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，并在腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，因而重新被認(rèn)為是腫瘤因子[4]。本研究旨在通過檢測WT1基因和蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)情況，探討其在子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的變化規(guī)律及其與臨床病理特征的關(guān)系，以評價WT1作為子宮內(nèi)膜腺癌新的腫瘤標(biāo)志物的可行性以及其與臨床預(yù)后的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本收集 自2011年1月至2012年12月間在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院因“子宮內(nèi)膜腺癌”行子宮切除的子宮內(nèi)膜腺癌新鮮標(biāo)本60例，因“子宮內(nèi)膜不典型增生”行子宮切除的子宮內(nèi)膜標(biāo)本30例，因“子宮肌瘤”行子宮全切術(shù)的內(nèi)膜標(biāo)本40例。患者年齡35～57歲，平均（42±5.5）歲，所有病例均有完整的臨床病理資料。收集的新鮮標(biāo)本以凍存管分裝后立即置入液氮罐中，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。所有病例均由2名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師按2000年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟手術(shù)病理分期標(biāo)準(zhǔn)（FIGO）進(jìn)行臨床分期和病理分級：病理分級為G1級14例，G2級32例，G3級14例；臨床分期為I期28例，II期18例，III期14例。無肌層浸潤或肌層浸潤深度≤1/2者40例，肌層浸潤深度＞1/2者20例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者46例，有轉(zhuǎn)移者14例?；颊咝g(shù)前均未接受放療、化療或激素治療。60例子宮內(nèi)膜腺癌患者臨床病理資料及隨訪資料見表1。

1.2 主要試劑 Trizol? Reagent、QuantiTect SYBR Green PCR Kit購自Invitrogen公司；cDNA合成試劑盒購自上海生工生物有限公司；兔抗人WT1多克隆抗體購自武漢三鷹生物有限公司；羊抗兔二抗購于武漢博士德生物公司；RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測WT1 mRNA：新鮮組織RNA的提?。翰捎靡旱心シ▽⒔M織磨成粉末，加入Trizol（Invitrogen）混合，按Trizol說明書抽提總RNA。利用在線Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，DNA雙鏈胞嘧啶與胸腺嘧啶核苷酸堿基對含量即GC含量為40%～60%，產(chǎn)物大小為89～203 bp，再用Oligo 6.0軟件評估。引物均跨內(nèi)含子以減少基因組DNA的干擾，引物序列由Invitrogen公司合成。

引物：WT1（425 bp）：上游5’-CAGGCTGCAATAA GAGATATTTTAAGCT-3’，下游5’-GAAGTCACACTGGTATGG TTTCTCA-3’；GAPDH（314 bp）：上游5’-GGTCGGAGTCA ACGGATTTG-3’；下游5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’。反應(yīng)在25μL的體系中進(jìn)行，其中2×QuantiTect SYBR Green PCR 12.5μL、10μmol/L的上下游引物各1μL、樣本cDNA 2μL（300 ng）、RNA酶滅活水8.5μL。熱循環(huán)如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃ 10 min。選擇適宜的基線，各熒光曲線與基線的交叉點(diǎn)即為熒光閾值（cycle threshold value，Ct）值，同一基線下Ct值越小，其熒光信號也就最先到達(dá)某閾值而被檢測到，表明其基因拷貝數(shù)越多。應(yīng)用2-ΔΔCt法分析目的基因和內(nèi)參基因的Ct值，計(jì)算子宮內(nèi)膜組織中WT1 mRNA相對于正常內(nèi)膜組織的表達(dá)差異[5]，以正常子宮內(nèi)膜為對照組，WT1 mRNA相對表達(dá)量用以下公式計(jì)算：folds＝2-ΔΔCt[5]。

1.3.2 蛋白印跡（Western blot）法檢測WT1蛋白水平的表達(dá)：將上述新鮮組織1 g放入含有蛋白裂解液RIPA（已加入蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸化酶抑制劑NaF）的勻漿器中，置于冰上碾磨至單細(xì)胞懸液，將組織單細(xì)胞懸液置于冰上靜置30 min，其間需多次振蕩；其后，4 ℃，15 000 r/min離心15 min，取上清液即組織蛋白懸液。組織蛋白懸液用BCA試劑盒測定蛋白含量。用SDS-PAGE膠進(jìn)行Western blot法檢測。每孔上樣蛋白30μg，加4×蛋白上樣緩沖液，混勻后煮沸5 min，80 V恒壓電泳，90 min。轉(zhuǎn)膜，恒壓100 V，90 min。封閉過程需用5%脫脂奶粉（用TBST液配置）室溫封閉1 h，然后配置一抗（兔抗人WT1多克隆抗體，1∶1 000稀釋），4°孵育過夜。次日，用TBST液洗膜3次，每次10 min，孵育二抗（羊抗兔IgG）1∶5 000，37 ℃室溫孵育1 h，用TBST洗膜3次，用免疫印跡底物發(fā)光試劑盒檢測顯影（購自賽默飛公司），于暗室膠片曝光顯影，膠片用Epson1650 photo掃描儀收集圖像，用Labworks圖像分析。結(jié)果用Band Leader軟件進(jìn)行條帶灰度半定量分析。WT1蛋白的相對分子量約為51 kD，β-actin蛋白的相對分子量約為45 kD，以WT1蛋白條帶灰度值與β-actin蛋白條帶灰度值的比值作為WT1蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用±s表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，WT1表達(dá)水平與EA患者臨床病理特征的關(guān)系采用x2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜腺癌組織、子宮內(nèi)膜不典型增生組織、正常內(nèi)膜組織中WT1 mRNA的表達(dá) 通過計(jì)算得出子宮內(nèi)膜腺癌組織相對于正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)量為10.108±3.16；子宮內(nèi)膜不典型增生組織相對于正常子宮內(nèi)膜的表達(dá)量為1.016±0.153。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示子宮內(nèi)膜腺癌組織中WT1 mRNA相對表達(dá)量明顯高于正常內(nèi)膜組織和子宮內(nèi)膜不典型增生組織（均P＜0.01），子宮內(nèi)膜不典型增生組織與正常子宮內(nèi)膜組WT1 mRNA的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同類型子宮內(nèi)膜組織WT1 mRNA相對表達(dá)量見圖1。

2.2 子宮內(nèi)膜腺癌組織、子宮內(nèi)膜不典型增生組織、正常內(nèi)膜組織中WT1蛋白的表達(dá) 各組成像膠片的條帶經(jīng)Band Leader 3.0軟件處理，結(jié)果見圖2。所有組織標(biāo)本中β-actin蛋白均穩(wěn)定表達(dá)。子宮內(nèi)膜腺癌組織的WT1蛋白相對表達(dá)量為4.267±2.034，子宮內(nèi)膜不典型增生組織WT1蛋白相對表達(dá)量為1.575±0.619，正常內(nèi)膜組織WT1相對表達(dá)量為0.223±0.748，子宮內(nèi)膜腺癌WT1蛋白相對表達(dá)量明顯高于子宮內(nèi)膜不典型增生組織及正常子宮內(nèi)膜組織（均P＜0.01）。而子宮內(nèi)膜不典型增生組織與正常子宮內(nèi)膜組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同類型子宮內(nèi)膜組織中WT1蛋白表達(dá)量見圖3。

圖2 WT1 蛋白水平在正常內(nèi)膜、子宮內(nèi)膜非典型性增生、子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)

圖3 WT1蛋白在不同類型子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本中的表達(dá)量

2.3 WT1基因與蛋白表達(dá)與EA臨床病理特征之間的關(guān)系 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，WT1 mRNA表達(dá)與EA患者年齡、絕經(jīng)情況、臨床分期、淋巴結(jié)浸潤情況、雌激素受體（ER）和體質(zhì)量指數(shù)（BMI）無顯著相關(guān)性，而與病理分級、肌層浸潤情況和孕激素受體（PR）有相關(guān)性（見表1）；WT1蛋白的表達(dá)與患者年齡、絕經(jīng)情況、臨床分期、肌層浸潤、ER、PR和BMI指數(shù)無顯著相關(guān)性，與病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況相關(guān)（P＜0.05）。見表1。

表1 WT1基因和蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表1 WT1基因和蛋白表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系（±s）

項(xiàng)目nWT1 mRNAPWT1蛋白P年齡（歲）＜60458.801±5.1430.5064.188±1.3970.791≥60157.844±5.0884.352±1.237是否絕經(jīng)是148.324±5.2120.2944.250±1.1400.452否466.951±2.3433.849±1.123臨床分期I、II467.347±1.7770.6024.208±1.2280.755 III148.192±5.0554.470±1.026肌層浸潤深度＜1/2406.983±3.4720.0224.286±2.0120.842≥1/2209.783±1.7714.131±1.182病理分級I 147.234±2.8150.0153.266±1.1020.009 II、III469.885±1.7874.153±1.214淋巴轉(zhuǎn)移情況是149.267±3.4460.2694.350±0.9790.015否467.841±2.9653.267±0.765 ER陽性508.107±2.8760.7853.687±0.6750.173陰性108.441±3.2714.112±0.644 PR陽性527.036±3.2100.0064.264±1.4870.966陰性810.53±2.4914.241±0.548 BMI（kg/m2）＜25287.906±2.9630.5714.087±0.9620.707≥25328.629±3.4414.240±0.973

3 討論

WT1基因定位于人染色體11p13區(qū)域。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，WT1蛋白是雙向轉(zhuǎn)錄因子，對某些組織細(xì)胞的生長、分化、凋亡起重要調(diào)控作用。WT1表達(dá)產(chǎn)物在有限的正常組織中表達(dá)，包括胎兒腎、卵巢、脾臟造血組織等，其最初被認(rèn)為是抑癌基因。但隨著研究的深入，越來越發(fā)現(xiàn)WT1在包括肺癌[6]、間皮瘤[7]、卵巢癌[8]等多種實(shí)體腫瘤存在過表達(dá)，因此目前多認(rèn)為野生型WT1為癌基因。在婦科腫瘤方面，WT1被視為卵巢漿液性癌[9-10]的特異性、敏感性指標(biāo)，亦有研究顯示在子宮內(nèi)膜腫瘤中WT1基因的表達(dá)與腫瘤造血密切相關(guān)[11]。而WT1在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)情況，國外文獻(xiàn)[12]報道其陽性率波動于0～91%，國內(nèi)鮮見相關(guān)報道。Matalka等[12]利用免疫組織化學(xué)方法檢測子宮內(nèi)膜癌分段診刮標(biāo)本中WT1蛋白的表達(dá)情況，其陽性率為8.1%，而Ohno等[13]研究的結(jié)果表明WT1在子宮內(nèi)膜腺癌標(biāo)本中的陽性率高達(dá)91%。目前國外報道多采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，本研究采用real-time PCR技術(shù)和Western blot法研究WT1 mRNA及蛋白表達(dá)水平在子宮內(nèi)膜腺癌、子宮內(nèi)膜不典型增生及正常子宮內(nèi)膜臨床標(biāo)本中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在子宮內(nèi)膜腺癌組織中WT1 mRNA顯著上調(diào)，明顯高于正常內(nèi)膜組織，平均達(dá)10.108倍（P＜0.01）。在子宮內(nèi)膜腺癌中WT1蛋白水平也顯著上升（P＜0.05）。既往研究和本研究中WT1在子宮內(nèi)膜癌中的陽性表達(dá)差異的可能原因[13]：既往的研究主要是利用免疫組織化學(xué)的方法定性研究組織中WT1基因的表達(dá)情況，而不同實(shí)驗(yàn)所用于診斷免疫組織化學(xué)WT1陽性率的標(biāo)準(zhǔn)不同，部分研究診斷標(biāo)準(zhǔn)為核陽性，其考慮原因?yàn)閃T1是具有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，主要分布在細(xì)胞核；但Nakatsuka等[14]和Oji等[15]研究發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)WT1陽性染色也可定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，故在判斷標(biāo)準(zhǔn)上產(chǎn)生歧義，不利于其在臨床的廣泛應(yīng)用。而本研究從mRNA水平和蛋白水平，直接檢測WT1基因的表達(dá)情況，試圖通過巨量的表達(dá)檢測找到WT1基因mRNA和蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)閾值，從而為臨床試驗(yàn)病理診斷提供判別標(biāo)準(zhǔn)。但由于目前的研究樣本量小，故WT1基因mRNA和蛋白水平陽性的基線并不適用于臨床檢測，需進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本數(shù)量研究予以證實(shí)。另外，不同地區(qū)不同種族WT1基因差異表達(dá)的影響，必須在未來研究中加以考慮。

本研究發(fā)現(xiàn)WT1在子宮內(nèi)膜腺癌組的表達(dá)明顯高于子宮內(nèi)膜不典型增生組和正常內(nèi)膜組，呈現(xiàn)正常內(nèi)膜組織-子宮內(nèi)膜不典型增生-子宮內(nèi)膜腺癌的階梯順序遞增，符合良性病變發(fā)展到子宮內(nèi)膜不典型增生進(jìn)而到癌變的自然演變過程。雖然WT1的基因和蛋白表達(dá)情況在子宮內(nèi)膜不典型增生組與正常內(nèi)膜組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但WT1在子宮內(nèi)膜不典型增生組中已存在一定程度的高表達(dá)，這提示W(wǎng)T1過表達(dá)在子宮內(nèi)膜較早病變中已存在，且隨著子宮內(nèi)膜病變的發(fā)展，WT1表達(dá)逐漸升高，這提示W(wǎng)T1的表達(dá)情況可作為評估子宮內(nèi)膜病變的潛能指標(biāo)。

目前研究發(fā)現(xiàn)WT1在多種臨床腫瘤中均有不同程度的過表達(dá)，但有關(guān)其表達(dá)水平與臨床病理分期的相關(guān)性研究尚少。Matalka等[12]對子宮內(nèi)膜癌與各臨床病理特點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，WT1高表達(dá)與臨床分期、肌層浸潤情況、病理分級密切相關(guān)；Choi等[16]、Huang[17]、Andersson等[18]分別研究乳腺癌、肝癌、進(jìn)展期漿液性上皮卵巢腫瘤發(fā)現(xiàn)，WT1高表達(dá)是不良的預(yù)后因素。邢沖云等[19]發(fā)現(xiàn)WT1基因在白血病細(xì)胞中有特異性和普遍性的高表達(dá)，在急性粒細(xì)胞性白血病中的發(fā)生、發(fā)展及化療后骨髓增生異常綜合征監(jiān)測方面均有重要作用，尤其是在白血病復(fù)發(fā)過程中WT1基因特異性的高表達(dá)，可作為檢測白血病復(fù)發(fā)的標(biāo)志。本研究進(jìn)一步分析WT1的表達(dá)情況與子宮內(nèi)膜腺癌各臨床參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果表明患者年齡、組織學(xué)類型、臨床分期和WT1高表達(dá)無顯著相關(guān)性，但與病理分級情況相關(guān)（P＜0.05）。種種研究提示W(wǎng)T1在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)中均起作用，且與預(yù)后相關(guān)。故WT1基因可作為腫瘤病理分期的一個重要指標(biāo)，在mRNA水平及蛋白水平定量WT1基因的表達(dá)中具有重要的臨床意義。本研究通過real-time PCR定量檢測WT1基因mRNA水平的變化，運(yùn)用Western blot技術(shù)定量檢測WT1基因蛋白水平表達(dá)的差異，通過與正常內(nèi)膜組織及癌旁組織的比較，可知腫瘤組織中WT1基因的異常高表達(dá)。本研究為將來的大樣本檢測WT1基因在內(nèi)膜及內(nèi)膜病變組織中的表達(dá)提供了科學(xué)的方法。

總之，WT1在子宮內(nèi)膜不典型增生組織和子宮內(nèi)膜腺癌中表達(dá)上調(diào)，提示W(wǎng)T1在子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，其中導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的機(jī)制誘導(dǎo)新生血管的發(fā)生，WT1有可能可作為新的判斷子宮內(nèi)膜病變侵襲、發(fā)展和預(yù)后的分子標(biāo)記物。

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（本文編輯：胡苗苗）

The expression and clinical signifcance of WT1 in endometrial carcinoma

JIN Weiwei1, CAI Pingsheng1, ZHAO Xiaoying1, ZHENG Feiyun2.
1.Department of Obstetrics and Gynecology, Wenzhou Traditional Chinese Combined with Western Medicine Hospital, Wenzhou, 325000; 2.Department of Obstetrics and Gynecology, the First Affliated Hosptial of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To detect the protein and gene expression of WT1 in different types of tissues, including endometrial adenocarcinoma (EA) tissues, endometrial hyperplasia tissues and normal tissues and correlated the expression with the clinicopathological features.Methods:The relative expression WT1 mRNA was detected by real-time quantitative PCR. The expression of WT1 protein was detected by Western blot in different types of endometrial tissues.Results:The expression of WT1 mRNA and protein in endometrial adenocarcinoma tissue was signifcantly higher than that in endometrial hyperplasia tissues and normal endometrial tissue respectively (P＜0.01). There was no signifcant difference among age, menopause status, clinical stage, lymph node metastasis status, ER, BMI except histological stage, myometrial invasion and PR status concerned to WT1 gene expression (P＜0.05). There were no signifcant correlations among the protein expressionof WT1 and age, menopause status, clinical stage, myometrial invasion ER, PR, BMI (P＞0.05), but related to histological stage and lymph node status, signifcantly (P＜0.05).Conclusion:Up-regulation of WT1 protein and gene expression are correlated to the oncogenesis and progression of EA.

WT1; endometrial carcinoma; real-time quantitative PCR; Western blot

R71

A

1000-2138（2014）10-0743-05

2013-06-06

金緯緯（1987-），女，浙江平陽人，住院醫(yī)師，碩士。

蔡平生，主任醫(yī)師，Email：462080386@qq.com。