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        胃癌組織中人巨細(xì)胞病毒感染及其臨床意義

        2014-03-01 02:50:14金勁激涂建欣吳明馬海廣沈賢薛向陽
        關(guān)鍵詞:溫州陽性率試劑盒

        金勁激,涂建欣,吳明,馬海廣,沈賢,薛向陽

        (1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科,浙江 溫州 325015;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科,浙江 溫州 325015;3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科,浙江 溫州 325015;4.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所,浙江 溫州 325035)

        ·論著·

        胃癌組織中人巨細(xì)胞病毒感染及其臨床意義

        金勁激1,涂建欣2,吳明3,馬海廣1,沈賢1,薛向陽4

        (1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胃腸外科,浙江 溫州 325015;2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科,浙江 溫州 325015;3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 消化內(nèi)科,浙江 溫州 325015;4.溫州醫(yī)科大學(xué) 分子病毒與免疫研究所,浙江 溫州 325035)

        目的:初步探討人巨細(xì)胞病毒(HCMV)感染與胃癌的關(guān)系。方法:采用化學(xué)發(fā)光(CLIA)法對(duì)胃癌組(n=80)及健康對(duì)照組(n=80)的外周血清進(jìn)行HCMV IgG、IgM抗體檢測;巢式PCR技術(shù)檢測22例胃癌患者的腫瘤及癌旁正常胃黏膜組織標(biāo)本中的HCMV UL55基因;統(tǒng)計(jì)分析HCMV感染與胃癌臨床特征的關(guān)系。結(jié)果:胃癌組血清HCMV-IgG陽性率為95%(76/80),HCMV-IgM陽性率為6.25%(5/80);在健康對(duì)照組血清中,HCMV-IgG陽性率為97.5%(78/80),HCMV-IgM陽性率為3.75%(3/80),HCMV IgG、IgM在胃癌組與健康對(duì)照組血清中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HCMV UL55陽性檢出率在22例胃癌組織中為50%(11/22),在相應(yīng)正常胃黏膜組織中為9.09%(2/22),胃癌組織HCMV陽性檢出率較癌旁正常組織顯著升高(P<0.01)。此外,未發(fā)現(xiàn)HCMV感染與胃癌的TMN分期、組織病理分化及腫塊大小有顯著性關(guān)聯(lián)。結(jié)論:胃癌組織中存在HCMV感染,且HCMV相較于癌旁正常組織更傾向感染癌灶,提示HCMV感染可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。

        胃腫瘤;人巨細(xì)胞病毒;UL55

        人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)屬于皰疹病毒科β屬雙鏈DNA,以潛伏感染狀態(tài)長期甚至終生存在于人體內(nèi),在亞洲和非洲的部分地區(qū)感染率接近100%[1-2]。絕大部分患者常表現(xiàn)為無癥狀感染,但在艾滋病患者、器官移植患者及免疫功能低下的個(gè)體可出現(xiàn)病毒活化,表現(xiàn)為明顯臨床癥狀,如肺炎、腸炎、器官排斥等[3-4]。近年來,HCMV感染與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。已有研究表明HCMV感染與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌等惡性腫瘤的形成有密切聯(lián)系[5-6],但其與胃癌的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。本研究首先檢測胃癌患者血清中特異性IgG及IgM抗體,評(píng)價(jià)胃癌患者HCMV感染情況,隨后通過HCMV UL55基因的巢式PCR檢測,分析22例胃癌組織及相應(yīng)癌旁正常黏膜HCMV感染情況,并探討HCMV胃黏膜感染與胃癌臨床特征之間的相關(guān)性。

        1 材料和方法

        1.1 標(biāo)本來源

        1.1.1 血清標(biāo)本:80例經(jīng)胃鏡及組織病理學(xué)檢查確診的胃癌患者(胃癌組)血清采自2012年3月至2012年6月本院住院患者,其中男53例,女27例,年齡49~81歲,平均(64.32±9.70)歲。并在同時(shí)期本院健康體檢中心收集80例[男48例,女32例,年齡45~79歲,平均(62.82±8.99)歲]年齡性別相匹配的健康對(duì)照(健康對(duì)照組)血清。所有血清標(biāo)本于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.1.2 組織標(biāo)本:所有的組織標(biāo)本來自于2011年6月至2012年6月在本院胃腸外科行手術(shù)治療的胃癌患者22例,男15例,女7例,年齡42~80歲,平均(66.8±9.47)歲。每例標(biāo)本留取腫瘤以及相應(yīng)的正常胃黏膜組織(距腫瘤組織5 cm以上),標(biāo)本于離體后30 min內(nèi)保存在液氮中備用。所有患者術(shù)前均未行放、化療等治療,術(shù)后組織病理確診后按照2012 NCCN指南進(jìn)行TMN分期。

        1.2 材料和試劑 組織基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;KOD-plus試劑盒購自日本Toyobo公司;pMD19-T連接試劑盒購自TaKaRa公司;E.coli DH 5α菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存;引物由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并委托上海生工生物工程有限公司合成。

        1.3 方法

        1.3.1 血清HCMV IgG、IgM抗體檢測:采用德國羅氏公司Cobas 8000分析系統(tǒng)及配套試劑盒用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行血清HCMV IgG、IgM抗體檢測,操作步驟嚴(yán)格參照試劑盒說明書,空白對(duì)照、陰性對(duì)照及陽性對(duì)照均來自試劑盒。

        1.3.2 胃癌組織DNA提?。簶?biāo)本DNA提取步驟參照組織基因組DNA提取試劑盒說明書。所有提取的組織DNA經(jīng)分光光度計(jì)測濃度后保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.3 胃癌組織HCMV感染檢測:UL55基因編碼的糖蛋白B(gB)是HCMV一個(gè)不可缺少的、高度保守的基因。為此,本研究選擇UL55基因作為HCMV檢測的目的基因,根據(jù)文獻(xiàn)[7]報(bào)道的檢測引物,將提取的組織DNA進(jìn)行巢式PCR鑒定。第一輪PCR反應(yīng)體系為: DNA模板1μL,Kod-plus酶0.5μL,10×buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.5μL,25 mmol/L MgSO41μL,20μmol/L外引物各1μL,ddH2O 15.5 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性15 s,58 ℃退火15 s,68 ℃延伸15 s,共30個(gè)循環(huán);最后68 ℃延伸5 min。第二輪PCR反應(yīng)體系為:第一輪PCR產(chǎn)物1μL,Kod-plus 0.5μL,10×buffer 2.5μL,2.5 mmol/L dNTP 2.5μL,25 mmol/L MgSO41μL,20μmol/L內(nèi)引物各1μL,ddH2O 15.5μL,反應(yīng)條件同第一輪PCR條件。兩輪PCR結(jié)束后,2%瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,0.1 mg/mL EB染色,260 nm紫外成像。并將擴(kuò)增目的片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠DNA回收,步驟參照試劑盒說明書?;厥蘸筮B于pMD19-T載體,并轉(zhuǎn)化至E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi),挑取陽性單克隆并用M13通用引物鑒定后,送上海生工生物工程有限公司測序鑒定。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2組之間陽性率比較采用x2檢驗(yàn)(如腫瘤與癌旁組織、不同年齡、性別、腫瘤大小之間HCMV感染陽性率比較);等級(jí)資料之間陽性率比較采用秩和檢驗(yàn)(如TMN分期、組織病理分化類型之間HCMV感染陽性率比較)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 胃癌及正常對(duì)照標(biāo)本HCMVIgG、IgM抗體檢測結(jié)果 胃癌組與健康對(duì)照組血清HCMVIgG、IgM特異性抗體陽性率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

        2.2 HCMV UL55檢測特異性分析 本實(shí)驗(yàn)通過巢式PCR對(duì)胃癌及其癌旁正常組織中的HCMV UL55基因進(jìn)行擴(kuò)增,可見部分組織DNA經(jīng)兩輪PCR后在2%瓊脂糖凝膠中可出現(xiàn)特異性條帶(見圖1A),并通過進(jìn)一步測序鑒定驗(yàn)證巢式PCR的特異性(見圖1B)。

        表1 胃癌組及健康對(duì)照組血清標(biāo)本HCMV IgG、IgM抗體陽性率檢測結(jié)果(n=80,n/%)

        圖1 HCMV UL55巢式PCR檢測特異性分析

        2.3 胃癌組織與癌旁正常組織中HCMV感染檢測 22例胃癌組織及配對(duì)癌旁正常組織HCMV感染結(jié)果見圖1A及表2。在胃癌組織中HCMV陽性率為50%(11/22),而在相應(yīng)正常胃黏膜組織中HCMV陽性率為9.09%(2/22)。2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2= 8.844,P<0.01)(見圖2)。經(jīng)進(jìn)一步分析,胃癌組織HCMV感染與年齡、性別、TMN分期、組織病理分化類型及腫瘤大小等胃癌患者的臨床病理特征未顯示明顯相關(guān)性(P>0.05)。

        圖2 胃癌組織和癌旁正常組織HCMV檢出率比較

        3 討論

        胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一[8],其病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。近年來研究顯示,HCMV感染與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[5-6]。Scheurer等[9]對(duì)不同組織類型的神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)行了HCMV檢測,發(fā)現(xiàn)惡性膠質(zhì)瘤相對(duì)于間變性膠質(zhì)瘤、低級(jí)別膠質(zhì)瘤有著更高的感染率。國內(nèi)學(xué)者施浩強(qiáng)等[10]研究發(fā)現(xiàn)HCMV活動(dòng)性感染與尿路上皮細(xì)胞癌的病理分化類型有關(guān)。自從潰瘍性結(jié)腸炎與巨細(xì)胞病毒感染的關(guān)系被首次報(bào)道[11]后,越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道胃腸道疾病的發(fā)生與HCMV感染有關(guān),以急性胃炎、胃潰瘍、急性腸炎等疾病報(bào)道[12-13]多見。Hertel等[14]研究認(rèn)為上皮細(xì)胞可能為HCMV攻擊及潛伏的位點(diǎn)。Chen等[15]通過定量PCR以及免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)HCMV更傾向于感染結(jié)腸癌的上皮細(xì)胞,而亦有研究認(rèn)為結(jié)腸癌與HCMV的感染無顯著關(guān)聯(lián)[16]。但迄今鮮有HCMV與胃癌的相關(guān)性研究報(bào)道。

        為探討HCMV感染與胃癌的關(guān)系,本研究首先采用化學(xué)發(fā)光法對(duì)胃癌組及健康對(duì)照組各80例血清進(jìn)行了HCMV IgG、IgM抗體檢測,未發(fā)現(xiàn)胃癌組與健康對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其原因可能為:①HCMV人群潛伏感染率高[1-2],2組在血清學(xué)抗體水平上很難出現(xiàn)差異;②感染部位不特異,局部或全身的既往或現(xiàn)狀感染均可引起IgG、IgM抗體的產(chǎn)生。故血清學(xué)檢測HCMV IgG、IgM抗體尚不能說明胃癌與HCMV之間的關(guān)聯(lián)。

        HCMV是一種廣泛細(xì)胞親嗜性的DNA病毒。為探討胃癌組織HCMV感染的情況,本研究選擇HCMV基因組中高度保守的、在病毒的生長、增殖過程發(fā)揮重要作用的UL55基因[17],參考文獻(xiàn)[7]報(bào)道的方法,建立了巢式PCR,檢測胃癌及癌旁相應(yīng)的正常黏膜組織中HCMV感染的情況。本研究初步驗(yàn)證了胃癌上皮細(xì)胞中存在HCMV,且相對(duì)于正常胃黏膜HCMV更傾向感染癌灶,提示胃癌可能與HCMV感染有關(guān)。本研究雖在HCMV與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性分析中未發(fā)現(xiàn)HCMV感染與胃癌的TMN分期、組織病理分化及腫塊大小有顯著性關(guān)聯(lián),但仍可發(fā)現(xiàn)HCMV在分化低、分期晚及體積大的病灶中有更高感染率的傾向,需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)大樣本量、進(jìn)行多中心的實(shí)驗(yàn)研究。

        HCMV感染對(duì)腫瘤生長的影響,大多學(xué)者支持由Jindrich Cinatl團(tuán)隊(duì)提出的HCMV發(fā)揮“腫瘤調(diào)節(jié)”作用的學(xué)說[18]。該學(xué)說認(rèn)為HCMV感染后誘發(fā)細(xì)胞反應(yīng)為腫瘤細(xì)胞的生長提供有利環(huán)境。長期的HCMV感染導(dǎo)致的慢性炎癥可通過影響細(xì)胞信號(hào)通路、釋放炎癥因子、促進(jìn)免疫逃避、抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡、引起基因突變、影響細(xì)胞周期及全身免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等來誘導(dǎo)腫瘤的形成[18-19]。這些研究提示了胃黏膜的持續(xù)HCMV感染可能通過類似方式參與胃癌的發(fā)生。

        表2 胃癌患者臨床相關(guān)資料以及組織UL55檢測結(jié)果

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        (本文編輯:胡苗苗)

        Primary research of the relationship between HCMV infection and gastric cancer

        JIN Jinji1, TU Jianxin2,WU Ming3, MA Haiguang1, SHEN Xian1, XUE Xiangyang4.
        1.Department of Gastroenterological Surgery, the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of Rheumatology, the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 3.Department of Gastroenterology, the First Affliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 4.Institute of Molecular Virology and Immunology, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035

        Objective:To explore the correlation between HCMV infection and gastric cancer.Methods:The specifc IgG and IgM antibodies of HCMV in serum of gastric cancer group (n=80) and health control group (n=80) were detected using the chemiluminesence immunoassay. HCMV infection in gastric cancer tissues and corresponding normal tissues were determined through the detection of UL55 gene by Nested PCR. The relationships between HCMV infection and clinical features of gastric cancer were further analyzed.Results:The positive rate of HCMV-IgG and IgM were 95% (76/80) and 6.25% (5/80) in gastric cancer group, respectively. Meanwhile, the positive rate were 97.5% (78/80) and 3.75% (3/80) in health control. There was no statistically signifcant difference between the gastric cancer and health control group in HCMV-IgG, IgM detection. However, there was a signifcant difference between gastric cancer tissues and corresponding normal tissues in HCMV detection. The positive rate of HCMV UL55 was 50% (11/22) in gastric cancer tissue samples, whereas 9.09% (2/22) in corresponding normal tissues through Nested PCR detection. In addition, There was no obvious association between HCMV infection and TMN stage, pathological differentiation type and the size of tumor.Conclusion:It is the frst time to report the HCMV infection in gastric cancer tissues, and the HCMV may preferentially infect the neoplastic epithelium than corresponding normal epithelium, this research suggests the HCMV infection may participate in the occurrence and development stages of gastric cancer.

        gastric neoplasms; human cytomegalovirus; UL55

        R735.2

        A

        1000-2138(2014)10-0703-05

        2013-09-04

        國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81001343);浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(Y2100909);溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目(Y20100164,H20100028)。

        金勁激(1988-),男,浙江瑞安人,住院醫(yī)師,醫(yī)學(xué)碩士。

        薛向陽,副教授,碩士生導(dǎo)師,Email:wzxxy001@163.com。

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