王遠(yuǎn)微，張誠(chéng)民，索化夷，岳 華，李 鍵，湯 承，*（.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都6004；.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶40075）

川西北牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中發(fā)酵畢赤酵母菌的分離鑒定

王遠(yuǎn)微1，張誠(chéng)民1，索化夷2，岳 華1，李 鍵1，湯 承1，*
（1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都610041；
2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶400715）

對(duì)川西北部分牧區(qū)的10份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品進(jìn)行酵母菌的分離，通過(guò)常規(guī)形態(tài)特征和26S rRNA基因測(cè)序分析鑒定出6株發(fā)酵畢赤酵母菌（Pichia fermentans）。同源性分析顯示6株分離菌與已知發(fā)酵畢赤酵母菌的同源性高達(dá)99.7%～100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中微生物組成多樣性研究以及發(fā)酵畢赤酵母菌遺傳多樣性研究提供參考。

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶，發(fā)酵畢赤酵母菌，分離鑒定

傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶是青藏高原地區(qū)牧民采用傳統(tǒng)方法制作而成，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，蛋白質(zhì)和脂肪含量分別達(dá)到4.91%和6.89%[1-4]，且含有大量的揮發(fā)性脂肪酸[5]，并富有良好的風(fēng)味。其在維持腸道菌群生態(tài)平衡、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)、促進(jìn)消化、抗衰老、抗癌、提高人體免疫力等方面有很好的效果[6]。它是牧區(qū)非常傳統(tǒng)的奶制食品，也是牧民重要的經(jīng)濟(jì)收入來(lái)源。

牦牛酸奶發(fā)酵過(guò)程受海拔地理環(huán)境、氣候環(huán)境、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、制作方法、文化及奶源的影響，因此微生物菌群非常復(fù)雜。張和平等[3]報(bào)道青海西北部的高原牦牛酸奶和青海東部的環(huán)湖牦牛酸奶中乳酸菌是優(yōu)勢(shì)菌，而青海南部的環(huán)湖牦牛酸奶中酵母菌是優(yōu)勢(shì)菌。Xiao-He Wu等[4]發(fā)現(xiàn)3種乳酸菌以及5種酵母菌是西藏不同海拔地區(qū)牦牛酸奶中主要的發(fā)酵菌群，其中發(fā)酵乳桿菌是優(yōu)勢(shì)菌。Koichi[7]等發(fā)現(xiàn)蒙古牦牛酸奶中乳酸菌量明顯高于酵母菌的量。牦牛酸奶中的微生物菌群盡管比較復(fù)雜，但其主要組成是乳酸菌和酵母菌[8]，只是不同地區(qū)優(yōu)勢(shì)菌的種類(lèi)不同。隨著對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中酵母菌研究的深入，越來(lái)越多的酵母菌種屬在各種乳制品中被檢測(cè)出來(lái)。發(fā)酵畢赤酵母也是其中之一，在開(kāi)菲爾酸奶、中國(guó)酸馬奶、西藏的曲拉、臺(tái)北的酸奶中都相繼發(fā)現(xiàn)了該菌[9-12]。張和平和闞建全、Mei Bai等[13]也分別從青海地區(qū)和西藏地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中發(fā)現(xiàn)該菌，其中張和平等發(fā)現(xiàn)青海地區(qū)牦牛酸奶中發(fā)酵畢赤酵母的分離率達(dá)到43.2%，是青海地區(qū)酸牦牛奶中的優(yōu)勢(shì)菌。但對(duì)于川西北高原牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中的發(fā)酵畢赤酵母的分離報(bào)道比較少。

本研究對(duì)川西北地區(qū)的紅原、若爾蓋、康定等地的10份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品進(jìn)行酵母菌的分離鑒定，并對(duì)分離菌進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析，以期對(duì)川西北高原地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中蘊(yùn)含的大量原始微生物菌種資源的保護(hù)及研究提供菌株，為該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中微生物組成多樣性研究和發(fā)酵畢赤酵母的遺傳多樣性研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品采集及儲(chǔ)存運(yùn)輸 樣本采自川西北地區(qū)的四川省阿壩洲紅原縣（3份）、若爾蓋縣（3份）和甘孜州康定縣（4份），樣本置于4℃樣品箱運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行分離培養(yǎng)；YPD培養(yǎng)基、革蘭氏染液 杭州微生物制劑有限公司；Taq DNA聚合酶、PCR試劑、DNA Markers、dNTPs 購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖 Oxoid公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 TIANGEN公司；AXY prepTM DNA Gel extraction kitAXYGEN公司；

恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣公司；centrifuge 5804高速離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；my cyclerTMPCR儀、核酸電泳儀powerpac universalTM、VerSa Doc2000凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；Milli-Q超純水儀 法國(guó)Millipore公司；移液器 德國(guó)Eppendorf公司；LD2X-30KA立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；HR40-ⅡA2生物安全柜 青島海爾特種電器有限公司；AR2130/C精密電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的分離與純化 分別吸取1mL牦牛酸奶置于裝有9mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，充分振蕩使其混勻。將混合后牦牛酸奶進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)♂尪葹?0-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，選取10-3、10-4、10-5、10-6、10-75個(gè)稀釋度，用移液器吸取1mL樣液，采用涂布法，將樣液均勻涂布于YPD培養(yǎng)基上，將制備好平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，觀(guān)察并記錄菌落特征，挑取菌落較大，且呈白色或乳白色的單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)，呈圓形或橢圓形、臘腸狀且細(xì)胞較大者，將其再接種于YPD培養(yǎng)基，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48h，重復(fù)幾次純化酵母菌，直至鏡檢結(jié)果為同一細(xì)胞形態(tài)后，將其接種于YPD液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫培養(yǎng)24～48h后，加入30%的滅菌甘油，混勻后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)觀(guān)察 將上述純培養(yǎng)菌，接種于YPD培養(yǎng)基斜面，置28℃恒溫培養(yǎng)18h后涂片，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 酵母菌的26S rRNA序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

1.2.3.1 PCR模板DNA的制備 將上述純化的酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基中置于28℃振蕩培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)液按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的操作說(shuō)明提取細(xì)菌基因組DNA，作為本實(shí)驗(yàn)的PCR模板。

1.2.3.2 PCR引物 PCR擴(kuò)增目的片段在酵母菌的大亞基26S rRNA的D1/D2可變區(qū)域內(nèi)，引物序列為NL-1：5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’、NL-4：5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’[14]，擴(kuò)增的目的片段大小在500～600bp之間，引物由上海生工合成。

1.2.3.3 PCR方法 PCR反應(yīng)采用25μL反應(yīng)體系，其中含DNA模板1μL，上下游引物各1μL（10pmol），4× dNTPs（10mmol/L）2μL，Taq酶（5U/μL）0.125μL，Mg2+3μL（10mol/mL），10×PCR buffer 2.5μL，用超純水補(bǔ)足至25μL。PCR程序如下：95°C預(yù)變性5min，94℃1min，52℃1min，72℃1.5min，36個(gè)循環(huán)，再72℃溫浴10min，降至室溫后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3.4 目的片段的純化回收及測(cè)序 按照1.2.3.3的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件擴(kuò)增100μL PCR產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳后按照AXYGEN膠回收試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行目的片段的純化回收，回收后再2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將電泳檢測(cè)后的回收產(chǎn)物送上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3.5 序列分析與系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建 將上述測(cè)序得到的26S rRNA基因序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/）進(jìn)行序列同源性分析，選擇同源性大于99%的10個(gè)酵母序列的片段，同時(shí)調(diào)取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的克魯維菌屬的18個(gè)種的32株酵母的相同區(qū)段基因序列，使用ClustalX1.83軟件進(jìn)行多序列匹配比對(duì)（Multiple Alignments），通過(guò)Mega4.1軟件采用neighbor-joining法構(gòu)建分離酵母的同源序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和克魯維酵母屬內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用自舉分析（Boot strap）進(jìn)行置信度檢測(cè)，自舉數(shù)據(jù)集為3000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌分離菌株的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)特征

從四川紅原、若爾蓋、康定等地的10份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品中分離到的6個(gè)酵母分離株，菌落形態(tài)呈圓形，表面光滑濕潤(rùn)，顏色呈乳白色，表面凸起，邊緣整齊，不透明。顯微鏡下細(xì)胞染色為藍(lán)紫色，形態(tài)為圓、橢圓、卵圓等，無(wú)性繁殖為芽殖，一端出芽，細(xì)胞形態(tài)符合酵母菌特征，見(jiàn)圖1。

圖1 分離菌的細(xì)胞形態(tài)（1000×）Fig.1 Cell morphology of isolates（1000×）

2.2 酵母菌26S rRNA序列PCR擴(kuò)增結(jié)果

按照PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)結(jié)果顯示酵母26S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在約587bp左右處出現(xiàn)一條明亮的條帶，與預(yù)期片段大小相符，證明PCR擴(kuò)增正確，見(jiàn)圖2。

2.3 酵母菌26S rRNA基因測(cè)序同源比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果

經(jīng)26S rRNA基因序列測(cè)定，擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為586～ 588bp，與Genbank中同源性較高的菌株進(jìn)行同源性比對(duì)。結(jié)果顯示分離的6株酵母菌與Genbank中發(fā)酵畢赤酵母的同源性最高，相似性為99.7%～100%，見(jiàn)圖3。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，6株分離酵母菌與Genbank中的發(fā)酵畢赤酵母菌序列獨(dú)立于畢赤酵母屬的其他種酵母形成一個(gè)大的分支，發(fā)酵畢赤酵母菌大分支中形成3個(gè)小的分支，6株分離酵母菌分列其中兩個(gè)小的分支中，見(jiàn)圖4。

圖2 分離菌的26S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of 26S rRNA gene of isolates

圖3 分離株與發(fā)酵畢赤酵母的26S rRNA基因序列的同源性比較結(jié)果Fig.3 Sequence homology comparison of 26S rRNA gene sequences of Pichia fermentans and isolates

3 討論

Kuttzman&Robnett測(cè)定了大約500種酵母的大亞基26S rRNA基因的D1/D2可變區(qū)的序列，包括假絲酵母和其他有性型及無(wú)性型子囊菌酵母幾乎所有已知種的模式菌株，發(fā)現(xiàn)用這段序列（500～600bp）可以將絕大部分種區(qū)分開(kāi)，同一種內(nèi)不同菌株間D2區(qū)的核苷酸差異不超過(guò)1%[14]。這些序列均已公布在GenBank=等國(guó)際核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中，給酵母菌的分子鑒定提供了很大方便。本研究擴(kuò)增了6個(gè)分離菌的26S rRNA基因的D1/D2可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序分析，對(duì)分離菌進(jìn)行分子鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6株酵母菌與發(fā)酵畢赤酵母的同源性最高，相似性為99.7%～100%，按照Kuttzman的同一種內(nèi)不同菌株間D2區(qū)的核苷酸差異不超過(guò)1%的結(jié)論，所以將6株分離菌鑒定為發(fā)酵畢赤酵母菌。本研究為川西北高原地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中原始微生物菌種資源的保護(hù)及研究提供了菌株。

26SrRNA基因是核糖體RNA基因中的一員，具有進(jìn)化速率慢，序列保守性高的特點(diǎn)，但同時(shí)由于各種原因其基因序列中又具有一定的突變，而這些突變的序列具有種屬的差異，使其作為一種良好的生物分類(lèi)鑒定材料而受到廣泛的重視，被作為種屬的鑒定以及分子分型的工具[15-17]。本研究中6株分離酵母菌與Genbank中的發(fā)酵畢赤酵母菌序列獨(dú)立于畢赤酵母屬的其他種酵母形成一個(gè)大的分支，發(fā)酵畢赤酵母菌大分支中形成3個(gè)小的分支，6株分離酵母菌分列其中兩個(gè)小的分支中，說(shuō)明發(fā)酵畢赤酵母菌在遺傳進(jìn)化過(guò)程中具有一定多樣性，為發(fā)酵畢赤酵母菌的遺傳多樣性研究提供一定參考。

圖4 分離菌與畢赤酵母屬的26S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)Fig.4 Phylogenic tree of 26S rRNA gene sequences of Pichia and isolates

從川西北地區(qū)采集的10份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品中的6份中分離到了發(fā)酵畢赤酵母，分離率為60%，可見(jiàn)發(fā)酵畢赤酵母在該地區(qū)牦牛酸奶中是一種廣泛存在的菌株，這與張和平以及Mei Bai等[13]的研究結(jié)果基本相符。雖然在很多食品中，Pichia屬的酵母被認(rèn)為是污染酵母，但是在傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，由于它的某些菌種具有很強(qiáng)的利用乙醇和乳酸的能力，能在過(guò)度的酒精和乳酸發(fā)酵過(guò)程中平衡酒精和乳酸的含量，因此在很多情況下都有Pichia屬酵母菌的檢出，可以認(rèn)為它是傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中正常酵母微生態(tài)的一部分。本研究為該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶的微生物組成多樣性研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究從川西北地區(qū)的紅原、若爾蓋、康定等地的10份傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品中分離鑒定出6株發(fā)酵畢赤酵母。為川西北高原地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中蘊(yùn)含的大量原始微生物菌種資源的保護(hù)及研究提供菌株，為該地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶中微生物組成多樣性研究以及發(fā)酵畢赤酵母菌的遺傳多樣性研究提供參考。

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Isolation and identification of Pichia fermentans strains from traditional fermented yak yoghurt in the northwest of Sichuan province

WANG Yuan-wei1，ZHANG Cheng-min1，SUO Hua-yi2，YUE Hua1，LI Jian1，TANG Cheng1，*
（1.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China；2.College of Food Science，Southwest University，Chongqing 400715，China）

Based on the conventional morphological and 26S rRNA gene sequencing analysis，the 6 stains of Pichia fermentans were isolated and identified from the 10 samples from traditional fermented yak yogurt in the northwest of Sichuan province.The 6 isolates had 99.7%～100%nucleotide sequence homology with Pichia fermentans which were available from GenBank.Therefore，the results of this study provided information for research of the diversity of microbial compositions of traditional fermented yak yogurt and genetic diversity of Pichia fermentans.

traditional fermented yak yoghurt；Pichia fermentans；isolation and identification

TS201.3

A

1002-0306（2014）12-0184-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.031

2013－09－26 *通訊聯(lián)系人

王遠(yuǎn)微（1982-），男，碩士研究生，研究方向：分子生物學(xué)。

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201203009）；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2013jcyjA80006）。