薛敏敏 徐忠良 董公明 謝 芳 吳佩群 白 嵐

肝硬化是一種常見的慢性肝病，在我國，乙型病毒性肝炎是引起肝硬化的主要原因[1]。肝硬化的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，細(xì)胞因子在其中的作用越來越受到關(guān)注。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1與多種組織或器官的纖維化性疾病密切相關(guān)。有研究表明，TGF-β1基因多態(tài)性與心肌梗死、系統(tǒng)性硬化、多發(fā)性硬化癥、肝臟纖維化等多種疾病相關(guān)[2-3]。有關(guān)TGF-β1 509C/T、869T/C基因多態(tài)性與乙型肝炎肝硬化關(guān)系的研究較多，但是各研究結(jié)論不一致[4-7]。本研究運(yùn)用Meta分析方法，對(duì)以往多個(gè)關(guān)于中國人群TGF-β1 509C/T、869T/C基因多態(tài)性與乙型肝炎肝硬化關(guān)系的病例對(duì)照研究的文獻(xiàn)進(jìn)行合并分析，旨在獲得關(guān)于TGF-β1基因多態(tài)性與乙型肝炎肝硬化之間關(guān)系的可靠證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 檢索策略 以“肝纖維化或肝硬化，轉(zhuǎn)化生長因子，基因”為檢索詞，在摘要和（或）全文中限定509或869位點(diǎn)，檢索中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫、重慶維普中文科技期刊全文數(shù)據(jù)庫、清華CNKI數(shù)據(jù)庫、萬方科技期刊全文數(shù)據(jù)庫中自建庫到2013年7月，發(fā)表的關(guān)于TGF-β1基因509位點(diǎn)、869位點(diǎn)多態(tài)性與乙肝肝硬化關(guān)系的文獻(xiàn)，并通過Pubmed（檢索詞為“l(fā)iver cirrhosis or hepatic fibrosis”and“TGF or transforming growth factor”and“gene”and“Chinese”）檢索英文期刊或者有英文摘要的期刊上發(fā)表的關(guān)于中國人群的研究報(bào)道。并通過文獻(xiàn)追溯的方式對(duì)該領(lǐng)域主要研究者的報(bào)道進(jìn)一步查漏。1.2 文獻(xiàn)的納入與剔除 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）國內(nèi)或國外期刊發(fā)表的關(guān)于TGF-β1基因509位點(diǎn)、869位點(diǎn)多態(tài)性與中國人群乙型肝炎肝硬化相關(guān)性的病例對(duì)照研究。（2）病例組肝硬化標(biāo)準(zhǔn)符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)推薦標(biāo)準(zhǔn)。（3）對(duì)照組為無乙型肝炎的健康對(duì)照人群。（4）同一作者的重復(fù)文獻(xiàn)或?qū)ν蝗巳旱亩啻螆?bào)道選擇質(zhì)量最好的一篇。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）文獻(xiàn)中未提供病例與對(duì)照的來源或無對(duì)照、對(duì)照不符合要求的文獻(xiàn)。（2）病例組未給出明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)。（3）資料收集方法不科學(xué)、分析不恰當(dāng)?shù)奈墨I(xiàn)。（4）綜述性文獻(xiàn)。兩名獨(dú)立的文獻(xiàn)搜集人員以互盲的形式分別對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行初級(jí)檢索，確定初級(jí)檢索內(nèi)容后對(duì)文獻(xiàn)進(jìn)行納入和剔除，對(duì)意見不一致的文獻(xiàn)共同商討而獲得一致的意見。采用統(tǒng)一規(guī)范的數(shù)據(jù)提取表提取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)Meta分析的要求進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與合并，并與原始文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行核對(duì)，所有統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用Rev?Man 5.1軟件完成。TGF-β1基因位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)乙肝肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)采用OR及其95%CI進(jìn)行描述，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。首先進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，若納入文獻(xiàn)之間同質(zhì)性較好，則采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析；如果納入文獻(xiàn)之間異質(zhì)性較大，則用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析。然后繪制漏斗圖，對(duì)發(fā)表偏倚進(jìn)行評(píng)估，并計(jì)算失效安全系數(shù)估計(jì)發(fā)表偏倚對(duì)結(jié)果的影響。

2 結(jié)果

2.1 納入研究的基本特征 初檢到191篇文獻(xiàn)，根據(jù)以上納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終共納入6篇病例對(duì)照研究文獻(xiàn)。其中3篇文獻(xiàn)同時(shí)包含509和869位點(diǎn)，2篇文獻(xiàn)只包含509位點(diǎn)，1篇文獻(xiàn)只包含869位點(diǎn)。納入研究的TGF-β1基因509位點(diǎn)、869位點(diǎn)多態(tài)性分布見表1。

2.2 Meta分析結(jié)果

2.2.1 TGF-β1基因509位點(diǎn)T等位基因與乙型肝炎肝硬化的關(guān)系 異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示χ2=23.54，自由度為4，P＜0.001，說明各研究間有異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。乙型肝炎肝硬化病例組等位基因1 172個(gè)，健康對(duì)照組等位基因1 102個(gè)，以T等位基因?yàn)楸┞兑蛩?，C等位基因?yàn)榉潜┞兑蛩剡M(jìn)行分析，結(jié)果顯示OR=1.02，95%CI為（0.67～1.54），未發(fā)現(xiàn)509位點(diǎn)攜帶T等位基因者發(fā)生乙型肝炎肝硬化的危險(xiǎn)性高于攜帶C等位基因者，見圖1。

2.2.2 TGF-β1基因509位點(diǎn)TT和CT基因型與乙型肝炎肝硬化的關(guān)系 異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示χ2= 28.18，自由度為4，P＜0.001，說明各研究間有異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。乙型肝炎肝硬化病例組586例，健康對(duì)照組551例，以TT和CT基因型為暴露因素，CC基因型為非暴露因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示OR=0.80，95%CI為（0.36～1.78），未發(fā)現(xiàn)509位點(diǎn)TT和CT基因型發(fā)生乙型肝炎肝硬化的危險(xiǎn)性高于CC基因型，見圖2。

Table 1 Genetic distributions of TGF-β1 509 and 869 genes in all included studies表1 納入文獻(xiàn)的TGF-β1基因509位點(diǎn)、869位點(diǎn)多態(tài)性分布

2.2.3 TGF-β1基因869位點(diǎn)C等位基因與乙型肝炎肝硬化的關(guān)系 異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示χ2=11.69，自由度為3，P=0.009，說明各研究間有異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。乙型肝炎肝硬化病例組等位基因742個(gè)，健康對(duì)照組等位基因752個(gè)，以C等位基因?yàn)楸┞兑蛩?，T等位基因?yàn)榉潜┞兑蛩剡M(jìn)行分析，結(jié)果顯示OR=1.05，95%CI為（0.69～1.62），未發(fā)現(xiàn)869位點(diǎn)攜帶C等位基因者發(fā)生乙型肝炎肝硬化的危險(xiǎn)性高于攜帶T等位基因者，見圖3。

2.2.4 TGF-β1基因869位點(diǎn)CC和TC基因型與乙型肝炎肝硬化的關(guān)系 異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示χ2= 12.09，自由度為3，P=0.007，說明各研究間有異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行Meta分析。乙型肝炎肝硬化病例組371例，健康對(duì)照組376例，以CC和TC基因型為暴露因素，TT基因型為非暴露因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示OR=0.98，95%CI為（0.48～2.00），未發(fā)現(xiàn)869位點(diǎn)CC和TC基因型發(fā)生乙型肝炎肝硬化的危險(xiǎn)性高于TT基因型，見圖4。

2.3 發(fā)表偏倚的評(píng)估 以納入的每個(gè)獨(dú)立研究效應(yīng)值OR為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)誤的倒數(shù)為縱坐標(biāo)，對(duì)509T等位基因和869C等位基因繪制漏斗圖。可以發(fā)現(xiàn)納入Meta分析中的各獨(dú)立研究效應(yīng)值OR在坐標(biāo)軸上圍繞漏斗圖的中心線散開，說明無明顯的發(fā)表偏倚。同時(shí)利用失效安全系數(shù)計(jì)算公式：Nfs0.05=(∑Z/ 1.645)2-k對(duì)發(fā)表偏倚進(jìn)行量化估計(jì)，經(jīng)計(jì)算，509位點(diǎn)Nfs0.05=29，869位點(diǎn)Nfs0.05=12，分別需要相同病因作用且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各29篇和12篇新研究才能逆轉(zhuǎn)本次Meta分析的結(jié)果，見圖5、6。

Figure 1 Meta-analysis for association between T allele of TGF-β1 509 and liver cirrhosis圖1 TGF-β1基因509位點(diǎn)T等位基因與乙型肝炎肝硬化關(guān)系的Meta分析

Figure 2 Meta-analysis for association between TGF-β1 509 polymorphism and liver cirrhosis圖2 TGF-β1基因509位點(diǎn)TT和CT基因型與乙型肝炎肝硬化關(guān)系的Meta分析

Figure 3 Meta-analysis for association between C allele of TGF-β1 869 and liver cirrhosis圖3 TGF-β1基因869位點(diǎn)C等位基因與乙型肝炎肝硬化的關(guān)系的Meta分析

Figure 4 Meta-analysis for association between TGF-β1 869 polymorphism and liver cirrhosis圖4 TGF-β1基因869位點(diǎn)CC和TC基因型與乙型肝炎肝硬化的關(guān)系的Meta分析

Figure 5 The funnel plots of 509 T allele publication bias圖5 509T等位基因發(fā)表偏倚漏斗圖

Figure 6 The funnel plots of 869 C allele publication bias圖6 869C等位基因發(fā)表偏倚漏斗圖

3 討論

病例對(duì)照研究可以分析遺傳因素在多因素復(fù)雜疾病中的作用，并可計(jì)算遺傳因素危險(xiǎn)性的OR值。由于單個(gè)研究中樣本例數(shù)較小，常導(dǎo)致研究結(jié)果的不穩(wěn)定，而Meta分析可以把具有相同研究目的的研究結(jié)果進(jìn)行定量合并，以彌補(bǔ)單個(gè)研究的不足，從而提高檢驗(yàn)效能，獲得更為穩(wěn)定的結(jié)果[10]。在肝臟發(fā)生病變時(shí)，TGF-β1是一種強(qiáng)效的促纖維化的細(xì)胞因子，可以通過刺激細(xì)胞外基質(zhì)的合成并抑制其降解而促進(jìn)纖維化的形成[11-12]。TGF-β1基因有多個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，包括：位于啟動(dòng)子區(qū)的-988、-800、-509，內(nèi)含子區(qū)的+72，外顯子區(qū)的869、code25[3]。其中509位點(diǎn)、869位點(diǎn)是研究較多的2個(gè)位點(diǎn)。近年來，關(guān)于TGF-β1基因多態(tài)性與乙型肝炎肝硬化的關(guān)系引起了國內(nèi)外研究者的重視，但不同研究結(jié)果之間存在一定差異。本文通過檢索國內(nèi)外已發(fā)表的文獻(xiàn)，對(duì)納入的6篇不同地點(diǎn)、不同時(shí)間研究TGF-β1基因509位點(diǎn)、869位點(diǎn)變異與中國人群乙型肝炎肝硬化關(guān)系的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)中國人群中TGF-β1基因多態(tài)性與乙型肝炎肝硬化的關(guān)聯(lián)性及關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。

本研究表明，TGF-β1基因509位點(diǎn)、869位點(diǎn)多態(tài)性均與乙型肝炎肝硬化風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。這與張志強(qiáng)等[13]的研究結(jié)論不一致。筆者的研究也分別對(duì)509位點(diǎn)TT、CT基因型與CC基因型進(jìn)行了對(duì)比分析，但未發(fā)現(xiàn)TT、CT基因型乙型肝炎肝硬化風(fēng)險(xiǎn)升高。筆者廣泛搜索了TGF-β1基因與乙肝肝硬化的文獻(xiàn)后新發(fā)現(xiàn)兩篇509位點(diǎn)的研究[5,8]，正是這兩篇遺漏的研究造成了原研究TT基因型乙肝肝硬化風(fēng)險(xiǎn)升高的陽性結(jié)果。本次Meta分析納入的栗華[4]與羅斌[5]的研究結(jié)論相反，其余研究為陰性結(jié)果。這也是造成本次Meta分析異質(zhì)性大的原因。不同研究之間差異的原因尚不明確，但是Meta分析的思想就是搜索全面的證據(jù)來解決爭(zhēng)議的問題，所以應(yīng)納入所有符合條件的研究而不是主觀排除某一研究。關(guān)于869位點(diǎn)，石偉珍等[4]的研究是造成異質(zhì)性的原因，但即使排除該研究，C等位基因的風(fēng)險(xiǎn)為T等位基因的1.25(95%CI:1.00～1.57)倍，CC和TC基因型的風(fēng)險(xiǎn)為TT基因型的1.33(95%CI:0.93～1.90)倍，差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

對(duì)各種偏倚的控制從而提高結(jié)果的真實(shí)性和可靠性是Meta分析中非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。為了減少M(fèi)eta分析的偏倚，本研究聯(lián)合使用了多種有效的文獻(xiàn)檢索途徑，盡可能全面的檢索相關(guān)文獻(xiàn)，并發(fā)現(xiàn)了既往研究中遺漏的文獻(xiàn)。在文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)估時(shí)參考英國牛津循證醫(yī)學(xué)中心嚴(yán)格評(píng)價(jià)項(xiàng)目（Oxford criti?cal appraisal skill program,Oxford CASP,2004）的要求對(duì)納入文獻(xiàn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，剔除了無對(duì)照和重復(fù)報(bào)道的文獻(xiàn)。本研究中引入的Wang等[8,14-16]的研究以相同的研究人群發(fā)表了4篇文章，在搜索之后筆者認(rèn)真比對(duì)排除了王皓作為第一作者重復(fù)發(fā)表的2篇和楊再興作為第一作者發(fā)表的1篇文章，只納入了1篇質(zhì)量較高的研究。另外，由于遺傳因素在不同種族的作用有所不同，所以本研究限定只納入在中國人群中進(jìn)行的研究，以盡可能減少人種差異造成的偏倚。發(fā)表偏倚是影響Meta分析結(jié)果的重要因素，漏斗圖的對(duì)稱性可以對(duì)發(fā)表偏倚進(jìn)行直觀評(píng)估，本次研究中兩個(gè)等位基因漏斗圖未見明顯不對(duì)稱性，提示無明顯發(fā)表偏倚。同時(shí)計(jì)算得出的509位點(diǎn)Nfs0.05=29，869位點(diǎn)Nfs0.05=12，即分別需要相同病因作用且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的各29篇和12篇新研究才能逆轉(zhuǎn)本次Meta分析的結(jié)果，說明發(fā)表偏倚的影響程度較小，可靠性較好。

本研究結(jié)果顯示在中國人群中未發(fā)現(xiàn)TGF-β1基因509位點(diǎn)、869位點(diǎn)多態(tài)性與乙型肝炎肝硬化風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，但需要指出的是本次Meta分析只涉及單因素研究，未考慮到TGF-β1基因多態(tài)性與環(huán)境因素及多基因連鎖的交互作用，而環(huán)境因素、多基因連鎖的交互作用可能影響乙型肝炎肝硬化的易感性。

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