李長(zhǎng)春 孫蓮蓮 姜忠敏 李艷霞 盛 鳳 劉曉智△

1,25(OH)2D3在牙乳頭干細(xì)胞成骨分化中的作用*

李長(zhǎng)春1孫蓮蓮1姜忠敏2李艷霞3盛 鳳3劉曉智3△

目的 研究1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]在牙乳頭干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過程中的作用。方法分離培養(yǎng)兒童牙乳頭干細(xì)胞，培養(yǎng)基中添加1,25(OH)2D3，使其終濃度分別為1、10和100 nmol/L，另設(shè)對(duì)照組加入等體積生理鹽水。采用噻唑藍(lán)（MTT）法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期變化，Western blot法檢測(cè)維生素D受體（VDR）、核因子-κB受體活化劑配體（RANKL）及骨保護(hù)素（OPG）蛋白表達(dá)水平。采用siRNA技術(shù)沉默VDR表達(dá)后（siR-VDR組），檢測(cè)其對(duì)RANKL和OPG蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果對(duì)照組及1、10、100 nmol/L 1,25(OH)2D3組增殖指數(shù)（PIx）分別為49.78±2.03、50.14±1.55、48.81±1.91和48.56±2.15，不同濃度1,25(OH)2D3對(duì)牙乳頭干細(xì)胞的增殖無明顯作用（F=3.174，P＞0.05）。對(duì)照組牙乳頭干細(xì)胞中可見一定水平VDR、RANKL和OPG的蛋白質(zhì)表達(dá)；加入1,25(OH)2D3后，VDR、RANKL和OPG蛋白表達(dá)水平均有不同程度升高，其中以VDR上升趨勢(shì)最為顯著；轉(zhuǎn)染siRVDR后，VDR、RANKL和OPG的蛋白質(zhì)表達(dá)水平下降。結(jié)論1,25(OH)2D3通過調(diào)節(jié)VDR水平影響牙乳頭干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向的分化過程。

RANK配體；骨保護(hù)素；受體,骨化三醇；牙乳頭干細(xì)胞；維生素D受體；1,25(OH)2D3

牙乳頭干細(xì)胞是兒童乳恒牙更替期的細(xì)胞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，兒童在此時(shí)期內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)攝入不足將對(duì)其產(chǎn)生重要影響[1]。維生素D3是維生素D中生物代謝率最高的一種活性形式，其主要生理功能是促進(jìn)腸道鈣吸收，誘導(dǎo)骨質(zhì)鈣磷沉著，兒童期缺乏維生素D3將可能導(dǎo)致佝僂病等嚴(yán)重后果[2]。本課題組在近期研究中發(fā)現(xiàn)維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）、核因子-κB受體活化劑配體（receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）及骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）均可能參與兒童乳恒牙更替期牙乳頭干細(xì)胞的增殖和發(fā)育[3]，但具體機(jī)制不明。本研究在此基礎(chǔ)上，探討三者之間的相互作用關(guān)系，以明確三者對(duì)牙乳頭干細(xì)胞的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，指導(dǎo)兒童對(duì)維生素D3的營(yíng)養(yǎng)攝入。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料 胎牛血清（杭州四季青），DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶，LipoVecTM（Invitrogene公司），靶向VDR的siRNA由武漢晶賽生物技術(shù)有限公司合成；RANKL多克隆抗體（美國(guó)Chemicon公司），OPG多克隆抗體及VDR多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）。實(shí)驗(yàn)牙齒來自接受正畸治療兒童患者拔除的前磨牙。

1.2 牙乳頭干細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將接受正畸治療患兒拔除的前磨牙牙胚置于培養(yǎng)液中，用含有抗生素的PBS進(jìn)行反復(fù)沖洗后，在尚未形成根尖的牙根部分分離牙乳頭，PBS沖洗3次，銳器剪碎后用25 g/L的膠原酶混懸，37℃孵育箱內(nèi)消化1 h。用含胎牛血清的培養(yǎng)液反復(fù)輕柔吹打至細(xì)胞團(tuán)離散，500 r/min離心10 min，棄上清后DMEM重懸，接種至T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，于5%CO2、37℃條件下進(jìn)行原代培養(yǎng)，24 h后半量換液，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底80%，0.25%胰蛋白酶消化。

1.3 繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 設(shè)1 nmol/L濃度組、10 nmol/L濃度組、100 nmol/L濃度組和對(duì)照組。將牙乳頭干細(xì)胞按1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板，24 h后更換新鮮的培養(yǎng)液，前3組加入1,25-二羥基維生素D3[1,25(OH)2D3]，使其終濃度分別為1、10和100 nmol/L，對(duì)照組加入等體積生理鹽水。采用噻唑藍(lán)（MTT）法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖周期 設(shè)1 nmol/L濃度組、10 nmol/L濃度組、100 nmol/L濃度組和對(duì)照組。作用48 h后胰酶消化獲得單細(xì)胞懸液，PBS漂洗3次，無水乙醇固定，RNaseA消化，PI染色30 min后行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CELLQuest軟件采樣分析結(jié)果，計(jì)算增殖指數(shù)[PIx=(S+G2M)/(G0G1+ S+G2M)]。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn) 提取細(xì)胞總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。電泳后考馬斯亮藍(lán)染色，蛋白分離滿意后轉(zhuǎn)膜，Western封閉液37℃封閉2 h，PBS充分漂洗后滴加相應(yīng)一抗，抗體稀釋度分別為VDR（1∶1 000）、RANKL（1∶1 000）和OPG（1∶2 000），4℃水平搖床過夜，次日使用辣根酶標(biāo)記的1∶500稀釋二抗37℃1 h?；瘜W(xué)發(fā)光試劑盒顯影，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描光密度值，Quantity One軟件分析。

1.6 siR-VDR質(zhì)粒構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染 設(shè)對(duì)照組、1 nmol/L濃度組、10 nmol/L濃度組、100 nmol/L濃度組和siR-VDR組5組。根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫檢索出VDR的mRNA基因全長(zhǎng)，將其編碼區(qū)用基因沉默設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)siRNA，寡核苷酸序列為5′-UUGGUCACGUCACUGACGC-3′。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞融合度接近70%的牙乳頭干細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。將1 μg的質(zhì)粒與100 μL的LipoVecTM混合20 min后加入培養(yǎng)基中，12 h后換成常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，加入終濃度為100 nmol/L的1,25(OH)2D3。48 h后采用Western blot檢測(cè)VDR、RANKL和OPG的蛋白表達(dá)水平，操作方法同1.5。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙乳頭干細(xì)胞的培養(yǎng)在培養(yǎng)24 h后可見少量細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，此后逐漸形成大的集落，集落進(jìn)一步融合，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，鋪路石樣分布。生長(zhǎng)至第6天時(shí)，行第1次傳代，以后每3～4天傳代1次，見圖1。

Figure 1 The morphology of early-stage dental papilla stem cells圖1 牙乳頭干細(xì)胞早期形態(tài)（×100）

2.2 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果 各相同時(shí)點(diǎn)各組細(xì)胞數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見圖2。

Figure 2 The cell growth curves in different concentrations of 1,25(OH)2D3圖2 不同濃度1,25(OH)2D3作用下的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3 細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果 各組牙乳頭干細(xì)胞周期分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

Table 1 Comparison of cell cycles between different concentrations of 1,25(OH)2D3表1 不同濃度的1,25(OH)2D3作用下細(xì)胞周期比較

2.4 Western blot檢測(cè)結(jié)果 3個(gè)不同濃度1,25(OH)2D3組VDR蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，且100 nmol/L濃度組高于1 nmol/L濃度組和10 nmol/L濃度組；siR-VDR組VDR蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組和3個(gè)不同濃度1,25(OH)2D3組（均P＜0.05）。RANKL和OPG蛋白質(zhì)表達(dá)水平隨1,25(OH)2D3的濃度增加而升高，且均高于對(duì)照組；siR-VDR組RANKL和OPG蛋白表達(dá)水平均高于對(duì)照組，低于100 nmol/L濃度組（均P＜0.05），見圖3。

Figure 3 The effect of 1,25(OH)2D3on expression levels of related genes detected by Western blot assay圖3 不同濃度1,25(OH)2D3對(duì)VDR、RANKL和OPG蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

3 討論

乳恒牙更替期是兒童頜面部和牙齒生長(zhǎng)發(fā)育中的一個(gè)重要階段，兒童在該時(shí)期內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)均衡將對(duì)于乳牙脫落及恒牙健康萌生產(chǎn)生重要影響[4]。牙齒與骨均為礦化組織，其形成和改建過程有相似之處。但對(duì)于RANKL和OPG的研究目前多集中于成骨和破骨作用等骨的發(fā)育和改建方面，在牙齒替換方面的研究較少。

破骨細(xì)胞的分化與成熟離不開成骨細(xì)胞，并需要兩者間細(xì)胞與細(xì)胞的接觸作用。近年來RANKL/ OPG系統(tǒng)作為破骨細(xì)胞發(fā)生的最終的調(diào)節(jié)因子的學(xué)說成為骨科生物學(xué)研究領(lǐng)域的重要進(jìn)展。該系統(tǒng)幾乎能夠調(diào)控破骨細(xì)胞所有方面的功能，包括增殖、分化、融合、活化和凋亡[5]。牙齒發(fā)育過程中，牙乳頭干細(xì)胞和牙囊細(xì)胞是顱神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)生廣泛的遷移、分化、增殖而形成的來源于外胚層的牙源性間充質(zhì)細(xì)胞。牙乳頭干細(xì)胞中含有牙髓細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞的祖細(xì)胞成分，在牙齒發(fā)育過程中逐漸形成牙髓、牙本質(zhì)。生長(zhǎng)因子、發(fā)育調(diào)控基因等因素可以影響體外培養(yǎng)的牙乳頭的增殖、分化和礦化，進(jìn)而影響牙胚的發(fā)育進(jìn)程。研究表明牙乳頭干細(xì)胞在兒童乳恒牙更替期發(fā)揮核心作用，任何影響該類細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的條件改變，均將影響兒童恒牙的萌發(fā)與生長(zhǎng)[6]。

本研究顯示，不同濃度1,25(OH)2D3對(duì)牙乳頭干細(xì)胞的增殖無明顯作用。Western blot結(jié)果顯示，在加入不同濃度1,25(OH)2D3后，VDR、RANKL和OPG的蛋白表達(dá)水平均有明顯升高，其中以VDR上升趨勢(shì)最為顯著，且3個(gè)基因的蛋白表達(dá)水平與1,25(OH)2D3濃度呈劑量相關(guān)性。VDR是1,25(OH)2D3的直接作用靶點(diǎn)，當(dāng)外界環(huán)境中1,25(OH)2D3的濃度增高時(shí)，常會(huì)誘導(dǎo)VDR的高表達(dá)，本研究也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。為進(jìn)一步了解三者對(duì)乳恒牙更替期的生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制，本研究利用RNA干擾技術(shù)特異性沉默VDR在牙乳頭干細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，當(dāng)轉(zhuǎn)染siR-VDR后，VDR的蛋白質(zhì)表達(dá)被有效沉默，RANKL和OPG的蛋白質(zhì)水平均有所下降，提示1,25(OH)2D3可能通過調(diào)節(jié)VDR水平間接調(diào)控RANKL和OPG的表達(dá)，進(jìn)而影響牙乳頭干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向的分化過程。由此推測(cè)兒童乳恒牙更替期適量攝入1,25(OH)2D3對(duì)于乳恒牙健康生長(zhǎng)發(fā)育是必要的。但因機(jī)體中存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，攝入1,25(OH)2D3的確切劑量仍有待于進(jìn)一步研究。

[1]王曉春,于海燕,畢佳銳,等.基質(zhì)金屬蛋白酶在健康牙齒和齲齒成牙本質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)[J].天津醫(yī)藥,2013,41(1):12-14.

[2]穆玉,陳乃玲,彭偉,等.羧甲基殼聚糖溫敏凝膠對(duì)小鼠L929細(xì)胞增殖的影響[J].天津醫(yī)藥,2012,40(4):363-365,421.

[3]Liu H,Cao T.Dental application potential of mesenchymal stromal cells and embryonic stem cells[J].Chin J Dent Res，2010,13(2):95-103.

[4]Saber SE.Tissue engineering in endodontics[J].J Oral Sci,2009,51 (4):495-507.

[5]Cao Y,Xia DS,Qi SR,et al.Epiregulin can promote proliferation of stem cells from the dental apical papilla via MEK/Erk and JNK signalling pathways[J].Cell Prolif,2013,46(4):447-456

[6]Kawashima N.Characterisation of dental pulp stem cells:a new horizon for tissue regeneration[J]?Arch Oral Biol,2012,57(11):1439-1458.

（2013-09-01收稿 2013-12-31修回）

（本文編輯 陳麗潔）

Functional Roles of 1,25(OH)2D3in Osteogenic Differentiation of the Dental Papilla Stem Cells

LI Changchun1,SUN Lianlian1,JIANG Zhongmin2,LI Yanxia3,SHENG Feng3，LIU Xiaozhi3
1 Department of Stomatology,2 Department of Pathology,3 The Central Laboratory，The Fifth Central Hospital of Tianjin, Tianjin 300450,China

Objective To study the functional roles of 1,25(OH)2D3in osteogenic differentiation of the dental papilla stem cells.MethodsThe dental papilla stem cells were isolated and cultured in medium supplemented with different concentrations of 1,25(OH)2D3(1,10 and 100 nmol/L).MTT assay was used to detect the cell growth,and flow cytometry was used to detect the cell cycle.Western blot assay was used to detect protein expression levels of receptor activator of nuclear factor-κB ligand(RANKL),osteoprotegerin(OPG)and vitamin D receptor(VDR).After siRNA silencing VDR expression, protein levels of RANKL and OPG were detected.ResultsMTT and flow cytometry results showed that there were no significant differences in the cell proliferation between different concentrations of 1,25(OH)2D3(1,10 and 100 nmol/L)and control groups(P＞0.05).Western blot results showed that there were protein expressions of VDR,RANKL and OPG in control group.The protein expressions of VDR,RANKL and OPG were increased after adding 1,25(OH)2D3,in which the upward trend was the most significant in VDR.After VDR expression was silenced by siRNA,the protein expression levels of VDR, RANKL and OPG were decreased.Conclusion1,25(OH)2D3affects the osteoblast differentiation process of the dental papilla stem cells by adjusting the VDR expression.

RANK ligand;osteoprotegerin;receptors,calcitriol;dental papilla stem cells;vitamin D receptor; 1,25(OH)2D3

R788

A

10.3969/j.issn.0253-9896.2014.05.006

*天津市衛(wèi)生局科技基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2011KZ25）

1天津市第五中心醫(yī)院口腔科（郵編300450），2病理科，3中心實(shí)驗(yàn)室

△通訊作者 E-mail：lxz7997@126.com