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        microRNA-21通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化調(diào)節(jié)心肌梗死后的心臟重塑

        2014-02-28 08:54:16張閩紅肖清萍劉建文
        天津醫(yī)藥 2014年5期
        關(guān)鍵詞:心梗室溫纖維細(xì)胞

        郭 東 張閩紅 肖清萍 劉建文

        心肌梗死(心梗)是心臟衰竭最常見的病因之一,發(fā)病兇險,致殘率和致死率均高,因此研究如何改善心梗后心臟的修復(fù)能力具有重要的臨床價值。miRNA(miR)是一類非編碼的小分子RNA,通過抑制靶基因的翻譯過程,參與許多重要的生物學(xué)過程[1]。研究表明miR-21在急性心肌缺血的早期病理過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[2]。過表達(dá)miR-21可以減少腫瘤壞死因子(TNF)-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡[3]。本研究采用小鼠心肌梗死模型,檢測心梗交界區(qū)心臟組織miR-21的表達(dá)情況,同時利用miR-21的模擬物(miR-21 mimic)轉(zhuǎn)染小鼠原代心臟成纖維細(xì)胞,觀察過表達(dá)miR-21對心臟成纖維細(xì)胞增殖與分化的影響,為促進(jìn)心梗后心臟的修復(fù)提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實驗動物 體質(zhì)量相近的C57/BL6小鼠,SPF級,雄性,體質(zhì)量(23±3)g,購自南京大學(xué)模式動物研究所。

        1.2 試劑和儀器 RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR試劑(日本TAKARA公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司);胎牛血清(美國Gibco公司);脂質(zhì)體Lipfectamine 2000(美國in?vitrogen公司);化學(xué)修飾的miR-21 mimic(上海吉瑪生物科技有限公司);實時熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(美國ABI公司);蛋白提取試劑盒(碧云天);α平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、小鼠Smad同源物7(Smad7)以及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(Santa Cruz,USA);EdU細(xì)胞增殖檢測試劑盒(廣州市瑞博生物科技有限公司)。

        1.3 方法

        1.3.1 動物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組和心肌梗死組,每組20只。假手術(shù)組開胸但不結(jié)扎左冠狀動脈;心肌梗死組阻斷左冠狀動脈前降支7 d。2組均為普通飼料飼養(yǎng),自由飲水。

        1.3.2 小鼠心梗模型的建立 心梗模型制作參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。胸骨左緣第2~4肋開胸,以左冠脈主干為標(biāo)志,在左心耳下方2 mm處進(jìn)針,6-0號絲線結(jié)扎左前降支,當(dāng)結(jié)扎區(qū)域變白,心電圖2個以上的肢導(dǎo)聯(lián)出現(xiàn)ST段上抬0.2 mV則判斷為造模成功。

        1.3.3 HE染色 處死小鼠,用含有肝素的生理鹽水灌洗以去除心臟組織的血液。取心臟,用10%福爾馬林固定組織,脫水,石蠟包埋,切成4 μm厚切片,進(jìn)行HE染色,觀察心肌梗死后心肌細(xì)胞存活及炎癥細(xì)胞浸潤情況。

        1.3.4 qRT-PCR檢測miR-21的含量 應(yīng)用Trizol法提取各組小鼠心臟組織的RNA,用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒,利用莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物特異性反轉(zhuǎn)miR-21和U6。第一步引物退火,取2 μg RNA與1 μL miR-21(100 mg/L)和1 μL U6(100 mg/L)特異性莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物混合,反應(yīng)條件為70℃10 min,4℃10 min。第二步合成cDNA第一鏈,在混合物中分別加入10× buffer、2 μL MgCl2(20.8 mol/L)、1 μL反轉(zhuǎn)錄酶,補(bǔ)水至20 μL,充分混勻,反應(yīng)條件為37℃1 h,4℃10 min。生成的cD? NA取1μL,與10 μL 2×SYBR混合,再加入7 μL水和1 μL上、下游引物,混勻為20 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件為95℃5 min,95℃15 s,60℃60 s,40個循環(huán)。miR-21的表達(dá)水平用Cq值(熒光信號達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)的循環(huán)數(shù))表示,內(nèi)參為U6。引物序列見表1。

        Table 1 The stem-loop and PCR primers of different genes表1 目的基因莖環(huán)引物及PCR引物序列

        1.3.5 小鼠成纖維細(xì)胞的提取 無菌條件下取出心臟于6 cm培養(yǎng)皿中,D-hank’s液漂洗,剪碎心臟放入15 mL離心管中,加入5倍體積0.05%胰酶,37℃水浴5 min,反復(fù)吹打、靜置,待自然沉降后棄去上清液。沉淀加入約5倍體積0.08%胰蛋白酶及0.1%膠原酶Ⅱ混合液,反復(fù)吹打約10 min,離心取沉淀后以10 mL含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸,接種于6 cm培養(yǎng)皿中。60~90 min后更換新鮮20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。

        1.3.6 miR-21 mimic的轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d,胰酶消化成纖維細(xì)胞,接種至6孔板中,使轉(zhuǎn)染前細(xì)胞濃度能夠達(dá)到30%~50%。實驗分3組:隨機(jī)對照組、空白對照組和miR-21 mimic組。各組分別在50 μL Opti-MEM加入1.25 μL PBS、陰性對照儲存液和miR-21 mimic儲存液(20 μmol/L),室溫孵育5 min。用50 μL Opti-MEM稀釋1 μL lipo2000,溫和混勻并室溫孵育5 min。將以上兩液體溫和混勻,室溫孵育20 min。將混合液加入含有細(xì)胞的1 mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔中,溫和混勻,培養(yǎng)4~6 h后,將孔中含mimic-lipo2000混合液的培養(yǎng)基移去,更換新鮮20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,采用熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-21的含量。

        1.3.7 Western blot法測定成纖維細(xì)胞α-SMA及Smad7蛋白的表達(dá) 心臟原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)1周后,按照試劑盒說明提取蛋白,并測定蛋白濃度。在10%聚丙烯酰胺凝膠上行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)移法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)膜后將膜置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h,然后分別加入相對應(yīng)的一抗(1∶500稀釋),4℃孵育過夜。第2天膜浸于一抗溶液中,室溫平衡1 h后,洗膜3次,每次10 min。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育1 h。TBST溶液洗膜3次,每次10 min。利用辣根過氧化物酶HRP-ECL化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶,不做放射自顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

        1.3.8 EdU檢測成纖維細(xì)胞的增殖 成纖維細(xì)胞以(4×103~1×104)/孔接種于96孔板中,實驗分組同1.3.6,每組設(shè)3個復(fù)孔。于轉(zhuǎn)染后2 d每孔加入50 μmol/L EdU試劑100 μL,于37℃5%CO2條件下孵育2 h;棄培養(yǎng)液,每孔加入50 μL 4%多聚甲醛,室溫孵育30 min;棄固定液,每孔加入50 μL 2 g/L甘氨酸,孵育10 min;棄甘氨酸溶液,每孔加入100 μL PBS,孵育5 min;棄PBS,每孔加入100 μL 0.5%Triton,孵育10 min,PBS沖洗1次;每孔加入100 μL 1×Apollo?染色反應(yīng)液,避光、室溫、脫色搖床孵育30 min后,棄染色反應(yīng)液;PBS沖洗1次;每孔加入10 μL 1×DAPI反應(yīng)液,避光、室溫孵育10 min;在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察及圖片采集。按下列公式計算細(xì)胞增殖率(%)=EdU陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)× 100%。

        1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,2組間均數(shù)比較采用t檢驗;多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析,組間多重比較采用LSD-t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 HE染色結(jié)果 常規(guī)光鏡下可見心肌梗死組梗死區(qū)主要是膠原纖維和成纖維細(xì)胞,幾乎無存活心肌細(xì)胞;梗死交界區(qū)由心臟成纖維細(xì)胞和心肌細(xì)胞組成,且梗死區(qū)和交界區(qū)均有炎癥細(xì)胞浸潤,而遠(yuǎn)端區(qū)主要是存活的心肌細(xì)胞,表明小鼠心肌梗死造模成功,見圖1。

        Figure1 The myocardial tissue sections of HE staining(HE,×400)圖1 HE染色光鏡下心肌組織切片(HE,×400)

        2.2 2組心臟梗死交界區(qū)miR-21的基因表達(dá)比較 與無梗死的假手術(shù)組(1.620±0.451)×10-4相比,心肌梗死組梗死交界區(qū)的miR-21的表達(dá)量(6.043± 0.231)×10-4明顯增加(t=12.102,P<0.01)。

        2.3 3組成纖維細(xì)胞中miR-21的基因表達(dá)及EdU陽性率比較 miR-21 mimic組成纖維細(xì)胞中的miR-21基因表達(dá)及EdU陽性率明顯高于隨機(jī)對照組和空白對照組(P<0.01),而后2組差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。

        Table 2 Comparison of gene expression and EdU positive percentage of miR-21 in fibroblast treated with different conditions表2 不同因素處理成纖維細(xì)胞后miR-21基因表達(dá)及EdU陽性率比較 (±s)

        Table 2 Comparison of gene expression and EdU positive percentage of miR-21 in fibroblast treated with different conditions表2 不同因素處理成纖維細(xì)胞后miR-21基因表達(dá)及EdU陽性率比較 (±s)

        **P<0.01;a與(1)比較,b與(2)比較,P<0.01

        組別隨機(jī)對照組(1)空白對照組(2)miR-21 mimic組(3)F n333 miR-21/U6(×10-4)1.143±0.064 1.017±0.201 4.839±0.705ab 15.418**EdU陽性率(%)12.553±1.227 13.946±1.550 27.892±1.645ab 32.632**

        2.4 Smad7和α-SMA蛋白表達(dá)水平的變化 隨機(jī)對照組和空白對照組的成纖維細(xì)胞Smad7表達(dá)較強(qiáng),miR-21 mimic組轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞后Smad7的表達(dá)明顯下調(diào),條帶灰度減弱。同時miR-21 mimic組α-SMA的表達(dá)顯著上調(diào),條帶灰度增強(qiáng)??瞻讓φ战M與隨機(jī)對照組Smad7及α-SMA蛋白表達(dá)量無明顯差異,見圖2。

        Figure 2 The expression of Smad7 and α-SMA in fibroblast after overexpression of miR-21 detected by Western blot assay圖2 Western blot檢測過表達(dá)miR-21后成纖維細(xì)胞Smad7和α-SMA蛋白的表達(dá)情況

        3 討論

        3.1 miR-21參與心梗后心臟的損傷和修復(fù) 目前由于臨床溶栓及急診經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)的廣泛應(yīng)用,已明顯減低了急性心肌梗死的死亡率。但心臟破裂作為急性心肌梗死的常見并發(fā)癥之一幾乎是致命性的,且其發(fā)生尚不可預(yù)測,嚴(yán)重威脅患者生命。心梗后心臟破裂的發(fā)生機(jī)制主要與心臟的重塑有關(guān)。已有文獻(xiàn)報道多種microRNA參與心臟重塑的病理過程[4]。miR-21是由單個基因編碼,在進(jìn)化上高度保守的microRNA。Lagos-Quintana等[5]報道m(xù)iR-21可以在心臟、小腸、脾臟等多種器官中表達(dá)。有研究證實,miR-21參與多種心血管疾病[6]。最新研究表明miR-21可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β受體Ⅲ(TGFβRⅢ)的表達(dá)調(diào)控心臟纖維化[7]。Yin等[8]發(fā)現(xiàn)小鼠心肌梗死24 h后,心肌梗死區(qū)miR-21表達(dá)顯著上調(diào)。Cheng等[9]在小鼠的心梗模型中證實上調(diào)的miR-21可明顯減少心肌梗死面積。本研究中,筆者成功構(gòu)建小鼠心肌梗死模型,HE染色顯示梗死區(qū)心肌細(xì)胞基本消失,并且有大量炎癥細(xì)胞的浸潤。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-21在心肌梗死組梗死交界區(qū)表達(dá)較對照組顯著上調(diào),表明miR-21參與心梗后心臟損傷和修復(fù)過程。

        3.2 miR-21通過抑制Smad7基因激活成纖維細(xì)胞的增殖與分化 成纖維細(xì)胞的增殖與分化在心肌梗死后的心臟重塑過程中扮演重要角色。研究表明TGF-β信號通路是調(diào)控成纖維細(xì)胞的增殖與分化的主要信號通路[10]。本研究證實過表達(dá)miR-21可以明顯激活成纖維細(xì)胞的增殖和分化。Smad7基因是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制蛋白,它與細(xì)胞膜上TGF-β受體競爭性結(jié)合,阻斷TGF-β信號在胞漿內(nèi)的傳導(dǎo),下游信號紊亂是TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路失活的機(jī)制之一[11]。而抑制TGF-β/Smads信號通路可以減輕糖尿病導(dǎo)致的腎臟纖維化[12]。在本研究中,筆者利用TargetScan 4.0預(yù)測到Smad7為miR-21的下游靶基因,結(jié)果表明在成纖維細(xì)胞中過表達(dá)miR-21可以明顯抑制Smad7的表達(dá)。因此推測在心梗模型下,miR-21通過抑制Smad7的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)TGF-β對成纖維細(xì)胞的分化,最終改善了心臟的重塑。

        綜上所述,在小鼠心肌梗死模型中,miR-21在梗死交界區(qū)表達(dá)明顯上調(diào),通過抑制靶基因Smad7的表達(dá),促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖和分化,進(jìn)而促進(jìn)心梗后心臟組織的修復(fù),此結(jié)果為有效預(yù)防心梗后心臟破裂提供了新的線索和治療靶點。

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