白亞玲 徐金升 馮偉勛 張俊霞 崔立文 張慧然 張勝雷

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）在我 國的患病率高達10.8%[1]，心血管疾?。╟ardiovascu? lar disease，CVD）是CKD患者主要的并發(fā)癥之一，并且呈逐年進展的趨勢。近年來研究發(fā)現(xiàn)血管鈣化在CKD患者中非常普遍，亦是CVD發(fā)生的獨立危險因素[2]。Kanbay等[3]研究發(fā)現(xiàn)40%～70%的透析患者可發(fā)生冠狀動脈鈣化，且CKD患者比一般人群更容易發(fā)生血管鈣化?，F(xiàn)大多數(shù)學者普遍認為CKD患者的血管鈣化發(fā)病的中心環(huán)節(jié)為血管平滑肌細胞向成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化[4]，而磷在其中起著關(guān)鍵性的作用，同時還包含許多其他復雜因素，但具體機制還未完全闡明，對血管鈣化也缺乏行之有效的治療手段。有研究顯示鎂可能作為磷的結(jié)合劑，降低血磷水平，從而抑制血管鈣化[5]。本研究旨在探討增加鎂離子的濃度是否對血管鈣化有影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 兔抗鼠平滑肌肌動蛋白單克隆抗體購自北京博奧森生物有限公司，酶標儀（HT2型）購自奧地利Anthos公司，倒置相差顯微鏡（LH50A型，OLYMPUS），胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Hyclone公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國GIBCO公司，鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)（SP）免疫組化試劑盒購自上海博海生物工程，二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒購自中山金橋股份有限公司，噻唑藍（MTT）試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 原代培養(yǎng)獲取大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs），進行形態(tài)學及免疫細胞鑒定，后采用完全隨機法將VSMCs分為陰性對照組、高磷組、鎂干預組。陰性對照組采用含10%胎牛血清培養(yǎng)，高磷組采用高磷培養(yǎng)基（含10 mmol/L β－甘油磷酸）培養(yǎng)，鎂干預組在高磷培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上分別加入不同濃度的氯化鎂，使鎂離子的終濃度分別為1 mmol/L（鎂干預組1）、2 mmol/L（鎂干預組2）和3 mmol/L（鎂干預組3），共刺激7 d。

1.2.2 細胞鑒定 參照文獻[2]進行細胞鑒定。形態(tài)學觀察：應(yīng)用倒置相差顯微鏡觀察細胞大小、形態(tài)、生長特點及排列方式等。免疫細胞化學染色：6孔板內(nèi)用消毒的蓋玻片制作細胞爬片，待細胞貼壁生長至60%～70%時，棄去培養(yǎng)基，用免疫細胞化學方法鑒定平滑肌細胞特異性抗體a-SMA ac?tin。DAB顯色，蘇木素輕度復染，經(jīng)分化，脫水，透明，封片，在顯微鏡下觀察。

1.2.3 鈣化檢測 （1）茜素紅染色[6-7]：取生長至4～5代的細胞以5×104個/孔密度接種于6孔板內(nèi)，刺激7 d，茜素紅進行鈣化染色，倒置顯微鏡下觀察照相。鈣鹽沉積為橘紅色。（2）細胞內(nèi)鈣含量測定[8]：取4～5代細胞以2×105/孔密度接種于6孔板，干預7 d，細胞用鹽酸脫鈣取上清，鈣定量檢測試劑盒測定鈣含量，脫鈣后的細胞用0.1 mol/L NaOH和0.1%的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解30 min，二辛可酸（BCA）法測定細胞蛋白含量，結(jié)果用細胞鈣含量比蛋白含量表示（μg/mg蛋白）。實驗每組設(shè)3個復孔。（3）堿性磷酸酶（ALP）活性測定[7]：取4～5代細胞以2×105個/孔密度接種于6孔板，干預7 d，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞3次，每孔加入500 μL 0.1% Triton X-100置4℃環(huán)境中約12～24 h，然后反復吹打裂解細胞后置于離心管中離心，按化學發(fā)光法檢測ALP活性。

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測細胞內(nèi)核心結(jié)合因子α1（Cbfα1）mRNA的表達 細胞總RNA提取采用Trizol一步法。引物序列由primer 5.0軟件設(shè)計。Cbfα1上游引物5′-CCGCACGACAACCGCACCAT-3′，下游引物5′-CGCTCC?GGCCCACAAATCTC-3′；GAPDH上游引物5′-CAAGGT?CATCCATGACAACTTTG-3′，下游引 物 5′-GTCCAC?CACCCTGTTGCTGTAG-3′。實驗重復3次，以GAPDH作為內(nèi)對照，計算相對含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，2組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs原代培養(yǎng) 大鼠胸主動脈組織塊貼壁3～4 d后可見細胞從組織塊邊緣爬出，細胞為長梭形，呈束狀排列，5～6 d成同心圓狀細胞團，形成明顯的細胞生長暈，并圍繞組織塊邊緣呈束狀向外呈放射狀延伸，約6～7 d后融合成片，細胞可達亞融合狀態(tài)，呈接觸抑制狀態(tài)，此時可傳代。細胞傳代后，未貼壁時細胞呈橢圓形，不透明，4～6 h后開始貼壁，貼壁后的細胞逐漸伸展，星形或不規(guī)則形，以梭形為主，細胞核呈卵圓形，透明度增加，相互重疊生長，呈典型的“峰-谷”樣表現(xiàn)，見圖1。

Figure 1 Primary culture of VSMCs(×100)圖1 VSMCs原代培養(yǎng)(×100)

2.2 VSMCs細胞鑒定 HE染色及瑞氏-姬姆薩染色可見細胞呈梭形，胞漿豐富，核大而圓或橢圓。免疫細胞化學染色可見細胞胞漿表達強陽性，免疫反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色，見圖2。傳代純化，細胞生長特性未見異常改變。

2.3 鈣化檢測

2.3.1 茜素紅染色結(jié)果 與陰性對照組比較，高磷組及鎂干預組的VSMCs鈣化染色均加重。與高磷組比較，鎂干預組隨著鎂離子濃度增大鈣化結(jié)節(jié)染色逐漸降低，鎂干預組2開始出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)縮小，并呈一定濃度依賴性，鎂干預組3鈣化結(jié)節(jié)達最小，見圖3。

Figure 2 The identification of VSMCs圖2VSMCs細胞鑒定

Figure 3 Alizarin red staining of VSMCs（×100）圖3 茜素紅染色（×100）

2.3.2 不同濃度鎂離子對VSMCs中鈣含量的影響 與陰性對照組相比，高磷組及鎂干預組刺激VSMCs后，鈣含量均顯著增加。鎂干預組隨著鎂離子濃度增大鈣含量逐漸降低，除鎂干預組1與高磷組差異無統(tǒng)計學意義外，鎂干預組2和鎂干預組3均低于高磷組（均P＜0.05），見圖4。

2.3.3 不同濃度鎂離子對VSMCs ALP的影響 除鎂干預組3 VSMCs ALP水平與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義外，其余組均高于陰性對照組（均P＜0.05）。鎂干預組隨鎂離子濃度增大ALP活性逐漸降低，且均低于高磷組（均P＜0.05），見圖5。

Figure 4 Comparison of the calcium content between different groups圖4 各組VSMCs鈣含量的比較

Figure 5 Comparison of ALP levels between different groups圖5 各組VSMCs ALP水平的比較

2.4 不同濃度鎂離子對VSMCs中Cbfα1 mRNA表達的影響 見圖6。除鎂干預組3 VSMCs中Cbfα1 mRNA的表達與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義外，其余組均高于陰性對照組（均P＜0.05）。鎂干預組隨著鎂離子濃度增大Cbfα1 mRNA的表達水平逐漸降低，且均明顯低于高磷組（均P＜0.05）。

Figure 6 Expressions of Cbfa1 in VSMCs detected by RT-PCR圖6RT-PCR檢測VSMCs中Cbfα1的表達

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)CKD患者的低鎂血癥與血管鈣化和CVD死亡率相關(guān)[3]，而血管鈣化又是心血管疾病的重要環(huán)節(jié)。在CKD患者中血管鈣化有其特殊性，主要表現(xiàn)為中膜鈣化，位于血管中膜的VSMCs在CKD患者血管鈣化中起著關(guān)鍵作用[9]。Ishimura等[10]研究發(fā)現(xiàn)血清鎂在一定范圍內(nèi)與血管鈣化負相關(guān)，血鎂濃度與透析患者生存率呈正相關(guān)。

VSMCs的成骨樣表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，本研究通過使用含有10 mmol/L β－甘油磷酸鈉的培養(yǎng)基誘導大鼠VSMCs發(fā)生成骨樣轉(zhuǎn)分化和鈣化。茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色發(fā)現(xiàn)，高磷組及鎂干預組VSMCs鈣化染色較陰性對照組均加重，但鎂干預組隨著鎂離子濃度的增加鈣化結(jié)節(jié)逐漸變小，鎂離子濃度為2 mmol/L開始出現(xiàn)鈣化結(jié)節(jié)縮小，3 mmol/L鈣化結(jié)節(jié)達最小。鈣含量檢測結(jié)果與鈣化染色結(jié)果基本一致，二者均提示鎂離子可以抑制高磷誘導的鈣化，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性，這與Figueiredo等[11]的研究結(jié)果相似。ALP是成骨細胞形成的早期標志物，在正常VSMCs中的表達水平較低，在鈣化的血管和心臟瓣膜組織中的表達水平明顯增高[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與高磷組比較，鎂干預組隨著鎂離子濃度的增大ALP活性逐漸降低，且呈一定的濃度依賴性，進一步驗證了鎂離子具有抑制VSMCs轉(zhuǎn)分化和鈣化的作用。

Cbfα1是成骨樣細胞表型轉(zhuǎn)化的的特異性因子，是骨形成過程中的主要調(diào)節(jié)因子，其也可在發(fā)生鈣化的VSMCs中表達[12]。Cbfα1在ALP的表達調(diào)節(jié)中起著重要作用，同時也是成骨樣轉(zhuǎn)分化的分子標志物[13]。Byon等[14]研究發(fā)現(xiàn)VSMCs在雙氧水刺激下，其Cbfα1的表達與ALP活性的變化有緊密關(guān)系。本研究結(jié)果顯示，鎂離子可抑制VSMCs中Cbfα 1 mRNA的表達，且隨著鎂離子濃度增大，Cbfα1 mRNA的表達水平逐漸降低。綜合本研究結(jié)果，并結(jié)合相關(guān)文獻，筆者推測鎂離子對VSMCs的鈣化抑制作用可能是通過降低VSMCs中Cbfα1的表達來實現(xiàn)的。VSMCs中Cbfα1表達降低后，又通過其下游某一信號通路而致使ALP活性下降，進一步抑制血管鈣化的發(fā)生，但二者之間的具體作用機制尚待進一步研究。

[1] Zhang L,Wang F,Wang L,et al.Prevalence of chronic kidney dis? ease in China:a cross-sectional survey[J].Lancet,2012,379(9818): 815-822.doi:10.1016/S0140-6736(12)60033-6.

[2] Pun PH,Smarz TR,Honeycutt EF,et al.Chronic kidney disease is associated with increased risk of sudden cardiac death among pa?tients with coronary artery disease[J].Kidney Int,2009,76(6):652-658.doi:10.1038/ki.2009.219.

[3] Kanbay M,Goldsmith D,Uyar ME,et al.Magnesium in chronic kid?ney disease:challenges and opportunities[J].Blood Purif,2010,29 (3):280-292.doi:10.1159/000276665.

[4] Disthabanchong S.Vascular calcification in chronic kidney disease: Pathogenesis and clinical implication[J].World J Nephrol,2012,1 (2):43-53.

[5] M de Francisco AL,Rodríguez M.Magnesium-its role in CKD[J]. Nefrologia,2013,33(3):389-399.doi:10.3265/Nefrologia.pre2013. Feb.11840.

[6] Idelevich A,Rais Y,Monsonego-Ornan E.Bone Gla protein in?creases HIF-1alpha-dependent glucose metabolism and induces cartilage and vascular calcification[J].Arterioscler Thromb Vasc Bi?ol,2011,31(9):e55-71.doi:10.1161/ATVBAHA.111.230904.

[7]Aoshima Y,Mizobuchi M,Ogata H,et al.Vitamin D receptor activa?tors inhibit vascular smooth muscle cell mineralization induced by phosphate and TNF-α[J].Nephrol Dial Transplant,2012,27(5): 1800-1806.doi:10.1093/ndt/gfr758.

[8]Louvet L,Büchel J,Steppan S,et al.Magnesium prevents phos?phate-induced calciベcation in human aortic vascular smooth mus?cle cells[J].Nephrol Dial Transplant,2013,28(4):869-878.doi: 10.1093/ndt/gfs520.

[9] Vipattawat K,Kitiyakara C,Phakdeekitcharoen B,et al.Vascular Calcification in Long-term Kidney Transplantation[J].Nephrology (Carlton).2014 Jan 22.doi:10.1111/nep.12210.[Epub ahead of print]

[10]Ishimura E,Okuno S,Kitatani K,et al.Significant association be?tween the presence of peripheral vascular calcification and lower se?rum magnesium in hemodialysis patients[J].Clin Nephrol,2007,68 (4):222-227.

[11]Figueiredo CP,Rajamannan NM,Lopes JB,et al.Serum phosphate and hip bone mineral density as additional factors for high vascular calcification scores in a community-dwelling:the S?o Paulo Ageing &Health Study(SPAH)[J].Bone,2013,52(1):354-359.doi: 10.1016/j.bone.2012.10.019.

[12]Zhou S,Fang X,Xin H,et al.Osteoprotegerin inhibits calcification of vascular smooth muscle cell via down regulation of the Notch1-RBP-Jκ/Msx2 signaling pathway[J].PLoS One,2013,8(7):e68987. doi:10.1371/journal.pone.0068987.

[13]白亞玲.尿毒癥患者血清對血管平滑肌細胞鈣化及Ⅰ型膠原表達的影響[J].山東醫(yī)藥,2013,53(26):5-8.

[14]Byon CH,Javed A,Dai Q,et al.Oxidative stress induces vascular calcification through modulation of the osteogenic transcription fac?tor Runx2 by AKT signaling[J].J Biol Chem,2008,283(22):15319-15327.doi:10.1074/jbc.M800021200.