柳州市柳鐵中心醫(yī)院病理科，廣西 柳州 545007

液基細胞學聯(lián)合免疫細胞化學在痰液脫落細胞診斷非小細胞肺癌中的應用

陳江帆 李春英 孫秀娟 鄭紹光

柳州市柳鐵中心醫(yī)院病理科，廣西 柳州 545007

背景與目的：肺癌中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)發(fā)病率最高，NSCLC痰液脫落細胞學診斷已成為肺癌早期診斷的重要輔助手段。本研究旨在探討液基細胞學和免疫細胞化學方法在NSCLC惡性痰液脫落細胞學標本的分類與診斷中的應用價值。方法：應用液基薄層細胞學自動涂片技術方法篩查到可疑腫瘤細胞及腫瘤細胞的惡性痰液標本共530例進行細胞包埋連續(xù)切片，分別作NSCLC腫瘤細胞標志物細胞角蛋白7(cytokeratin-7，CK7)、細胞角蛋白5/6(cytokeratin-5/6，CK5/6)、甲狀腺轉錄因子-1(thyroid transcription factor-1，TTF-1)、P63、上皮膜抗原(epithelial membrane antigen，EMA)免疫細胞化學染色。結果：530例NSCLC惡性痰液患者確診為肺腺癌265例，鱗癌246例，腺鱗癌19例。TTF-1和CK7在腺癌中有明顯高表達，陽性表達率為92.45%(245/265)和91.70%(243/265)；CK5/6和P63在鱗癌中有明顯高表達，陽性表達率為97.15%(239/246)和99.59%(245/246)。結論：液基細胞學與免疫細胞化學技術相結合在痰液標本診斷中有很重要的臨床意義，CK7、CK5/6、TTF-1、P63、EMA聯(lián)合可用于NSCLC惡性痰液的分類與診斷，值得在臨床細胞病理學診斷中推廣應用。

液基細胞學；免疫細胞化學；痰液；非小細胞肺癌

痰液細胞病理學檢查是臨床病理學檢查的主要手段之一，也是幫助臨床查找病因、了解病情進展的重要方法。膜式超薄液基細胞學檢測技術是近年應用于臨床細胞病理學診斷的一項新技術，免疫細胞化學在脫落細胞學檢查中具有重要意義，有研究表明，液基細胞學聯(lián)合免疫細胞化學檢查在惡性腫瘤細胞診斷中具有重要意義［1-2］。本研究應用TCT聯(lián)合免疫細胞化學方法，檢測痰液標本中難以明確診斷的非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，探討NSCLC的分類與診斷。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

收集柳州市柳鐵中心醫(yī)院2012年7月—2013年7月門診及病房患者痰液標本1 680例，囑患者早晨咳痰之前漱口、刷牙以避免食物殘渣和細菌的污染。指導患者深呼吸后用力咳痰，重復數(shù)次，咳出肺深部的痰液，盡量選擇帶有血絲部分或者黏液部分的痰液收集在塑料盒內(nèi)送檢。應用液基細胞學檢測技術初檢，從篩查到可疑瘤細胞及瘤細胞標本中選取530例，其中男性321例，女性209例，年齡≤50歲者192例，＞50歲者338例，全部患者最后經(jīng)CT、磁共振及組織病理學確診均為NSCLC。

1.2 主要試劑

CK7、CK5/6、TTF-1、P63、EMA鼠抗人單克隆抗體和辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 液基細胞學檢測技術

將痰液標本倒入液基細胞學檢測專用保存杯內(nèi)，每10 mL加入l mL黏液松解劑DTT(二硫蘇糖醇)，混合后在震蕩器上震蕩15 min，如混合液中仍有凝結，可再增加DTT，直至黏液完全溶解。將溶解后的痰液倒入50 mL離心管中，2 000 r/min離心5 min后，棄上清液，加入50 mL泰普細胞清洗液繼續(xù)2 000 r/min離心5 min后，吸取適量沉淀物加入泰普細胞保存瓶，靜置10 min，用泰普液基細胞儀制成薄層細胞涂片，95%的酒精固定10 min，巴氏染色。

1.3.2 細胞包埋切片技術

痰液按照液基細胞學步驟加入DDT震蕩離心并加入細胞清洗液再次離心后，棄上清液，加入95%乙醇固定8 h。棄上清液后加入二甲苯透明0.5～1.0 h，向透明后的細胞團塊中加入液體石蠟浸透，一般需經(jīng)3次，每次0.5～1.0 h，將浸透石蠟的細胞團塊放入新包埋器中并倒入熔化的新蠟，待石蠟凝固后，進行4 μm厚連續(xù)切片。

1.3.3 免疫細胞化學技術

常規(guī)石蠟包埋切片后，采用鏈霉素抗生物素蛋白－過氧化物酶法(streptavidin-peroxidase，S-P)進行免疫細胞化學染色。切片常規(guī)烤片，脫蠟，水化，0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓抗原修復3 min；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷液37 ℃溫育30 min；非免疫性羊血清37 ℃溫育40 min；一抗4 ℃溫育過夜，CK7、CK5/6、TTF-1、P63、EMA稀釋比例為1∶100；辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗37 ℃溫育30 min；鏈霉素親和素過氧化物酶溶液37 ℃溫育30 min；新配置的DAB溶液顯色；蘇木素復染，中性樹膠封片。各步之間用pH值為7.4左右的PBS沖洗3次，每次5 min。用PBS代替一抗作陰性對照，用已知陽性肺癌切片作陽性對照。

免疫細胞化學結果判定標準：細胞核、細胞質(zhì)或細胞膜中出現(xiàn)棕黃色顆粒的細胞為陽性細胞，每張切片在光鏡下隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個腫瘤細胞。著色強度分為：無色為0分，淺黃色或黃色為1分，棕黃色為2分。陽性細胞數(shù)分為：＜10%為0分，10%～50%為1分，＞50%為2分，兩項得分相乘結果＞2為陽性(+)，≤2為陰性(-)。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用四格表資料χ2檢驗(不滿足條件時用Fisher確切概率法)分析各組計數(shù)資料，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 液基細胞學檢測結果

鏡下顯示細胞散在分布或聚集成團塊狀排列，核異型性明顯，核質(zhì)細膩，N/C比例失調(diào)，核大小不等，液基細胞學檢測初步診斷為可疑瘤細胞；而非可疑瘤細胞則以壞死脫落的黏膜上皮細胞為主，伴有或不伴有部分炎性細胞(圖1A、B、C)。

2.2 免疫細胞化學染色結果

對液基細胞學檢測篩查到可疑瘤細胞的痰液標本，做石蠟細胞包埋切片，進一步做免疫細胞化學染色(圖1D、E、F、G、H)。

2.3 組織學常規(guī)染色結果

肺腺癌瘤細胞異型性明顯，鏡下可見腺腔形成，腫瘤細胞排列成管狀或腺樣結構(圖2A)。肺鱗癌鏡下可見角化珠和或細胞間橋，腫瘤細胞核位于細胞中央，不規(guī)則而深染，有一個或多個小核仁，細胞質(zhì)豐富，腫瘤細胞呈散在分布或黏附性聚集(圖2B)。

圖2 NSCLC組織學圖片F(xiàn)ig. 2 The images of NSCLC tissue

2.4 免疫組化結果分析

TTF-1在肺腺癌、肺鱗癌、腺鱗癌標本內(nèi)的表達率分別為92.45%、4.47%、36.84%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；CK5/6在肺腺癌、肺鱗癌、腺鱗癌標本內(nèi)的表達率分別為9.81%、97.15%、47.37%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；P63在肺腺癌、肺鱗癌、腺鱗癌標本內(nèi)的表達率分別為3.77%、99.59%、57.89%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；CK7在肺腺癌、肺鱗癌、腺鱗癌標本內(nèi)的表達率分別為91.70%、16.67%、42.11%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；EMA在肺腺癌、肺鱗癌、腺鱗癌標本內(nèi)的表達率分別為82.26%、80.49%、78.95%，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，表1)。

表1 530例NSCLC中免疫細胞化學指標的陽性表達Tab. 1 The positive expression of immunocytochemistry in 530 cases of NSCLC[n(%)]

3 討 論

近年來，肺癌的發(fā)病率及病死率逐年升高，每年新增17%的肺癌患者和將近25%的患者死亡［3］。NSCLC在肺癌中占80%，患者放療化療的效果并不明顯，5年生存率＜15%［4］。痰液脫落細胞學檢查是早期診斷肺癌的重要方法之一，具有簡便易行、安全無痛、無創(chuàng)、可重復多次檢查，是防癌普查的重要手段之一。多年來應用的傳統(tǒng)痰液制片方法存在著一些不利因素，如背景不清晰、細胞涂片厚薄不一、壞死細胞碎屑較多、加之黏液的干擾常將腫瘤細胞遮蓋掩蔽等。液基細胞學檢測技術是近年應用于臨床細胞病理學診斷的一項新技術。液基細胞學檢測應用于痰液，能夠最大限度的利用標本，并通過消黏、離心將痰液中的黏液和炎性細胞等與腫瘤細胞分離，利用特有的薄層涂片技術將細胞集中到一個2 cm大小背景的范圍內(nèi)，涂片背景干凈，細胞分布均勻，結構清晰。液基細胞學檢測變革了標本采集和處理方法，而且提高了制片質(zhì)量，改善了觀察效果；細胞圖像清晰，層次分明，核膜核仁及染色質(zhì)等細胞細微結構清晰，三維立體感突出，從而減少了可疑例數(shù)，明確了診斷［5］。我們根據(jù)TCT檢查結果可以初步篩選出異型增生和可疑瘤細胞痰液標本，但不能準確地對NSCLC分類以及鑒別診斷，還需進一步做免疫細胞化學染色。

本研究中530例痰液首先經(jīng)液基細胞學檢測篩查到可疑腫瘤細胞或腫瘤細胞，然后經(jīng)石蠟包埋切片，標記NSCLC腫瘤細胞標志物抗體CK7、CK5/6、TTF-1、P63、EMA，最終CK7、TTF-1、EMA聯(lián)合表達證實為肺腺癌265例，CK5/6、P63、EMA聯(lián)合表達證實為肺鱗癌246例，CK7、CK5/6、TTF-1、P63、EMA聯(lián)合表達證實為肺腺鱗癌19例。值得注意的是，所有NSCLC痰液標本中，未發(fā)現(xiàn)TTF-1和CK5/6同時陰性表達者。其中TTF-1和CK7在肺腺癌中有明顯高表達陽性表達率分別為92.45%和91.70%，而在肺鱗癌中低表達或不表達，陽性表達率分別為4.47%和16.67%；CK5/6和P63在肺鱗癌中有明顯高表達陽性表達率分別為97.15%和99.59%，而在肺腺癌中低表達或不表達，陽性表達率分別為9.81%和3.77%，與最近Mukhopadhyay等［6］研究結果趨于一致。EMA在NSCLC各類型中陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。TTF-1又稱甲狀腺轉錄因子1是一種組織特異性核轉錄因子，選擇性的表達于Ⅱ型肺泡細胞、細支氣管上皮細胞、甲狀腺濾泡細胞、甲狀腺濾泡旁C細胞等區(qū)域。TTF-1在原發(fā)性肺癌中主要表達于肺腺癌和NSCLC中，在其他組織類型肺癌中表達較少甚至不表達［7］。CK5/6主要表達于鱗狀上皮和導管上皮的基底細胞，可用于鱗癌和腺癌的鑒別診斷［8］。P63基因是P53基因家族的新成員，其表達直接或間接影響細胞的增殖活性［9］。正常肺組織中，P63表達于支氣管儲備細胞，而不表達于纖毛細胞、肺泡上皮細胞或非上皮細胞。P63的表達可以解釋上述某些細胞具有鱗狀上皮化生或其來源的腫瘤具有鱗狀細胞分化的特征。相反，不表達P63的腫瘤(如腎腫瘤、結腸腫瘤等)很少發(fā)生鱗狀上皮化生。P63基因可能對肺鱗狀細胞發(fā)生、發(fā)展起到一個特別重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，P63主要表達于肺鱗狀細胞癌中，陽性表達率高于90%［10］。CK7多在卵巢、肺、乳腺的上皮細胞質(zhì)中表達，可作為肺腺癌分化的客觀指標 。一般非上皮來源的細胞無表達，在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈陽性反應。CK7主要用于腫瘤的鑒別診斷，判斷轉移部位腫瘤細胞的來源［11］。EMA又稱上皮膜抗原是從人乳脂小體膜中分離出來的一種蛋白質(zhì)，廣泛存在于各種上皮細胞系結構。研究表明EMA在乳腺癌、胰腺癌、肺鱗癌、肺腺癌、惡性間皮瘤等上皮源性腫瘤中表達，是一種上皮性腫瘤的標志物［12］。因此，聯(lián)合應用CK7、CK5/6、TTF-1、P63、EMA等抗體，可用于NSCLC惡性痰液的分類與診斷。

以上研究表明，在痰液中運用TCT技術聯(lián)合免疫細胞化學方法檢測有助于NSCLC的分類與鑒別診斷，值得在臨床細胞病理學診斷中推廣應用。

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The non-small cell lung cancer diagnosis by thinprep cytology test and immunocytochemistry in sputum exfoliated cells

CHEN Jiang-fan, LI Chun-ying, SUN Xiu-juan, ZHENG Shao-guang (Department of Pathology, Liuzhou Municipal Liutie Central Hospital, Liuzhou Guangxi 545007, China)

CHEN Jiang-fan E-mail: imun.chenjiangfan@163.com

Background and purpose:The non-small cell lung cancer (NSCLC) has been the highest disease incidence in lung cancer, sputum cytology diagnosis has become an important adjunct to the early diagnosis of lung cancer. The purpose of this study was to investigate the value of thinprep cytological and immunocytochemical method in differentiatial diagnosis of exfoliated cells of malignant sputum in NSCLC.Methods:Sputum samples were detected with thinprep cytology test, a total of 530 cases suspicious tumor cells and malignant tumor cells sputum specimens were randomly selected in continuous paraffin-embedded sections, respectively, NSCLC tumor cell markers CK7, CK5/6, TTF-1, P63, EMA were evaluted by immunocytochemical staining.Results:Of the 530 cases of malignant sputum, these were confirmed 265 cases of lung adenocarcinoma, 246 cases of squamous carcinoma, 19 cases of adeno-squamous carcinoma. Moreover, TTF-1 and CK7 were signi fi cantly higher expressed in adenocarcinoma, the positive rates were 92.45% (245/265) and 91.70% (243/265); CK5/6 and P63 were signi fi cantly higher expressed in squamous carcinoma, the positive rates were 97.15% (239/246) and 99.59% (245/246).Conclusion:Liquid-based cytology combined with immunocytochemistry had important clinical value in classification and identification of sputum samples, the combination of CK7, CK5/6, TTF-1, P63, EMA can be used for classi fi cation and identi fi cation of malignant sputum samples between NSCLC, is worthy of promoting in clinical cytopathology diagnosis.

Thinprep cytological; Immunocytochemistry; Sputum; Non-small cell lung cancer

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.03.005

R734.2

A

1007-3639(2014)03-0182-05

2014-01-14

2014-02-24）

陳江帆 E-mail:imun.chenjiangfan@163.com