王興 姜真 孫長崗

1.山東省禹城市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 德州 251200；2.濰坊市中醫(yī)院腫瘤中心，山東 濰坊 261041

乙醛脫氫酶1與乳腺癌耐藥蛋白在乳腺癌中的表達及相關(guān)性研究

王興1 姜真1 孫長崗2

1.山東省禹城市人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，山東 德州 251200；2.濰坊市中醫(yī)院腫瘤中心，山東 濰坊 261041

背景與目的：乳腺癌患者對化療藥物耐藥是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。有研究證實，腫瘤干細胞標(biāo)志物乙醛脫氫酶1(aldehyde dehydrogenase 1，ALDH1)與某些抗癌藥物(如環(huán)磷酰胺、順鉑等)的耐藥有關(guān)，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)這些藥物治療后的患者癌灶細胞中ALDH1的含量較治療前高。乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)不僅在正常組織中表達，更高表達于治療后的乳腺癌中，提示這可能與腫瘤耐藥機制相關(guān)。關(guān)于在乳腺癌患者中兩者是否存在共表達的研究很少，本研究主要探討ALDH1、BCRP與臨床病理特征的關(guān)系及兩種蛋白表達之間的相關(guān)性。方法：采用免疫組化法檢測乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織石蠟切片中ALDH1與BCRP的表達，研究并探討它們與臨床病理特征的關(guān)系以及兩者表達之間是否有相關(guān)性。結(jié)果：ALDH1、BCRP在乳腺癌及癌旁乳腺組織中表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.685，P=0.000；χ2=12.243，P=0.000)。ALDH1的表達與患者年齡、病理分期、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級及雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor，HER-2)狀態(tài)均無關(guān)(P＞0.05)；BCRP的表達與HER-2高表達有關(guān)，HER-2高表達組的癌組織中BCRP陽性表達率較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝5.289，P＝0.021)。BCRP的表達與患者年齡、腫瘤分化程度、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期及ER、PR狀態(tài)無關(guān)(P＞0.05)；乳腺癌腫瘤干細胞標(biāo)志物ALDH1與BCRP無相關(guān)性(r=-0.039，P=0.786)。結(jié)論：ALDH1可能是區(qū)別于其他耐藥蛋白的一種獨立的生物學(xué)因子，參與乳腺癌的化療耐藥或腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。

乳腺浸潤性導(dǎo)管癌；腫瘤干細胞；乙醛脫氫酶1；乳腺癌耐藥蛋白；免疫組織化學(xué)

1 資料和方法

1.1 研究對象

標(biāo)本取自禹城市人民醫(yī)院病理科2009年1月—2012年12月接受改良根治性手術(shù)切除的乳腺浸潤性導(dǎo)管癌石蠟包埋組織共51例，取距癌組織邊緣5 cm處正常乳腺組織30例為陰性對照。收集并分析臨床病理資料：患者均為女性，年齡28～76歲，中位年齡50歲，其中28～50歲26例，≥50歲25例；絕經(jīng)后23例，絕經(jīng)前27例；腫瘤最大直徑＜2.0 cm 15例、2.1～5.0 cm 28例、≥5.0 cm 8例；患者術(shù)前均未行放化療，病理類型(按2003年WHO腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn))都是浸潤性導(dǎo)管癌(非特殊型)；組織學(xué)分級(按EISton和ElliS法)：高分化4例，中分化42例，低分化5例；TNM分期(按國際抗癌聯(lián)盟UICC分期標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ期8例，Ⅱ期31例，Ⅲ期12例，Ⅳ期0例；伴腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例，無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例；雌激素受體(estrogen receptor，ER)表達陽性37例，陰性14例；孕激素受體(progesterone receptor，PR)表達陽性32例，陰性19例；人類表皮生長因子受體(human epidermal growth factor receptor，HER-2)高表達(++～+++)42例，低表達(-～+) 9例。

乳腺癌臨床T N M分期標(biāo)準(zhǔn)為0期：TisN0M0；I期：T1N0M0；Ⅱa期：T0N1M0、T1N1M0、T2N0M0；Ⅱb期：T2N1M0、T3N0M0；Ⅲa期：T0N2M0、T1N2M0、T2N2M0、T3N1-2M0；Ⅲb期：T4NxM0、TxN3M0；Ⅳ期：TxNxM1。

1.2 免疫組化方法及試劑

收集所有石蠟組織進行連續(xù)切片，制成4 μm厚切片若干張，進行免疫組化染色。每例標(biāo)本選4張切片，3張用于免疫組化染色，剩余1張留作備用。石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，pH為6.0檸檬酸加熱抗原修復(fù)；3%H2O2阻斷過氧化物酶；分別加入一抗(抗ALDH1兔單克隆抗體，美國Abcam公司生產(chǎn)，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司代購，實驗稀釋濃度為 1∶200；抗 BCRP鼠單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，實驗稀釋濃度為 1∶200)4 μm/片，4 ℃過夜；每片加入二抗4 μm，室溫60 min溫室；DAB顯色5～10 min。各步驟間均用TBS緩沖液沖洗5 min×3次，蘇木素襯染，烤干、封片。

1.3 結(jié)果判斷

免疫組化結(jié)果由2位資深病理學(xué)專家參照Wachters等［7］的標(biāo)準(zhǔn)獨立判定，于400倍光鏡下觀察切片，對ALDH1、BCRP兩種蛋白的結(jié)果采用雙評分半定量積分法分析。陽性細胞的標(biāo)準(zhǔn)為出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒的細胞，ALDH1陽性部位在細胞質(zhì)，BCRP陽性部位在細胞質(zhì)及細胞膜。每張切片隨機選取5個高倍視野(×400)，每個高倍視野計數(shù)100個細胞，陽性細胞所占百分比評分：陽性細胞＜5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分；陽性強度評分：細胞無染色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分；將陽性細胞百分比和陽性強度兩項相乘，0分為(-)，1～4分為(+)，5～8分為(++)，≥9分為(+++)，(+～+++)樣本為表達陽性，(-)樣本為表達陰性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析。兩種蛋白的陽性表達率與臨床病理特征之間的差異用四格表資料的χ2檢驗；當(dāng)總例數(shù)≥40，同時單元格內(nèi)理論頻數(shù)均≥5時，采用四格表χ2檢驗；當(dāng)總例數(shù)≥40，但某一個單元格內(nèi)的理論頻數(shù)為1～5時，用連續(xù)性校正的χ2檢驗；當(dāng)總例數(shù)＜40，或者是某單元格內(nèi)的理論頻數(shù)＜1時，要用確切概率法。ALDH1與BCRP之間的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

要想推動校園足球穩(wěn)步發(fā)展，我們必須不斷強化校園足球課程意識，將建立機制與制定規(guī)劃相結(jié)合、改善條件和規(guī)范課程相結(jié)合、層級建隊與文化浸潤相結(jié)合，真正探索建立起一套管用、管長遠的工作機制。下面，以我校發(fā)展校園足球的做法為例，具體談?wù)勅绾伟l(fā)展校園足球。

2 結(jié) 果

2.1 ALDH1蛋白在乳腺癌及癌旁乳腺組織中的表達

細胞質(zhì)內(nèi)顆粒狀染色為棕黃、黃色或淺黃色即為ALDH1陽性表達的蛋白。51例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌組織中ALDH1蛋白呈陰性表達15例，ALDH1陽性表達為36例：(+)23例，(++)9例，(+++)4例，陽性表達率為70.6%，顯著高于癌旁乳腺組織中的表達(26.7%，圖1)。ALDH1蛋白在乳腺癌及癌旁乳腺組織中表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義性(χ2=14.685，P＜0.01，表1)。

圖1 ALDH1在乳腺癌組織和癌旁乳腺組織中的表達Fig. 1 Expression of ALDH1 in breast cancer and in surrounding breast tissues

表1 ALDH1蛋白在乳腺癌及癌旁乳腺組織中的表達Tab. 1 Expression of ALDH1 protein in breast cancer and surrounding breast tissues

2.2 ALDH1與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系

ALDH1蛋白的陽性表達與乳腺癌患者的年齡、月經(jīng)狀態(tài)、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級、病理分期(TNM分期)、激素受體狀況(ER、PR、HER-2)的表達無關(guān)(P＞0.05，表2)。

2.3 BCRP在乳腺癌及癌旁乳腺組織中的表達

BCRP蛋白在細胞膜和細胞質(zhì)中呈陽性表達的標(biāo)準(zhǔn)是：顆粒在細胞質(zhì)和細胞膜染色呈棕黃色(圖2)。在51例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌癌組織中，BCRP蛋白呈陰性表達15例，陽性表達36例：(+)24例，(++)11例，(+++)1例。51例乳腺癌癌組織中，BCRP蛋白的陽性表達率為70.6%，顯著高于癌旁乳腺組織中的表達(26.7%)，BCRP蛋白在乳腺癌及癌旁乳腺組織中表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=16.936，P=0.000，表3)。

2.4 BCRP與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系

BCRP蛋白的表達與HER-2高表達有關(guān)，而與乳腺癌患者的年齡、絕經(jīng)狀態(tài)、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、病理分期、激素受體狀況(ER、PR)的表達無關(guān)(P＞0.05，表4)

表2 ALDH1與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 2 The relationship between ALDH1 and the clinicopathological parameters[n(%)]

表3 BCRP在乳腺癌及癌旁乳腺組織中的表達Tab.3 Expression of BCRP protein in breast cancer and surrounding breast tissues

圖2 BCRP在乳腺癌組織和癌旁乳腺組織中的表達Fig. 2 Expression of BCRP in breast cancer and in surrounding breast tissues

表4 BCRP與各臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab. 4 The relationship between BCRP and the clinicopathological parameters[n(%)]

3 討 論

腫瘤干細胞學(xué)說認(rèn)為，腫瘤細胞中有一群少量的永生不死、不斷增殖、分化的細胞，即腫瘤干細胞［8-10］，其具有高致瘤性和自我更新、多向分化潛能、耐藥性等多種特性［11-14］。因而認(rèn)為腫瘤干細胞的存在是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的主要原因。Ginestier等［15］研究顯示，ALDH1陽性表達的乳腺癌細胞與激素受體狀況(HER-2過表達、ER-、PR-)、高組織學(xué)分級呈正相關(guān)，而與患者年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性；5年總體生存率結(jié)果顯示ALDH1陽性與較差的預(yù)后呈正相關(guān)，為獨立的預(yù)后因子。周凌等［16］通過92例乳腺癌組織的實驗也表明，ALDH1陽性與PR和HER-2有關(guān)，但與患者年齡、腫瘤大小、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。Ucar等［17］通過實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ALDH1陽性是乳腺癌生物學(xué)侵襲行為的顯型，與激素受體狀況(ER-、PR-、HER-2+)、Ki-67+和TOP2A+均呈正相關(guān)，而與患者其他臨床病理特征無明顯相關(guān)性。畢小愷等［18］研究發(fā)現(xiàn)，ALDH1陽性表達僅與HER-2+及術(shù)前接受化療有相關(guān)性，而與腫瘤分化程度等其他臨床病理特征無明顯關(guān)系。

BCRP蛋白在人體不同部位的正常組織中的表達不同，這支持了BCRP作為腫瘤有效標(biāo)志物的理論［19］。Ross等［20］的實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌和多發(fā)性骨髓瘤等耐藥細胞株中BCRP呈過度表達，而且BCRP的表達與P-gp/MRP等表達無明顯相關(guān)性。最近有研究證實BCRP在大多數(shù)實體腫瘤細胞膜表面存在不同程度的表達，且與其他已被廣泛認(rèn)可的耐藥蛋白(P-gp、LRP)表達不平行，所以針對BCRP的研究有很重要的臨床意義。在許多的實體瘤及血液系統(tǒng)腫瘤的細胞株中常常能分離出BCRP，但在患者的腫瘤標(biāo)本中乳腺癌耐藥蛋白BCRP的表達如何的報道較少。孫宇萍等［21］研究發(fā)現(xiàn)BCRP在腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者中的表達明顯高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在激素受體陽性者中的表達率明顯高于激素受體陰性者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這提示BCRP可能參與惡性腫瘤的生物學(xué)行為，與腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。Kanzaki等［4］和Ian等［5］研究報道BCRP表達與乳腺癌患者的年齡、病理分期、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、激素受體狀態(tài)等臨床病理特征等無明顯相關(guān)性。

本實驗通過免疫組化檢測方法探討乳腺癌中ALDH1、BCRP與臨床病理特征的關(guān)系及兩者表達之間的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ALDH1蛋白在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常乳腺組織。BCRP的表達與乳腺癌患者的HER-2高表達有關(guān)，與其他臨床病理特征之間無明顯相關(guān)性。ALDH1與BCRP之間不具有相關(guān)性；本實驗為從化療耐藥這一角度驗證了ALDH1可能是區(qū)別于其他耐藥蛋白的一種獨立的生物學(xué)因子，參與乳腺癌的化療耐藥或腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。

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Research of expression of aldehyde dehydrogenase 1 and breast cancer resistance protein and their correlation in breast cancer

WANG Xing1, JIANG Zhen1, SUN Chang-gang2(1.Department of Oncology, The People’s Hospital of Yucheng City, Dezhou Shandong 251200, China; 2.Weifang Institute of Traditional Chinese Medicine, Weifang Shandong 261041, China)

JIANG Zhen E-mail: dzjiangzhen@163.com

Background and purpose:Resistance to antitumor agents is a major cause of treatment failure in patients with breast cancer. Research has shown that, tumor stem cell marker aldehyde dehydrogenase 1 (ALDH1) is related with some anticancer drugs (such as cyclophosphamide, cisplatin) resistance, and the content of ALDH1 in tumor cells after treatment is higher than that before treatment. Breast cancer resistance protein (BCRP) is not expressed in normal tissues, but high expressed in breast cancer of after treatment, it may be associated with the mechanism of tumor drug resistance. This study was to investigate the correlation between expression and the relationship between these two kinds of protein ALDH1, BCRP and clinical pathological characteristics.Methods:Immunohistochemistry was performed to detect the expression of ALDH1 and BCRP in breast in fi ltrating ductal carcinoma tissues, and whether there is a correlation between and explore their relationship with clinical pathological features and their expression.Results:The expression of ALDH1 protein and BCRP protein in breast cancer and paracarcinoma breast tissues has signi fi cant difference(χ2=14.685, P=0.000; χ2=12.243, P=0.000).The expression of ALDH1 with patients age, pathologicstage, axillary lymph node metastasis, histological grading, ER, PR, and HER-2 state were not relevant(P＞0.05). HER-2, BCRP protein, expression was higher in cancer tissue (χ2=5.289, P=0.021). There were no relevant with the expression of BCRP with patients age, pathologic stage, axillary lymph node metastasis and histological grading, estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), human epidermal growth factor receptor (HER-2) (P＞0.05).Conclusion:ALDH1 proteins may be an independent factor compared with occur drug resistant protein, and participate breast cancer drug resistance in the chemotherapy and tumor invasion and metastasis of malignant biological behavior.

Breast in fi ltrating ductal carcinoma; Breast cancer resistance protein; Aldehyde dehydrogenase 1; Immunohistochemistry.

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.03.004

R737.9

A

1007-3639(2014)03-0175-07

2013-11-22

2014-02-26）

國家自然科學(xué)基金項目(No：81273987)。

姜真 E-mail:dzjiangzhen@163.com