趙瑾 韓立杰 趙悅 杜鵑 王明 高雅麗 李興德

1.滄州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 滄州 061000；2.滄州市中心醫(yī)院放療科，河北 滄州 061000

沙利度胺聯(lián)合放射治療對結(jié)腸癌小鼠移植瘤生長及放射敏感性的影響

趙瑾1 韓立杰2 趙悅2 杜鵑2 王明2 高雅麗2 李興德2

1.滄州市中心醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河北 滄州 061000；2.滄州市中心醫(yī)院放療科，河北 滄州 061000

背景與目的：沙利度胺能有效增強腫瘤對放射的敏感性，但作用機制尚不清楚。本研究探討沙利度胺對人結(jié)腸癌小鼠移植瘤放射敏感性的影響，并探討其協(xié)同抑制效應(yīng)的機制。方法：建立colon26結(jié)腸癌移植瘤模型，將32只小鼠隨機分為對照組；單純沙利度胺組(T組)；單純放療組(R組)；沙利度胺+放療組(T+R組)；從治療當(dāng)天開始，隔日測量腫瘤體積，繪制腫瘤生長曲線,治療結(jié)束時測量腫瘤體積，計算抑瘤率，處死小鼠后剝離瘤體，采用免疫組化法測定各組腫瘤組織微血管密度(microvessel density，MVD)。結(jié)果：治療第22天，對照組、T組、R組和T+R組移植瘤平均體積分別為(4.97±1.20)cm3、(2.90±0.92)cm3、(2.66±0.88)cm3和(1.89±0.76)cm3；腫瘤生長抑制率分別為41.7%、46.5%和61.9%，T+R組移植腫瘤抑瘤率明顯高于其他各組(P＜0.05)；與R組比較，T+R組的放射增敏率為2.27；沙利度胺聯(lián)合放射治療能顯著抑制腫瘤組織MVD生成：T+R組的平均MVD較對照組下降了46.8%，下降程度明顯高于T組(40.7%)和R組(37.7%，P＜0.05)；且T+R組腫瘤組織中出現(xiàn)較多的壞死，壞死細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(P＜0.05)。結(jié)論：沙利度胺可以增強結(jié)腸癌小鼠移植瘤的放射敏感性，其機制可能與抑制移植瘤血管的生成有關(guān)。

沙利度胺；放射增敏；微血管密度；移植瘤

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤，隨著居民生活水平的不斷提高，其發(fā)病率逐年上升。Esteves等［1］研究認(rèn)為以手術(shù)為主的結(jié)直腸癌，術(shù)后2年內(nèi)局部復(fù)發(fā)率高達80%，手術(shù)、放療和化療已成為結(jié)直腸癌治療的三大支柱。目前放療是結(jié)直腸癌的重要輔助治療手段，然而，腫瘤細(xì)胞本身對放療的敏感性較差。因此，尋找一種放射增敏劑是當(dāng)前研究的熱點。Yu等［2］在體外實驗證實，沙利度胺提高人食管癌細(xì)胞的放射敏感性與VEGF有關(guān)。但尚未見沙利度胺與結(jié)直腸癌放療敏感性的研究。本研究利用colon26結(jié)腸癌小鼠移植瘤模型，從腫瘤血管形成的角度初步探討其抗腫瘤機制，觀察沙利度胺放射增敏作用。

1 材料和方法

1.1 主要藥物和試劑

沙利度胺為Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI-1640培養(yǎng)基為美國GIBCO公司產(chǎn)品；CD34大鼠抗小鼠IgG單克隆抗體購于upstate公司。

1.2 主要設(shè)備儀器

放射治療設(shè)備為德國西門子公司生產(chǎn)的PRIMUS-H型醫(yī)用電子直線加速器(由河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院提供)，配有電動多葉光柵(multileaf collimator，MLC)；凈化工作臺購自美國ChemFocus公司(NO400-400E型)；電子天平購自瑞士Metter公司(AE100型)；倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司；EC-200型游標(biāo)卡尺購自成都量具刃具股份有限公司。

1.3 實驗動物與細(xì)胞株

健康雄性BALB/c小鼠32只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，通過河北省實驗動物中心購買，實驗動物合格證編號：806114。小鼠結(jié)腸腺癌colon26細(xì)胞系由河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心提供。

1.4 小鼠結(jié)腸癌移植瘤模型建立

將colon26細(xì)胞體外培養(yǎng)至指數(shù)生長期，制備colon26單細(xì)胞懸液進行動物接種，取0.2 mL細(xì)胞懸液(約含瘤細(xì)胞1×106)，注射于小鼠前腿皮下，共接種32只，成瘤率100%，建立小鼠移植瘤模型，進行抑瘤作用的檢測。

1.5 動物的分組及處理方法

①實驗分組、給藥和照射方法：接種后1周將32只小鼠隨機分至對照組、單純放療組(R組)、沙利度胺組(T組)和沙利度胺聯(lián)合放療組(T+R組)，每組8只；對照組用0.9%NaCl溶液0.3 mL灌胃，每天1次，沙利度胺組按每天200 mg/kg計算，用0.9%NaCl溶液溶解灌胃；照射時小鼠在非麻醉狀態(tài)下捆綁固定，用6MVX線2 cm×2 cm射野，SSD=100 cm，照射劑量為8 Gy，劑量輸出率300 MU/min。②腫瘤生長曲線：治療后隔日測量腫瘤長徑(a)和與其垂直短徑(b)，腫瘤體積大小的估算公式采用ab2/2，以腫瘤生長時間為橫坐標(biāo)，腫瘤平均體積為縱坐標(biāo)，繪制腫瘤生長曲線；依據(jù)腫瘤體積按如下公式計算腫瘤生長抑制率，腫瘤生長抑制率＝(1-實驗組平均瘤體積/對照組平均瘤體積)×100%。飼養(yǎng)至第22天脫頸椎處死小鼠，剝離腫瘤置于4%中性甲醛中固定。③腫瘤生長延遲(tumor growth delay，TGD)時間及放射增敏比(sensitization enhancement ratio，SER)：各實驗組腫瘤體積增長至實驗開始時體積的5倍所需時間與對照組腫瘤所需時間的差為該組TGD時間；T+R組TGD時間與R組的TGD比為該藥物方式對照射的SER［3］。

1.6 腫瘤細(xì)胞壞死程度判斷

每張切片先在低倍鏡(×100)下觀察整體染色情況，后用高倍鏡(×200)觀察切片的10個視野，每個視野計數(shù)100個瘤細(xì)胞中的壞死細(xì)胞數(shù)，取其均數(shù)代表腫瘤組織中的壞死水平。

1.7 免疫組化技術(shù)檢測微血管密度(microvessel density，MVD)

CD34染色標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，以見到染黃色至棕色為陽性標(biāo)準(zhǔn)；任何被抗體染色的單個內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞團，不管是否形成官腔，只要與周圍微血管、腫瘤細(xì)胞和其他連接組織有清楚界限，都認(rèn)為是一個可計數(shù)的微血管，計數(shù)過程參照Veidner評價方法［4］：先在低倍鏡下(×40)掃描整個切片，尋找“熱點”—血管密度區(qū)，再在高倍鏡下(×200)下計數(shù)染成棕黃色的血管數(shù)目，結(jié)果用5個200倍視野下血管數(shù)目的平均數(shù)表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各實驗組對colon26結(jié)腸癌小鼠移植瘤生長的影響

治療前各組colon26結(jié)腸癌移植瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨著治療時間的推移，腫瘤體積逐漸增大，對照組移植瘤平均體積明顯大于各實驗組(P＜0.05，圖1)，其中T+R組移植瘤生長最緩慢，腫瘤生長曲線最平緩。與對照組比較，T+R組、R組移植瘤體積增長到實驗開始5倍的TCD分別為5.9和2.6 d，SER為2.27，即T+R組的放射增敏比是R組的2.27倍。

治療第22天，各實驗組與對照組移植瘤體積均數(shù)相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=33.35， P＜0.05，表1)；與對照組比較，T組、R組和T+R組的抑瘤率分別為41.7%、46.5%和61.9%。

圖1 各組移植瘤生長曲線圖Fig. 1 The growth curve of xenograft in each group

表1 各組腫瘤體積和腫瘤生長抑制率Tab. 1 Tumor volumes and inhibitory rate of tumor growth in different groups

2.2 光鏡下腫瘤組織的病理形態(tài)

治療結(jié)束后處死小鼠，常規(guī)病理蘇木精-伊紅(HE)染色，對照組腫瘤細(xì)胞生長旺盛(圖2A)，成片狀分布，少見腫瘤壞死區(qū)；T組腫瘤細(xì)胞體積較小，核致密，染色質(zhì)濃縮邊集(圖2B)，個別瘤細(xì)胞核斷裂形成大小不等的細(xì)胞核小體；R組可見較多的腫瘤壞死區(qū)和極少量的組織濃染區(qū)，組織內(nèi)存在一些異常的腫瘤細(xì)胞，這些細(xì)胞在正常的腫瘤細(xì)胞之間呈小的巢狀分布，細(xì)胞核濃染、壞死、固縮(圖2C)。T+R組可見大片腫瘤壞死區(qū)域，幾乎見不到正常的腫瘤細(xì)胞，只有在腫塊的外周區(qū)域可見少量的腫瘤細(xì)胞(圖2D)。

2.3 對MVD表達的影響

CD34標(biāo)記的小鼠移植瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為棕黃色。對照組MVD數(shù)量最多，分布最密集；T+R組MVD數(shù)量最低，壞死區(qū)所占比例大，移植瘤組織內(nèi)MVD表達明顯少于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖3，表2)。

圖2 顯微鏡觀察各組組織學(xué)形態(tài)Fig. 2 Morphological features of tumor tissue by microscope(×200)

圖3 各組移植瘤中MVD的表達Fig. 3 The expression of MVD in each group(×200)

表2 各組中MVD和壞死細(xì)胞計數(shù)Tab. 2 The MVD and necrosis cells in different groups()

表2 各組中MVD和壞死細(xì)胞計數(shù)Tab. 2 The MVD and necrosis cells in different groups()

Group MVD Necrosis cells Control 36.57±10.24 46.78±9.44 Radiation 22.76±10.98 59.66±6.77 Thalidomide 21.67±9.30 60.92±5.11 T+R 19.47±10.60 63.45±6.24

3 討 論

沙利度胺又名反應(yīng)停，為谷氨酸衍生物，屬于非巴比妥類鎮(zhèn)靜催眠藥。近年來的基礎(chǔ)與臨床研究發(fā)現(xiàn)，沙利度胺可以通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)分泌，實現(xiàn)抗血管生成的特性；調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能和增強自然殺傷細(xì)胞的活性，改善機體免疫功能，發(fā)揮其抗腫瘤的活性［5-6］?？鼓[瘤血管生成是一種新的針對腫瘤新生血管網(wǎng)絡(luò)的治療方法, 近年來通過與放射治療聯(lián)合, 取得了較好的療效［7-8］。目前，應(yīng)用于臨床特異性的抗血管生成藥物有貝伐單抗、恩度等，但因其價格昂貴，難以廣泛應(yīng)用于臨床。而沙利度胺作為一種廉價的抗血管生成藥物，是人們用得起的抗血管生成藥物，本研究從腫瘤血管形成的角度初步探討其放療增敏機制。

MVD被公認(rèn)為最理想的反映腫瘤血管生成情況的指標(biāo)，其利用針對血管內(nèi)皮細(xì)胞抗原的免疫組化技術(shù)對腫瘤血管進行定量，可直接量化反映腫瘤血管生成的程度。MVD的高低不僅與腫瘤惡性程度、侵襲性、腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移及腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)［9］，而且與放射敏感性關(guān)系最為密切，高MVD比低MVD者放射敏感性好［10］。因此本研究選擇了MVD為主要研究目標(biāo)，作為判斷結(jié)腸癌放射敏感性的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，沙利度胺聯(lián)合放療能明顯抑制結(jié)腸癌移植瘤生長，對腫瘤的抑制作用明顯優(yōu)于單純沙利度胺或單純放射治療，在抑瘤率稍低于周菊英等［11］的報道。其原因可能與實驗選擇的藥物及細(xì)胞本身對放射敏感性程度有關(guān)，但仍能提示放射聯(lián)合沙利度胺可獲得更好的腫瘤控制率。實驗中我們還觀察到T+R組抑制移植瘤生長的作用明顯強于R組或T組，而不是兩單純組作用效果的簡單相加，其原因為腫瘤形成過程是一個復(fù)雜的過程，有多種因素及機制參與，需進一步探討和研究。

本研究結(jié)果顯示，T+R組MVD明顯低于對照組、R組和T組。提示沙利度胺聯(lián)合放療可有效抑制colon26結(jié)腸癌小鼠移植瘤的血管生成。這種現(xiàn)象可能除了放射線直接殺死部分腫瘤細(xì)胞，減少腫瘤組織MVD表達以外，還可能與Ansiaux等［12］提出沙利度胺具有改善腫瘤紊亂的血管網(wǎng)，使之結(jié)構(gòu)、功能趨于正?；?，從而改善腫瘤組織的微循環(huán)，提高腫瘤組織氧分壓和血流灌注，降低腫瘤間質(zhì)壓，提高了放療療效有關(guān)。

本研究采用單次8 Gy放療劑量，主要考慮更低劑量不一定能對移植瘤產(chǎn)生明確的抑制效果，而更高的劑量必然延長實驗照射次數(shù)，增加實驗難度；同時，更高的照射劑量可能掩蓋沙利度胺的療效，反而不利于實驗觀察。

本研究證實了沙利度胺聯(lián)合放療能夠顯著提高colon26結(jié)腸癌小鼠移植瘤的放射敏感性，其機制可能與降低腫瘤組織中MVD的陽性表達有關(guān)，這為臨床綜合治療提供了一條新思路。

［1］ESTEVES F P, SCHUSTER D M, HALKAR R K.Gastrointestinal tract malignancies and positron emission tomography: an review［J］. Semin Nucl Med, 2006, 36(2): 169-181.

［2］YU J, LIU F, SUN Z, et al. The enhancement of radiosensitivity in human esophageal carcinoma cells by thalidomide and its potential mechanism［J］. Cancer Biother Radiopharm, 2011, 26(2): 219-227.

［3］孫明霞, 李洪振, 高獻書, 等. 順鉑和洛鉑與放射聯(lián)合對小鼠肺癌移植瘤生長的影響［J］. 中華放射腫瘤學(xué)雜志, 2011, 20(4): 351-354.

［4］WEIDNER N, SEMPLE J P, WELCH W R, et al. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma［J］．N Engl J Med, 199, 324(1): 1-8.

［5］DAVIS M, LASHEEN W, WALSH D, et al. A phaseⅡ dose titration study of thalidomide for cancer-associated［J］. J Pain Symptom Manage, 2012, 43(1): 78-86.

［6］UACH H, RITCHIE D, STEWART A K, et al. Mechanism of action of immunomodulatory drugs (IMiDs) in multiple myeloma ［J］. Leukemia, 2010, 24(1): 22-32.

［7］孫志強, 于靜萍, 張志明, 等. 重組人血管內(nèi)皮抑素對食管癌細(xì)胞的放射增敏作用及其機制［J］. 中華放射醫(yī)學(xué)與防護雜志, 2013, 33(4): 346-350.

［8］楊東紅, 余忠華, 王鎮(zhèn)南, 等. 西妥西單抗聯(lián)合放療對鼻咽癌細(xì)胞凋亡影響的研究［J］. 中華腫瘤防治雜志, 2012, 19(14): 1053-1056.

［9］CHEN J, SHAO S, NAKADAL K. Dominant-negative hypoxia inducible factor-1 alpha reduces tumorigenicity of pan creatic cancer cells through the suppression of glucoise metabolism［J］. Am J Pathol, 2003, 162(4): 1283-1291.

［10］YIM S F, LOK I H, CHEUNG L P, et al. Dose-finding study for the use of long-acting gonadotrophin-releasing hormone analogues prior to ovarian stimulation for IVF ［J］. Hum Reprod, 2001, 16(3): 492-494.

［11］周菊英, 尹預(yù)真, 徐曉婷, 等. 重組人血管內(nèi)皮抑素對鼻咽癌細(xì)胞系及裸鼠移植瘤的放射增敏研究［J］. 中華放射腫瘤學(xué)雜志, 2011, 20(2): 121-122.

［12］ANSIAUX R, BAUDELET C, JORDAN B F, et al. Thalidomide radiosensitizes tumors through early changes in the tumor microenvironment［J］. Clin Cancer Res, 2005, 11(2Pt1): 743-750.

The effect of thalidomide combined with radiation therapy on growth and radiosensization on xenograft tumor of colonic carcinoma

ZHAO Jin1, HAN Li-jie2, ZHAO Yue2, DU Juan2, WANG Ming2, GAO Ya-li2, LI Xing-de2(1.Department of Medical Oncology, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou Hebei 061000, China; 2.Department of Radiation Oncology, Cangzhou Central Hospital, Cangzhou Hebei 061000, China)

LI Xing-de E-mail: lixingde@126.com

Background and purpose:Thalidomide can enhance the radiation sensitivity on tumor effectively, but the mechanism of radiosensitization is still unclear. The present study aimed to investigate whether thalidomide could enhance the radiation sensitivity on colon cancer transplanted tumor of mouse, and to investigate the underlying mechanism.Methods:We established the model of colon26 colonic carcinoma, and the mice were divided into 4 groups: Control group, the thalidomide group, the radiotherapy group and thalidomide+radiotherapy group. From the day of treatment, tumors were measured every other day. Then, the xenograft tumor growth curve was depicted. Tumor volumes were measured in different treatment groups, then, the inhibitory rates of tumor growth were calcutated. Using immunohistochemical method in to detect the expression of microvessel density (MVD) in tumor tissue.Results:The mean tumor volumes at day 22 were (4.97±1.20)cm3(control group), (2.90±0.92)cm3(T group), (2.66±0.88)cm3(R group), and (1.89±0.76)cm3(T+R group). The tumor inhibition rate in the combination group (61.9%) was signi fi cantly higher than the other groups (41.7%, 46.5%, P＜0.05). The radiotherapy sensitization enhancement ratio of the combined treatment group was 2.27 times than in the radiotherapy group. Thalidomide combined with radiation therapy can significantly inhibit microvessel density of tumor: The decreasing MVD of T+R group, T group and R groupwere respectively 46.8%, 40.7% and 37.7%, and there was statistical significance between T+R group and T group (P＜0.05 ), so as between T+R group and R group. It could be found more necrotic cells in tumor of group, and there was statistical signi fi cance between T+R group and control group (P＜0.05).Conclusion:Thalidomide can enhance the radiosensitivity mice of colonic carcinoma, and its mechanism may be related to the inhibition of tumor angiogenesis related.

Thalidomide; Radiosensitization; MVD; Xenograft tumor

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.03.003

R735.3+5

A

1007-3639(2014)03-0170-05

2013-12-07

2014-01-24）

李興德 E-mail:lixingde@126.com